Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Dit protocol kan hoge doorvoermetingen van cellulaire elektrofysiologie leveren op een manier die past bij de snel ontwikkelende technologie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten. Het grote voordeel van deze techniek is dat het minder complex en minder arbeidsintensief is dan de traditionele patch clamp-techniek, maar toch in staat is om gelijkwaardige resultaten te produceren. Dit protocol kan dus worden uitgebreid voor grootschalige toxiciteitsscreeningsprogramma's met behulp van humane geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten.

Bijvoorbeeld, de uitgebreide in vitro proarrythmie assay. Om geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten culturen voor het experiment voor te bereiden, bekleed eerst individuele ronde glazen dekseltjes van 10 millimeter met 150 microliter van 1:60 basement membraan matrix in elk putje van een 24-putjesplaat, en incubeer de dekseltjes gedurende vier uur op vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, verwijder het overtollige matrix van de dekseltjes en breng het juiste volume cellen toe op elk deksel.

Na een uur bij 37 graden Celsius, vul elk putje voorzichtig met plateermedium en breng de plaat terug naar de incubator. Om voor te bereiden op voltage-gevoelige kleurstofbeeldvorming, rust een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop uit met een lens met 40x vergroting en hoge numerieke apertuur, en koppel een snel schakelende warm witte LED aan de getransmitteerde verlichtingspoort. Plaats een eenvoudige rode 660 nanometer filter in de getransmitteerde lichtbaan en monteer een snel schakelende 470 nanometer LED-kop voor fotometrieregistratie.

Plaats een 470/40 excitatiefilter op de epifluorescentiepoort om het licht dat door de LED wordt gegenereerd op te schonen, en plaats een microscoopkubus met een 495 nanometer long pass stralingsdeler in de spiegeleenheidscarooselle binnen de microscoop. Pas een detectiearm met een verstelbare velddiafragma toe op de C-mountpoort om selectie van het gebied van belang mogelijk te maken, en koppel een PMT-detector en een USB-camera aan de microscoop. Plaats een filterkubus met een 565 nanometer long pass stralingsdeler en een 535/50 emissiefilter in de PMT-poort om het emissielicht te splitsen tussen de twee detectoren.

Koppel de PMT aan een voeding en een PMT-versterker, en sluit de PMT-versterkeruitgang aan op een analoge ingangspen van een data-acquisitiesysteem. Om aan de Nyquist-criteria te voldoen en aliasing te voorkomen, filter de analoge gegevens van de PMT bij één kilohertz of hoger, en digitaliseer de gegevens met een frequentie die minstens tweemaal zo hoog is als de hoogste frequentie die in het analoge signaal aanwezig is. Om de cellen te laden met voltage-gevoelige kleurstof, meng vijf microliter van 1000x FluoVolt en 50 microliter van power load-oplossing, en voeg drie microliter van de resulterende laadoplossing toe aan drie milliliter van opgewarmde Tyrode-oplossing in een petrischaal.

Voeg een enkele geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten gecoate deksel toe aan de schotel en plaats de schotel op 37 graden Celsius gedurende 20 minuten. Monteer een verwarmde live celbeeldvormingskamer op de microscooptafel en vul de kamer met 500 microliter van verse Tyrode-oplossing. Was vervolgens de deksel met verse Tyrode-oplossing op 37 graden Celsius en gebruik fijne pincet om de deksel voorzichtig over te brengen naar de voorverwarmde badkamer.

Om de cellulaire dynamica en experimentele parameters te standaardiseren, plaats twee platina elektroden in de kamer, met een afstand van vijf millimeter, en verbind de elektroden met een externe stimulator. Stel de stimulator in op bipolaire veldpulsen van vijf milliseconden bij 0,5 hertz, en verhoog het stimulus van één volt totdat de cellen beginnen te samentrekken. Stel vervolgens de spanning in op ongeveer 25% boven dit drempelwaarde.

Voor optische actiepotentiaalregistratie, gebruik de getransmitteerde lichtbaan en de USB-camera om de myocyten onder helderveldcondities te visualiseren. Selecteer een geïsoleerde cel en gebruik de velddiafragma om zijn optische baan strak af te snijden, zodat ervoor wordt gezorgd dat alleen licht van de cel van belang wordt gemonitord. Activeer de PMT-versterker, en stel de PMT-voeding in op 750 volt.

Voer het stimulatieprotocol uit samen met de acquisitiesoftware terwijl tegelijkertijd het 470 nanometer excitatielicht wordt geactiveerd. Neem 10 sweeps op, zorg ervoor dat stabiele actiepotentialen worden gedetecteerd. Na de laatste sweep, verplaats onmiddellijk de microscooptafel terwijl nog steeds wordt opgenomen om kortstondig achtergrondsignaal te verkrijgen van een gebied zonder cellen en schakel het excitatielicht uit.

Om de actiepotentiaalgegevens te analyseren, open een opgeslagen opname in de juiste analysesoftware en gemiddel 10 sweeps met gestimuleerde actiepotentialen van een enkele cel. Trek het gemiddelde van het basislijnsignaal dat de fluorescentie offset vertegenwoordigt af van het gemiddelde spoor, en gebruik vervolgens de formule om de verandering in fluorescentie te berekenen met behulp van diastolische fluorescentie als F0. Identificeer de diastolische en actiepotentiaalgebieden van belang en meet de gewenste hartactiepotentiaalparameters, inclusief, maar niet beperkt tot, de duur bij 50% en 90% repolarisatie. Exporteer vervolgens de gegevens van deze enkele cel naar een spreadsheetprogramma.

Deze methode maakt snelle en nauwkeurige kwantificering van repolarisatie mechanica mogelijk, wat waardevolle inzichten kan opleveren in cellulaire ionische abnormaliteiten. Uitgesproken fase één kenmerken kunnen worden waargenomen in optische signalen van muis cardiomyocyten, die morfologisch verschillen van die van humane geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten. Bovendien zijn humane geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten responsief op farmacologische manipulatie met nifedipine, een bekende L-type calciumkanaal antagonist.

Tijdens continue toediening van het medicijn werd een 41,5% afname in actiepotentiaalduur bij 90% repolarisatie waargenomen, wat de functionaliteit van fluorescente voltage indicator-gebaseerde beeldvorming suggereert als een platform voor prospectieve hoge doorvoer hartmedicijnscreeningsstudies. Het is belangrijk om in gedachten te houden dat hoewel de voltage