Ei micro-injectie en efficiënte paring voor genoombewerking in de Firebrat Thermobia domestica

Omdat Thermobia domestica een basaal insect is, zullen genetische studies op deze soort mechanismen verlichten die ten grondslag liggen aan de evolutie van belangrijke innovaties bij insecten, zoals gemotoriseerde vlucht en metamorfose. Dit protocol behandelt basistechnieken van kweekonderhoud tot ei-microinjectie om Thermobia als laboratoriummodelsoort te implementeren. Deze methode kan ook worden gebruikt voor toepassing van andere genetische tools zoals RNI-gemedieerde gen-knockdown en transgenese in thermobia.

Houd wildtype- en mutante populaties in een grote plastic container met regelmatig kunstmatig visvoer, water in plastic bekers met een ventilatiegat bovenop, een gevouwen papier om de insecten te verbergen en gelaagd katoen om eieren te leggen. Houd alle T.domestica-culturen in incubators van 37 graden Celsius en stel de relatieve luchtvochtigheid in elke container in op 60 tot 80% Om de eicollectinekolonies voor te bereiden, brengt u ongeveer 20 mannelijke en 20 vrouwelijke volwassenen over naar een middelgrote container met voedsel, een watervoorziening, een gevouwen papier en een klein stuktje gelaagd katoen voor het leggen van eieren. Zet verschillende kolonies op om binnen een korte tijdsperiode een groot aantal gestage embryo's te verkrijgen.

Vervang op de dag van injectie het katoen in de containers door nieuw katoen. Verzamel acht uur later de eieren uit het gelaagde katoen door de lagen met behulp van een pincet te scheiden. Lijn de eieren uit op het dubbelzijdige plakband met een natte verfkwast met een afstand van twee millimeter tussen de eieren.

Alle eieren moeten zo worden georiënteerd dat de longitudinale as van een ei naar de injectiezijde is gericht. Druk de eieren voorzichtig met een verfkwast naar beneden voor een stevige greep tijdens de injectie. Laad twee microliters van de gRNA CAS9-oplossing in een glazen injectiecapillair met een micro-lader.

Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de oplossing zitten voor de injectie. Klop eventueel op de naald om de bellen te verwijderen. Optimaliseer de vorm van de naaldpunt door deze lichtjes met een pincet te breken om verstopping te voorkomen en om een betere duurzaamheid gedurende een reeks injecties te krijgen.

Steek de naald in het midden van de longitudinale as van een ei en injecteer een kleine hoeveelheid van de oplossing. Pas de configuratie van de elektronische micro-injector aan tijdens de injectie, afhankelijk van de vorm van de naaldpunt. Bewaar de geïnjecteerde eieren in een container van gepaste grootte met 60 tot 80% relatieve vochtigheid bij 37 graden Celsius.

Controleer de geïnjecteerde eieren regelmatig en gooi beschadigde eieren weg om schimmelgroei te voorkomen. Als er te veel schimmel op een ei groeit, maak dan het oppervlak van het ei schoon met 70% ethanol. Voor het uitkomen doopt u het glazen plaatje met de geïnjecteerde eieren in talkpoeder om het oppervlak van het dubbelzijdige plakband te coaten.

Dit voorkomt het stapelen van uitgekomen nimfen. Breng de met poeder gecoate glazen platen over naar een middelgrote container met voedsel, water en een gevouwen papier. Isoleer G1-nimfen in 24-wellplaten met een aspirator of een verfkwast.

Zorg voor een regelmatige aanvoer van kunstmatig visvoer. Plaats de 24-wellplaten in een grotere container met een watervoorziening voor een vochtigheid van 60 tot 80% Knijp en trek een cercus van een nimfe of volwassene met behulp van een pincet en verzamel ze in een 0,2 milliliterbuisje met 50 microliter ethanol. Bewaar de verzamelde monsters op min 20 graden Celsius voor langdurige opslag.

Plaats monsters in buisjes met open deksels gedurende 15 minuten op een thermisch blok bij 70 graden Celsius om het ethanol te laten verdampen. Injectie van gRNA CAS9-ribonucleoproteïnekompleks in embryo's binnen de eerste acht uur na het leggen van de eieren resulteert in indels op de gRNA-doelsite. Dit veroorzaakt biallelische mutaties in sommige cellen van de geïnjecteerde generatie en meestal worden mutante mozaïekfenotypen verkregen.

Toen dit protocol werd gebruikt om een gRNA te injecteren die was ontworpen om het witte gen te targeten, vertoonde 32,6% van de G0-nimfen een gedeeltelijke verlies van pigmentatie in hun samengestelde ogen en dorsale gebieden. Beoordeling van de kiemlijntransformatie van G0-volwassenen en gemuteerde G1-individuen werd gedaan door genomische PCR gevolgd door een hetero duplex-mobiliteitsassay. In G1-monsters zijn differentiële bandpatronen tussen wildtype- en gemuteerde monsters duidelijk onderscheidbaar.

Genoombewerking in Thermobia biedt een solide aanpak om genetische mechanismen te analyseren die ten grondslag liggen aan voortijdige eigenschappen van insecten. Het helpt om de geheimen achter hun uitmuntende succes en het onze te ontdekken.