Name: Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Leer optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten met een modulair fotometriesysteem. Deze methode vereenvoudigt elektrofysiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Cairn Research Ltd. bedanken voor hun vriendelijke financiële bijdrage die de productiekosten van deze publicatie dekte. Daarnaast bedanken we mevrouw Ines Mueller en mevrouw Stefanie Kestel voor hun uitstekende technische ondersteuning.
Het onderzoek van de auteurs wordt ondersteund door het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek (DZHK), de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 en in het kader van de Duitse Excellence Strategy - EXC 2067/1- 390729940) en de Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).

1. Cellulaire preparaten
OPMERKING: Menselijke iPSC's die in dit protocol worden gebruikt, zijn afgeleid van gezonde donoren en gedifferentieerd in monolagen met behulp van volledig gedefinieerde kleine molecuulmodulatie van WNT-signalerings- en lactaatzuiveringstechnieken zoals eerder beschreven12,13,14. iPSC-CMs werden om de 2-3 dagen onderhouden met een kweekmedium dat hieronder wordt beschreven.
<ol><li>Bereid een kweekmedium van basaal medium (RPMI 1640) en 2% supplement (B27). Bewaren bij 4 °C. Gebruik bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Bereid een platingmedium van basaal medium (RPMI 1640), 2% supplement (B27) en 1:2000 ROCK-remmer. Bewaren bij 4 °C. Te gebruiken bij RT.</li>
	<li>Coat gesteriliseerde 10 mm ronde glas #0 coverslips met 150 μL van 1:60 factorvrije keldermembraanmatrix en incubeer bij 4 °C gedurende 4 uur. OPMERKING: Optimalisatie van het afdekvolume is noodzakelijk om ervoor te zorgen dat het hele glas wordt bedekt met behoud van voldoende oppervlaktespanning om morsen te voorkomen. 150 μL wordt aanbevolen voor ronde afdeksels van 10 mm. Batchgrootte, coverslip-type, coverslipvolume en kweekplaattype kunnen worden aangepast aan de behoeften van de experimentatoren.</li>
	<li>Begin met iPSC-CM-dissociatie met een op EDTA gebaseerd celdissociatiereagens. Zorg ervoor dat de monolaag volledig wordt losgemaakt door voorzichtig te spoelen met een pipet van 1.000 μL.</li>
	<li>Breng de cellulaire suspensie over in een buis van 15 ml en voeg dubbel volume plating medium toe. Centrifugeer gedurende 10 min bij 100 x g.</li>
	<li>Resuspend de pellet met een gewenst volume (resuspensievolume) van het beplatingsmedium. Tel cellen handmatig of elektronisch.</li>
	<li>Selecteer de optimale dichtheid per coverslip (15.000) die de geïsoleerde cellulaire analyse later mogelijk maakt.</li>
	<li>Bereken het volume 'actieve' cellulaire suspensie (A) dat nodig is om alle coverslips op deze gewenste dichtheid te platen. Pas de volgende formule toe en trek terug in een aparte buis: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ01v2.jpg">
</li>
	<li>Bereken het volume extra beplatingsmedium (B) dat nodig is om elke afdekplaat op een gewenst volume te accommoderen. Pas de volgende formule toe en voeg het resulterende volume toe aan de buis van actieve suspensie: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ02v2.jpg">
</li>
	<li>Verwijder de matrix van coverslips en breng het 'coverslip volume' van celsuspensie (A+B) aan op elke coverslip. Regelmatig resuspend in de buis om een gelijkmatige cellulaire verdeling te garanderen.</li>
	<li>Incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur. Vul de put voorzichtig met beplatingsmedium.</li>
	<li>Wissel na 24 uur media uit met een normaal kweekmedium en onderhoud elke 2-3 dagen.</li>
</ol>2. Experimentele opstelling
<ol><li>Rust een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop uit met een 40x vergrotingslens met hoog numeriek diafragma (N.A: > 0,75) om experimenten uit te voeren.</li>
	<li>Koppel een snel schakelende warmwitte LED aan de verzonden verlichtingspoort van de microscoop. Plaats een eenvoudig rood 660 nm-filter in het doorlatende lichtpad. OPMERKING: Dit licht kan tijdens fotometrie-experimenten worden geactiveerd om het monster te observeren zonder het groene fluorescerende signaal te vervuilen.</li>
	<li>Monteer een snel schakelende 470 nm LED-kop voor fotometrie-opname. Plaats een 470/40 excitatiefilter in de epifluorescente poort van de microscoop om het licht dat door de LED wordt gegenereerd op te ruimen. OPMERKING: Voor een optimale signaalkwantificering wordt een verlichtingssysteem met hoge snelheidsfeedbackregeling van de optische uitgang aanbevolen.</li>
	<li>Plaats een microscoopkubus met een 495 nm lange pass beam splitter in de carrousel van de spiegeleenheid in de microscoop.</li>
	<li>Monteer een detectiearm met een verstelbaar veldmembraan op de C-mount-poort van de microscoop om het interessante gebied te kunnen selecteren.</li>
	<li>Koppel afzonderlijk een fotomultiplicatordetector (PMT) en een USB-camera aan de microscoop. Dit zal de basis vormen van het emissiedetectiesysteem.</li>
	<li>Plaats een filterkubus met een 565 nm lange pass beam splitter en een 535/50 emissiefilter in de PMT-poort. Dit verdeelt het emissielicht tussen de twee detectoren. OPMERKING: Een camera die is aangesloten op de verzonden poort van het emissiedetectiesysteem kan tijdens alle experimenten doorschijnend licht onder helder veld detecteren.</li>
	<li>Koppel de PMT aan een voeding en een PMT-versterker. Sluit de PMT-versterkeruitgang aan op een analoge ingangspin van een data-acquisitiesysteem.</li>
	<li>Filter analoge gegevens van de PMT op 1 kHz of hoger.</li>
	<li>Digitaliseer gegevens met een frequentie die minstens het dubbele is van de hoogste frequentie die aanwezig is in analoog signaal (2 kHz of hoger) om aan nyquistcriteria te voldoen en aliasing te voorkomen.</li>
</ol>3. Cellulair laden met VF2.1Cl
OPMERKING: Alle stappen met betrekking tot deze kleurstof moeten worden uitgevoerd bij weinig licht.
<ol><li>Bereid een Tyrode-badoplossing van (in mM): 140 NaCl, 10 HEPES, 10 Glucose, 4 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, pH = 7,35 en warm tot 37 °C.</li>
	<li>Bereid een aliquot van de laadoplossing in een microcentrifugebuis door 5 μL van 1.000x VF2,1Cl en 50 μL van 20% oplosbare poloxameeroplossing te mengen.</li>
	<li>Breng 5 μL van de laadoplossing aan op 5 ml verwarmde Tyrode-oplossing (totaal 0,1x kleurstofconcentratie) in een petrischaaltje van 20 mm. OPMERKING: De uiteindelijke kleurstofconcentratie is 0,1x. Dit is 1/10e die door de fabrikant wordt voorgesteld. Dit bespaart hulpbronnen, zorgt voor een verwaarloosbare cytotoxiciteit en, belangrijker nog, het behoudt nog steeds duidelijke optische signalen van geladen cellen met hoge signaal-ruisverhoudingen.</li>
	<li>Voeg een enkele iPSC-CM afdekslip toe aan de schaal en incubeer bij 37 °C gedurende 20 minuten.</li>
	<li>Monteer een verwarmde levende celbeeldkamer. Monteer op het microscooppodium en vul met 500 μL verse Tyrode-oplossing.</li>
	<li>Was de deklip met verse Tyrode-oplossing op 37 °C.</li>
	<li>Breng de iPSC-CM coverslip voorzichtig aan op de voorverwarmde badkamer met behulp van een fijne punt tang. OPMERKING: Zorg ervoor dat de kamer en de inhoud ervan altijd worden verwarmd bij fysiologische temperaturen. Begin indien gewenst met continue perfusie van de verwarmde Tyrode-oplossing.</li>
</ol>4. Elektrische veldstimulatie
OPMERKING: Externe triggering van iPSC-CM is optioneel maar nuttig voor standaardisatie van cellulaire dynamica en experimentele parameters. Het verhoogt het analysegemak en maakt het mogelijk om frequentieafhankelijke effecten te onderzoeken.
<ol><li>Bevestig een stimulatie-inzetstuk met twee platina-elektroden op 5 mm afstand van elkaar in de opnamekamer.</li>
	<li>Sluit een externe stimulator aan op de stimulatie-insert. Ingesteld op bipolaire veldpulsen van 5 ms bij 0,5 Hz.</li>
	<li>Bepaal de optimale stimulatiespanning door de stimulus van 1 V naar boven te verhogen. Drempelprikkel wordt gedefinieerd als de laagste spanning waarbij cellen beginnen samen te trekken. Breng spanningen aan die ongeveer 25% boven deze drempel liggen. Normaal bereik ligt tussen 1 V en 30 V.</li>
	<li>Fix stimulatiefrequentie met de externe stimulator of activeer deze met acquisitiesoftware.</li>
</ol>5. Acquisitie van optische actiemogelijkheden
OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van commerciële software voor acquisitie en analyse.
<ol><li>Visualiseer de myocyten in brightfield-weergave met behulp van het doorlatende lichtpad en de USB-camera.</li>
	<li>Selecteer een geïsoleerde cel en snijd het optische pad strak bij met het veldmembraan, zodat alleen licht van de cel van belang wordt bewaakt.</li>
	<li>Activeer de PMT-versterker en stel de PMT-voeding in op 750 V.</li>
	<li>Voer het stimulatieprotocol (zie stap 4) samen met de acquisitiesoftware uit en activeer tegelijkertijd het excitatielicht van 470 nm. Dit laatste kan via een remote panel of geautomatiseerd worden op een vaste intensiteit (TTL signaal).</li>
	<li>Pas de versterking en offset van de PMT-versterker aan om ervoor te zorgen dat het signaal niet verzadigd raakt en is geoptimaliseerd voor het detectiebereik van het opnamesysteem.</li>
	<li>Record 10 sweeps die ervoor zorgen dat stabiele actiepotentiaal wordt gedetecteerd.</li>
	<li>Ga door met opnemen en verplaats onmiddellijk de microscooptrap om kort een achtergrondsignaal te verkrijgen van een gebied zonder cellen. Schakel het excitatielampje uit. OPMERKING: Deze achtergrondwaarde(F-offset) wordt gebruikt om rekening te houden met eventuele achtergrondfluorescentie.</li>
	<li>Indien gewenst, perfuseer lokaal referentiegeneesmiddelen zoals 1 μM nifedipine om cellulaire reacties op farmacologische manipulatie te identificeren.</li>
	<li>Herhaal achtereenvolgens stap 5.2 tot en met 5.7, telkens wanneer u een nieuwe cel selecteert. Verwissel indien gewenst coverslips om een hoge experimentele omzet in één keer te garanderen. OPMERKING: Protocollen voor laden en beeldacquisitie worden beschreven in figuur 2.</li>
</ol>6. Data-analyse
<ol><li>Open een opgeslagen opname met de analysesoftware en gemiddeld 10 sweeps met gestimuleerde actiepotentiaalen van een enkele cel.</li>
	<li>Neem een gemiddelde van het basislijnsignaal datF-offset vertegenwoordigt en trek dit af van het gemiddelde spoor.</li>
	<li>Bereken ∆F/F0 met de volgende formule (waarbij F fluorescentie wordt gemeten en F0 diastolische fluorescentie): <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ03v2.jpg">
</li>
	<li>Identificeer de trace baseline (diastolisch) en het interessegebied (AP) en meet de gewenste cardiale actiepotentiaalparameters. Dit omvat, maar is niet beperkt tot, de vervaltijd voor 50% (APD50)en 90% (APD90)repolarisatie.</li>
	<li>Exporteer de gegevens uit deze ene cel naar een spreadsheetsoftware.</li>
	<li>Herhaal stap 6.1 – 6.5 voor alle opnames. Beoordeel de resultaten met geschikte ongepaarde tests of analyse van variantie.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig2v2.jpg"> Figuur 2: Protocollen voor laden en beeldacquisitie. (A) Stroomdiagram van het volledige VF2.1Cl-laadprotocol voor iPSC-CMs en inheemse cardiomyocyten. (B) Een vereenvoudigd schema van bundelsplitser (BS) en filterconfiguraties die in dit protocol worden gebruikt voor excitatie en detectie van VF2.1Cl-emissie als reactie op veranderingen in de transmembraanspanning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61890/61890fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<ol><li>Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+fluorescent+voltage+indicators+for+studying+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).</li>
<li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+using+a+library+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+reveals+disease-specific+patterns+of+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li>
<li>Horváth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+resting+membrane+potential+and+low+inward+rectifier+potassium+currents+are+not+inherent+features+of+hiPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Low resting membrane potential and low inward rectifier potassium currents are not inherent features of hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 822-833 (2018).</li>
<li>Salama, G., Morad, M. Merocyanine 540 as an optical probe of transmembrane electrical activity in the heart. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSalama%2C+G+%22Science%22">Science</a>. 191 (4226), 485-487 (1976).</li>
<li>Hortigon-Vinagre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+ratiometric+fluorescence+measurements+of+the+voltage+sensitive+dye+Di-4-ANEPPS+to+examine+action+potential+characteristics+and+drug+effects+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The use of ratiometric fluorescence measurements of the voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS to examine action potential characteristics and drug effects on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Toxicological Sciences. 154 (2), 320-331 (2016).</li>
<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li>
<li>Miller, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+monitoring+voltage+in+neurons+by+photo-induced+electron+transfer+through+molecular+wires%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Optically monitoring voltage in neurons by photo-induced electron transfer through molecular wires.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (6), 2114-2119 (2012).</li>
<li>Bedut, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+drug+profiling+with+voltage-+and+calcium-sensitive+fluorescent+probes+in+human+iPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">High-throughput drug profiling with voltage- and calcium-sensitive fluorescent probes in human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (1), 44-53 (2016).</li>
<li>McKeithan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+platform+for+assessment+of+congenital+and+drug-induced+arrhythmia+with+hiPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Physiology. 8, 766(2017).</li>
<li>Duncan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-mediated+shortening+of+action+potentials+in+LQTS2+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Drug-mediated shortening of action potentials in LQTS2 human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cells and Development. 26 (23), 1695-1705 (2017).</li>
<li>Asakura, K., Hayashi, S., Ojima, A., Taniguchi, T., Miyamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+acquisition+and+analysis+methods+in+multi-electrode+array+experiments+with+iPS+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Improvement of acquisition and analysis methods in multi-electrode array experiments with iPS cell-derived cardiomyocytes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 75, 17-26 (2015).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Kleinsorge, M., Cyganek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-directed+differentiation+of+human+iPSCs+into+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Subtype-directed differentiation of human iPSCs into atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> STAR Protocols. , 100026(2020).</li>
<li>Knollmann, B. C., Katchman, A. N., Franz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monophasic+action+potential+recordings+from+intact+mouse+heart%3A+validation%2C+regional+heterogeneity%2C+and+relation+to+refractoriness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Monophasic action potential recordings from intact mouse heart: validation, regional heterogeneity, and relation to refractoriness.</a> Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 12 (11), 1286-1294 (2001).</li>
<li>Leopold, J. A., Loscalzo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+precision+medicine+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Emerging role of precision medicine in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (9), 1302-1315 (2018).</li>
<li>Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+atrial+myocytes+for+simultaneous+measurements+of+Ca2%2B+transients+and+membrane+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50235(2013).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+Leak+and+increased+Na%2B-Ca2%2B+exchanger+function+underlie+delayed+afterdepolarizations+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ Leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+atrial+arrhythmogenesis+in+patients+with+paroxysmal+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of atrial arrhythmogenesis in patients with paroxysmal atrial fibrillation.</a> Circulation. 129 (2), 145-156 (2014).</li>
<li>Fakuade, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+atrial+cytosolic+calcium+handling+contributes+to+the+development+of+postoperative+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation.</a> Cardiovascular Research. , doi: 10.1093/cvr/cvaa162. Online ahead of print 162(2020).</li>
<li>Gross, E., Bedlack, R. S., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-wavelength+ratiometric+fluorescence+measurement+of+the+membrane+dipole+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurement of the membrane dipole potential.</a> Biophysical Journal. 67 (1), 208-216 (1994).</li>
<li>Matiukas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+voltage-sensitive+fluorescent+dyes+optimized+for+optical+mapping+in+blood-perfused+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Near-infrared voltage-sensitive fluorescent dyes optimized for optical mapping in blood-perfused myocardium.</a> Heart Rhythm. 4 (11), 1441-1451 (2007).</li>
<li>Mutoh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrally-resolved+response+properties+of+the+three+most+advanced+fret+based+fluorescent+protein+voltage+probes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spectrally-resolved response properties of the three most advanced fret based fluorescent protein voltage probes.</a> PLoS One. 4 (2), 4555(2009).</li>
<li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li>
<li>Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photostable+silicon+rhodamine+platform+for+optical+voltage+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (33), 10767-10776 (2015).</li>
<li>Deal, P. E., Kulkarni, R. U., Al-Abdullatif, S. H., Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isomerically+pure+tetramethylrhodamine+voltage+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Isomerically pure tetramethylrhodamine voltage reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9085-9088 (2016).</li>
<li>Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectra%2C+membrane+binding%2C+and+potentiometric+responses+of+new+charge+shift+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Spectra, membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes.</a> Biochemistry. 24 (21), 5749-5755 (1985).</li>
<li>Fromherz, P., Muller, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+fluorescence+of+amphiphilic+hemicyanine+dyes+in+neuron+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive fluorescence of amphiphilic hemicyanine dyes in neuron membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1150 (2), 111-122 (1993).</li>
<li>Salama, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+new%2C+long-wavelength%2C+voltage-sensitive+dyes+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart.</a> Journal of Membrane Biology. 208 (2), 125-140 (2005).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+action+potentials+and+subthreshold+electrical+events+imaged+in+neurons+with+a+fluorescent+protein+voltage+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe.</a> Neuron. 75 (5), 779-785 (2012).</li>
<li>Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., MacLaurin, D., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+action+potentials+in+mammalian+neurons+using+a+microbial+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin.</a> Nature Methods. 9 (1), 90-95 (2012).</li>
<li>Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+membrane+voltage+measurements+using+FRET+with+new+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 5 (8), 683-685 (2008).</li>
<li>Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knöpfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+genetically+encodable+fluorescent+voltage+sensor+exploiting+fast+Ci-VSP+voltage-sensing+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements.</a> PLoS One. 3 (6), 2514(2008).</li>
<li>Bradley, J., Luo, R., Otis, T. S., DiGregorio, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submillisecond+optical+reporting+of+membrane+potential+in+situ+using+a+neuronal+tracer+dye%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Submillisecond optical reporting of membrane potential in situ using a neuronal tracer dye.</a> The Journal of neuroscience. 29 (29), 9197-9209 (2009).</li>
<li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+%26+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues.</a> Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).</li>
<li>Kappadan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+optical+measurement+of+cardiac+restitution%2C+contraction%2C+and+fibrillation+dynamics+in+beating+vs.+blebbistatin-uncoupled+isolated+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 464(2020).</li>
<li>Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrophysiological+and+mechanical+effects+of+2%2C3-butane-dione+monoxime+and+cytochalasin-D+in+the+Langendorff+perfused+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 89 (2), 163-172 (2004).</li>
<li>Képiró, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((para-Nitroblebbistatin%2C+the+non-cytotoxic+and+photostable+Myosin+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable Myosin inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li>
</ol>

Cairn Research Ltd ondersteunde deze publicatie door de productiekosten van het videobestand te dekken.

Hier beschrijven we een basisprotocol om eenvoudig gedetailleerde AP-profielen te verkrijgen van geïsoleerde iPSC-CMs die geschikt zijn voor elektrofysiologische modellering en cardiale geneesmiddelenscreening. We detecteren regelmatige, robuuste AP's van onze schaars gezaaide iPSC-CMs, wat zowel indicatorfunctionaliteit als methodologische betrouwbaarheid suggereert.
Vanwege het brede spectrum van commerciële methodologieën voor iPSC-herprogrammering en het gebrek aan standaardisatie voor car...

Elektrofysiologische modellering van cardiomyocyten en de bouw van efficiënte platforms voor cardiale geneesmiddelenscreening is essentieel voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën voor een verscheidenheid aan aritmische aandoeningen. Snelle uitbreiding van geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) technologie heeft veelbelovende inbraken in de menselijke ziekte modellering en farmacologisch onderzoek met behulp van geïsoleerde patiënt afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM) geproduceerd. "Gouden standaard" -technieken voor elektrofysiologische karakterisering van deze cellen door middel van patch-clamp (current-clamp) kunnen de morfologie en duur van het actiepotentiaal (AP) kwantificeren, maar deze methode is ongelooflijk complex en traag en niet goed geschikt voor gegevensacquisitie met hoge doorvoer1. iPSC-CMs hebben regelmatig een verhoogd diastolisch membraanpotentiaal en verhoogde lekstroom in vergelijking met volwassen inheemse cardiomyocyten2. Er wordt gesuggereerd dat kleinere celgrootte en verminderde membraancapaciteit waargenomen in iPSC-CMs een systematische fout kunnen veroorzaken bij het gebruik van de stroomklemtechniek, misschien als verklaring voor deze afwijkingen3. Om het nut van een iPSC-CM-platform te maximaliseren, is een extra methode waardevol om de doorvoer te verhogen en de nauwkeurigheid van gegevens te garanderen bij het karakteriseren van transmembraanspanningsveranderingen op een enkel celniveau in iPSC-CMs.
Spanningsgevoelige kleurstoffen (VSD) zijn al lang een voorgestelde methode om een snellere, niet-invasieve en gelijkwaardige analyse van cardiale AP-kinetiek te bieden in vergelijking met die van traditionele technieken4. Een recente studie heeft de geschiktheid aangetoond van ratiometrische spanningsgevoelige sondefotometrie om de cardiale AP5nauwkeurig te kwantificeren. Bovendien leent de mogelijkheid om optische fotometriebenaderingen gemakkelijk op te schalen deze techniek aan grootschalige cardiotoxiciteitsscreenings die van cruciaal belang zijn bij de ontwikkeling van therapeutische geneesmiddelen (bijv. CiPA). Ontwikkeling van gestandaardiseerde cardiotoxiciteitsprotocollen in een geblindeerde multi-site studie met behulp van micro-elektrode array en spanningsgevoelige optische technieken heeft de belangrijkste waarde van deze aanpak aangetoond6.
Veel potentiometrische kleurstoffen zijn commercieel verkrijgbaar en de voortdurende synthetische ontwikkeling van nieuwe sondes toont een opwindend potentieel voor het stroomlijnen van hun effectiviteit in een verscheidenheid aan cardiale en neurale constructies. De ideale VSD heeft een verhoogde kinetiek en gevoeligheid, terwijl de capacitieve belasting, fotobleaching en cytotoxiciteit afnemen. De onlangs gesynthetiseerde VF2.1Cl (FluoVolt) drukt veel van deze gunstige eigenschappen uit, grotendeels te danken aan de nieuwe draadgebaseerde moleculaire structuur, gedeeld door andere leden van de nieuwe VoltageFluor (VF) -familie7. In tegenstelling tot gewone elektrochrome VSD's waarin eenvoudige sondes moleculair en elektrisch conjugeren met het plasmamembraan, bestaat deze kleurstof uit een passief ingebrachte, membraanoverspannende synthetische draad die een elektronrijke donor koppelt aan een gemodificeerde fluoresceïnefluoofoor (FITC). Mechanistische details zijn te vinden in figuur 1. Deze kleurstof toont een uitstekende gevoeligheid voor membraanspanningsfluctuaties en vertoont een verandering van 27% in emissie-intensiteit per 100 mV in tegenstelling tot ~ 10% gezien in andere veel voorkomende sondes bij vergelijkbare snelheden7. Bovendien hebben draadgebaseerde PeT-systemen geen directe interactie met het cellulaire elektrische veld, wat minimale elektrische interferentie en verwaarloosbare veranderingen in cellulaire capacitieve belasting produceert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig01.jpg"> Figuur 1: Chemische, spectrale en mechanistische parameters van VF2.1Cl kleurstof. (A) Chemische structuur van VF2.1Cl. Moleculaire kenmerken om op te merken omvatten meerdere alkylgroepen in de fenyleenvinyleen moleculaire draad die het inbrengen in het plasmamembraan vergemakkelijken. Een negatief geladen sulfonzuurgroep geconjugeerd aan de FITC-sonde zorgt voor fluorofoorstabilisatie op het extracellulaire oppervlak en helpt bij het bijna loodrecht inbrengen ten opzichte van het elektrische veld van de lipide dubbellaag. B)Een vereenvoudigd schema van loodrechte VF2,1Cl inbedding in het plasmamembraan van een doelcel. (C) Absorptie- en emissiespectra van VF2.1Cl kleurstof. Spectra is identiek aan die van standaard FITC- en GFP-sondes. D)Weergave van het mechanistische werkingsmechanisme van VF2.1Cl. In rustomstandigheden (hyperpolarisch) drijven negatieve intracellulaire spanningen vrije elektronen naar de rostrale fluorofoor. Elektronenrijkdom zorgt ervoor dat foto-geïnduceerde elektronenoverdracht (PeT) de voorkeur krijgt als een pad uit de aangeslagen toestand na de optische excitatie, waardoor fluorescentie effectief wordt geblust. Daarentegen beïnvloedt een gedepolariseerde membraanpotentiaal de neerwaartse elektronenbeweging ten gunste van fluorescentie bij optische excitatie. De resulterende fluorescerende respons is lineair gerelateerd aan membraanspanning en kan nauwkeurig worden gebruikt om gedetailleerde temporele informatie over cellulaire elektrofysiologische kinetiek te verzamelen. (E) Representatieve brightfield (bovenste) en fluorescentie bij 470 nm (onderste) beelden van leporine cardiomyocyten geladen met VF2.1Cl. (F) Z stack van een enkele geladen cardiomyocyt. Pijlen geven gebieden aan met een duidelijke lokalisatie van VF2.1Cl naar het celmembraan. Beelden werden verkregen met een ronddraaiend schijf confocaal systeem bestaande uit een X-lightv3 draaiende schijf confocale kop met een 50 μm pinhole patroon; LDI-7 verlichting; Prime95B camera en een PlanApo Lambda 100x objectief. Schaalbalk: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61890/61890fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
De FITC-sonde geconjugeerd aan VF2.1Cl zorgt ervoor dat deze effectief kan worden gebruikt onder standaard- en GFP-filterconfiguraties, en vereist slechts een enkelkanaals acquisitiesysteem, die beide gemeenschappelijke kenmerken zijn van fluorescerende beeldvormingsplatforms. Analyse van dichte menselijke iPSC-CM monolagen met deze kleurstof is onlangs gemeld8,9,10,11. Ons protocol verschilt van deze studies vanwege ons onderzoek naar enkele, geïsoleerde iPSC-CMs, niet gestoord door de elektrische en paracriene invloeden van dichte syncytiele monolagen, en ons gebruik van een betaalbaar en aanpasbaar fotometriesysteem in tegenstelling tot complexe confocale of wide-field beeldvormingsarrangementen.
Hier beschrijven we ons protocol voor de snelle verwerving en analyse van robuuste optische AP's van geïsoleerde menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten en inheemse cardiomyocyten (zie Aanvullend bestand). We gebruiken VF2.1Cl in combinatie met een aanpasbaar state-of-the-art platform voor fotometriemetingen met één cel. Deze experimentele protocollen zijn goedgekeurd door de ethische commissie van het Universitair Medisch Centrum Göttingen (nr. 10/9/15).

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25 Trypsin EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>HN04.2</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose anhydrous&nbsp;BioChemica</td><td>ITW Reagents</td><td>A1422</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FluoVolt Membrane Potential Kit&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>F10488</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>HN77.4</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Lamanin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114956-81-9</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>BD</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9265.2</td><td></td></tr><tr><td>Nifedipine&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21829-25-4</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor Y27632</td><td>Stemolecule</td><td>04-0012-10</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Versene EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15040033</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>495LP Dichroic Beamsplitter&nbsp;</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B Amplifier&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Circle Coverslips, Thickness 0</td><td>Thermo Scientific</td><td>CB00100RA020MNT0</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1550B</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual OptoLED Power Supply&nbsp;</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET470/40x Excitation Filter&nbsp;</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET535/50m</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etched Neubauer Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter Cubes&nbsp;</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IX73 Inverted Microscope&nbsp;</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MonoLED</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiport Adaptors&nbsp;</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myopacer Cell Stimulator&nbsp;</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optomask Shutter&nbsp;</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optoscan System Controller</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PH-1 Temperature Controlled Platform&nbsp;&nbsp;</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photomultiplier Detector&nbsp;</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMT Amplifier Insert</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMT Supply Insert</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RC-26G Open Bath Chamber&nbsp;</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SA-OLY/2AL Stage Adaptor&nbsp;</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T565lpxr Dichroic Beamsplitter&nbsp;</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T660lpxr Dichroic Beamsplitter</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-20 Dual Channel Temperature Controller&nbsp;</td><td>npi Electronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPLFLN 40X Objective</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>USB 3.0 Colour Camera&nbsp;</td><td>Imaging Source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampex 11.1</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampfit 11.1</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IC Capture 2.4&nbsp;</td><td>Imaging Source&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 8</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventionele intracellulaire micro-elektrodetechnieken om cardiomyocytenelektrofysiologie te kwantificeren zijn uiterst complex, arbeidsintensief en worden meestal uitgevoerd in lage doorvoer. Snelle en voortdurende uitbreiding van geïnduceerde pluripotente stamceltechnologie (iPSC) vormt een nieuwe standaard in cardiovasculair onderzoek en alternatieve methoden zijn nu nodig om de doorvoer van elektrofysiologische gegevens op een enkel celniveau te verhogen. VF2.1Cl is een recent afgeleide spanningsgevoelige kleurstof die een snelle eenkanaals, hoge magnitude respons biedt op fluctuaties in membraanpotentiaal. Het bezit een kinetiek die superieur is aan die van andere bestaande spanningsindicatoren en stelt functionele gegevens beschikbaar die gelijkwaardig zijn aan die van traditionele micro-elektrodetechnieken. Hier demonstreren we vereenvoudigde, niet-invasieve actiepotentiaalkarakterisering in extern getemporeerde menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten met behulp van een modulair en zeer betaalbaar fotometriesysteem.

<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig03.jpg"> Figuur 3: Optische actiepotentiaal (AP) profielen van geïsoleerde inheemse cardiomyocyten en door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM). (A) Representatieve optische AP van een enkele muriene cardiomyocyt (midden) met gemiddelde ± SEM van APD50 en APD90 (n = 7, rechts). (B)Representatieve optisc...

Hier beschrijven we optische acquisitie en karakterisering van actiepotentiaalen van geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten met behulp van een snel modulair fotometriesysteem.

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Dit protocol kan hoge doorvoermetingen van cellulaire elektrofysiologie leveren op een manier die past bij de snel ontwikkelende technologie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten. Het grote voordeel van deze techniek is dat het minder complex en minder arbeidsintensief is dan de traditionele patch clamp-techniek, maar toch in staat is om gelijkwaardige resultaten te produceren. Dit protocol kan dus worden uitgebreid voor grootschalige toxiciteitsscreeningsprogramma's met behulp van humane geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten.Bijvoorbeeld, de uitgebreide in vitro proarrythmie assay. Om geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten culturen voor het experiment voor te bereiden, bekleed eerst individuele ronde glazen dekseltjes van 10 millimeter met 150 microliter van 1:60 basement membraan matrix in elk putje van een 24-putjesplaat, en incubeer de dekseltjes gedurende vier uur op vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, verwijder het overtollige matrix van de dekseltjes en breng het juiste volume cellen toe op elk deksel.Na een uur bij 37 graden Celsius, vul elk putje voorzichtig met plateermedium en breng de plaat terug naar de incubator. Om voor te bereiden op voltage-gevoelige kleurstofbeeldvorming, rust een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop uit met een lens met 40x vergroting en hoge numerieke apertuur, en koppel een snel schakelende warm witte LED aan de getransmitteerde verlichtingspoort. Plaats een eenvoudige rode 660 nanometer filter in de getransmitteerde lichtbaan en monteer een snel schakelende 470 nanometer LED-kop voor fotometrieregistratie.Plaats een 470/40 excitatiefilter op de epifluorescentiepoort om het licht dat door de LED wordt gegenereerd op te schonen, en plaats een microscoopkubus met een 495 nanometer long pass stralingsdeler in de spiegeleenheidscarooselle binnen de microscoop. Pas een detectiearm met een verstelbare velddiafragma toe op de C-mountpoort om selectie van het gebied van belang mogelijk te maken, en koppel een PMT-detector en een USB-camera aan de microscoop. Plaats een filterkubus met een 565 nanometer long pass stralingsdeler en een 535/50 emissiefilter in de PMT-poort om het emissielicht te splitsen tussen de twee detectoren.Koppel de PMT aan een voeding en een PMT-versterker, en sluit de PMT-versterkeruitgang aan op een analoge ingangspen van een data-acquisitiesysteem. Om aan de Nyquist-criteria te voldoen en aliasing te voorkomen, filter de analoge gegevens van de PMT bij één kilohertz of hoger, en digitaliseer de gegevens met een frequentie die minstens tweemaal zo hoog is als de hoogste frequentie die in het analoge signaal aanwezig is. Om de cellen te laden met voltage-gevoelige kleurstof, meng vijf microliter van 1000x FluoVolt en 50 microliter van power load-oplossing, en voeg drie microliter van de resulterende laadoplossing toe aan drie milliliter van opgewarmde Tyrode-oplossing in een petrischaal.Voeg een enkele geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten gecoate deksel toe aan de schotel en plaats de schotel op 37 graden Celsius gedurende 20 minuten. Monteer een verwarmde live celbeeldvormingskamer op de microscooptafel en vul de kamer met 500 microliter van verse Tyrode-oplossing. Was vervolgens de deksel met verse Tyrode-oplossing op 37 graden Celsius en gebruik fijne pincet om de deksel voorzichtig over te brengen naar de voorverwarmde badkamer.Om de cellulaire dynamica en experimentele parameters te standaardiseren, plaats twee platina elektroden in de kamer, met een afstand van vijf millimeter, en verbind de elektroden met een externe stimulator. Stel de stimulator in op bipolaire veldpulsen van vijf milliseconden bij 0,5 hertz, en verhoog het stimulus van één volt totdat de cellen beginnen te samentrekken. Stel vervolgens de spanning in op ongeveer 25% boven dit drempelwaarde.Voor optische actiepotentiaalregistratie, gebruik de getransmitteerde lichtbaan en de USB-camera om de myocyten onder helderveldcondities te visualiseren. Selecteer een geïsoleerde cel en gebruik de velddiafragma om zijn optische baan strak af te snijden, zodat ervoor wordt gezorgd dat alleen licht van de cel van belang wordt gemonitord. Activeer de PMT-versterker, en stel de PMT-voeding in op 750 volt.Voer het stimulatieprotocol uit samen met de acquisitiesoftware terwijl tegelijkertijd het 470 nanometer excitatielicht wordt geactiveerd. Neem 10 sweeps op, zorg ervoor dat stabiele actiepotentialen worden gedetecteerd. Na de laatste sweep, verplaats onmiddellijk de microscooptafel terwijl nog steeds wordt opgenomen om kortstondig achtergrondsignaal te verkrijgen van een gebied zonder cellen en schakel het excitatielicht uit.Om de actiepotentiaalgegevens te analyseren, open een opgeslagen opname in de juiste analysesoftware en gemiddel 10 sweeps met gestimuleerde actiepotentialen van een enkele cel. Trek het gemiddelde van het basislijnsignaal dat de fluorescentie offset vertegenwoordigt af van het gemiddelde spoor, en gebruik vervolgens de formule om de verandering in fluorescentie te berekenen met behulp van diastolische fluorescentie als F0. Identificeer de diastolische en actiepotentiaalgebieden van belang en meet de gewenste hartactiepotentiaalparameters, inclusief, maar niet beperkt tot, de duur bij 50% en 90% repolarisatie. Exporteer vervolgens de gegevens van deze enkele cel naar een spreadsheetprogramma.Deze methode maakt snelle en nauwkeurige kwantificering van repolarisatie mechanica mogelijk, wat waardevolle inzichten kan opleveren in cellulaire ionische abnormaliteiten. Uitgesproken fase één kenmerken kunnen worden waargenomen in optische signalen van muis cardiomyocyten, die morfologisch verschillen van die van humane geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten. Bovendien zijn humane geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten responsief op farmacologische manipulatie met nifedipine, een bekende L-type calciumkanaal antagonist.Tijdens continue toediening van het medicijn werd een 41,5% afname in actiepotentiaalduur bij 90% repolarisatie waargenomen, wat de functionaliteit van fluorescente voltage indicator-gebaseerde beeldvorming suggereert als een platform voor prospectieve hoge doorvoer hartmedicijnscreeningsstudies. Het is belangrijk om in gedachten te houden dat hoewel de voltage

single-cell-optical-action-potential-measurement-human-induced

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Elektrofysiologische karakterisering van cardiomyocyten afgeleid van humane Pluripotente Stamcellen (hPSC-CM's) is van cruciaal belang voor cardiovasculaire modellering en voor het bepalen van geneesmiddelreacties. Dit protocol geeft de nodige informatie om hPSC-CM's op multi-elektrode arrays te scheiden en te platen, hun veldpotentiaal te meten en een methode voor het analyseren van QT- en RR-intervallen.

Elektrofysiologische analyse van humane Pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hPSC-CM&#39;s) met behulp van multi-elektrode arrays (MEA&#39;s)

Hier presenteren we een methode om optisch beeld actie potentieel, specifiek in ventriculaire-achtige geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige cardiomyocytes. De methode is gebaseerd op de promotor-gedreven uitdrukking van een spanning-gevoelige fluorescent proteïne.

Subtype-specifieke optische actiepotentiaal opnamen in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ventriculaire Cardiomyocytes

Dit artikel bevat een set van protocollen voor de ontwikkeling van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hartspier (hipsc-cm) netwerken gekweekt op multi well mea platen om reversibel elektroporate de celmembraan voor actie potentiële metingen. Opnamen met hoge doorvoer worden via dezelfde cellocaties herhaaldelijk over dagen verkregen.

Humane iPSC-afgeleide cardiomyocyte netwerken op multi well micro-elektrode arrays voor terugkerende actie potentiële opnames

Door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CM's) zijn naar voren gekomen als een veelbelovend in vitro model voor door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteitsscreening en ziektemodellering. Hier beschrijven we een protocol voor het meten van de contractiliteit en elektrofysiologie van hiPSC-CM's.

Technische toepassingen van micro-elektrode array en patchklemopnamen op door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten

De combinatie van laserporosatie en micro-elektrode arrays (MEA) maakt actiepotentiaalachtige opnames van gecultiveerde primaire en stamcel-afgeleide cardiomyocyten mogelijk. De golfvorm biedt superieur inzicht in het werkingsmechanisme van teststoffen dan standaardopnamen. Het koppelt patch-clamp en MEA-uitlezing om cardioveiligheidsonderzoek in de toekomst verder te optimaliseren.

Laser-geïnduceerde actiepotentiaal-achtige metingen van cardiomyocyten op micro-elektrode arrays voor verhoogde voorspelbaarheid van veiligheidsfarmacologie

Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) bieden een alternatief voor het gebruik van dieren voor preklinische cardiotoxiciteitsscreening. Een beperking voor de wijdverbreide toepassing van hiPSC-CMs in preklinische toxiciteitsscreening is het onrijpe, foetale fenotype van de cellen. Hier worden protocollen gepresenteerd voor robuuste en snelle rijping van hiPSC-CMs.

High-throughput cardiotoxiciteitsscreening met behulp van volwassen door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytenmonolagen

Hier demonstreren we een niet-invasieve contractiliteitsevaluatiemethode voor cardiale medische hulpmiddelen met behulp van 2D-door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CM) monolagen, verguld op een flexibel substraat, gekoppeld aan videogebaseerde microscopie. Deze tool zal nuttig zijn voor de in vitro evaluatie van de contractiele eigenschappen van cardiale elektrofysiologische apparaten.

Evaluatie van cardiale contractiliteitsmodulatietherapie in 2D-van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Hier wordt een gevestigde methode beschreven om contractiliteits- en calciummetingen uit te voeren in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten met behulp van een op optica gebaseerd platform. Dit platform stelt onderzoekers in staat om het effect van mutaties en de reactie op verschillende stimuli op een snelle en reproduceerbare manier te bestuderen.

Real-time metingen van calcium- en contractiliteitsparameters in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten

Het gebruik van licht om hartcellen en -weefsel te controleren, maakt contactloze stimulatie mogelijk, waardoor de natuurlijke staat en functie van de cellen behouden blijven, waardoor het een waardevolle benadering is voor zowel fundamenteel onderzoek als therapeutische toepassingen.

Een cardiaal microfysiologisch systeem voor het bestuderen van Ca2+ propagatie via niet-genetische optische stimulatie

Optische resolutie fotoakoestische microscopie (OR-PAM) is een opkomende technologie die in staat van beeldvorming optische absorptie...

Drie-dimensionale Optische resolutie Fotoakoestisch Microscopie

Leer optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten met een modulair fotometriesysteem. Deze methode vereenvoudigt elektrofysiologisch onderzoek.

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Meer video's verkennen