Optimaliseren van de groei van endothiapepsine kristallen voor seriële kristallografie experimenten

Seriële kristallografie-experimenten kunnen een uitdaging zijn. Een belangrijke hindernis in hun praktijk is het maken van microkristallijne monsters. Dit protocol laat zien hoe dergelijke monsters betrouwbaar kunnen worden gemaakt.

Deze methode maakt gebruik van endothiapepsine om een kader te bieden voor het optimaliseren van grote kristallen die in dampdiffusieplaten met een klein volume worden gekweekt tot microkristallijne slurries met een groot volume. We kunnen niet beweren dat dit protocol universeel succesvol zal zijn. We hopen echter dat de ideeën en methoden die hier worden voorgesteld, anderen een experimenteel kader bieden om op andere eiwitten te gebruiken.

Om te beginnen, bereid een twee-druppel 96 putplaat voor met de kristallisatiebuffer met behulp van de Formulatrix-robot. Meng met behulp van een vloeistofbehandelingsrobotmix 150 nanoliter vers ontdooid endothiapepsine met 150 nanoliter van de kristallisatiebuffer in elke put. Sluit de plaat af en laat de kristallen 24 uur groeien in het Formulatrix Hotel.

Breek na 24 uur de kristallen op en verwijder ze uit vijf putten van de kristallisatieplaat met 96 putten. Plaats ze in 250 microliter van de kristallisatiebuffer in een centrifugebuis van 1,5 milliliter in een ijsemmer. Voeg 10 tot 15 glasparels van een millimeter grootte toe aan de centrifugebuis.

Draai de kristallen en kralen op 1000 RPM gedurende 30 seconden en vervang ze gedurende 30 seconden op ijs. De zaden kunnen dan direct gebruikt worden of bewaard worden bij min 20 graden Celsius. Om een morfogramexperiment uit te voeren, voegt u vijf tot 40% concentraties PEG 6000 toe met één kies Tris-HCl bij pH zeven en 0,15 molair magnesiumchloride langs de plaatkolommen van een twee-druppel 96-well rasterscherm Repareer een sequentiële verdunning van endothiapepsine in 0,1 molair natriumacetaat van 100 tot 12,5 milligram per milliliter gedurende acht stappen.

Vervolgens pipetteer acht microliter van elke verdunning gevolgd door twee microliter zaadvoorraad in de vloeistofbehandelingsrobotplaat. Gebruik een vloeistofbehandelingsrobot om 150 nanoliter van elke verdunning van endothiapepsine in subputten één en twee van het scherm af te geven. Multi-aspirateer 50 nanoliter ontdooide zaadvoorraad en 100 nanoliter van de putoplossing uit subput twee en doseer beide in de eiwitoplossing.

Meng oplossingen drie keer na toevoeging van de kristallisatiebuffer of kristallisatiebuffer en zaadmix. Verzegel nu de plaat en het beeld op nul, drie, zes, 12, 18 en 24 uur van de eerste dag elke dag voor de eerste week en elke week voor de komende vier weken bij 20 graden Celsius. Bekijk na 24 uur de plaat onder een microscoop, schat het aantal kristallen in elke put en meet een monster van de kristallen.

Noteer deze schattingen in het meegeleverde werkblad morfogramgenerator. Voer de beginconcentraties van endothiapepsine en PEG 6000 in de juiste dozen in. Het werkblad plot de resultaten automatisch in de traditionele fasediagramindeling met de precipitant- en eiwitconcentraties op respectievelijk de X- en Y-as.

Welnu, omstandigheden die alleen aanleiding geven tot kristallen in hun gezaaide druppels geven het MetaStable-gebied van het diagram aan, terwijl omstandigheden met kristallen in zowel de gezaaide als niet-gezaaide druppels de nucleatiezone aangeven. Selecteer uit de morfogramanalyse de meest veelbelovende voorwaarde voor het schalen in 24 putplaten. Begin dan met 100 milligram per milliliter endothiapepsine en 35% PEG 6000.

Bereid vijf milliliter kristallisatiebuffer met 35% PEG 6000, 0,1 molair Tris-HCl met pH zeven en 0,15 molair magnesiumchloride. Plaats nu 0,5 milliliter van de kristallisatiebuffer in drie putjes van een ingevette 24-well hangende dropplate. Meng 15 microliter endothiapepsine met 15 microliter kristallisatieoplossing op een glazen afdekslip.

Plaats de oplossing over de putjes en laat de plaat 24 uur staan. Bekijk na 24 uur de plaat onder een microscoop, schat het aantal kristallen in de druppel en meet hun grootte. Als de kristallen onjuist zijn, herhaal dan deze stap, maar verander de eiwitconcentratie of voeg zaden toe als de kristalkernvorming niet hoog genoeg is.

Herhaal het 24-well scaling experiment door zaden toe te voegen met een hogere concentratie PEG 6000. Plaats 0,5 milliliter van de nieuwe kristallisatiebuffer in drie putjes van een ingevette 24-well hangende dropplate. Plaats 15 microliter endothiapepsine op een glazen afdekslip en meng vijf microliter zaadvoorraad en 10 microliter kristallisatieoplossing met de endothiapepsine-oplossing.

Keer de afdekstroken om, plaats ze over de putten en laat ze 24 uur staan. Controleer de druppels opnieuw om te zien of de kristallen kleiner zijn en een hogere concentratie hebben. Schat het aantal kristallen in de druppel en meet hun grootte opnieuw om te zien of ze nu de juiste grootte hebben.

Om een seeded-batch-protocol uit te voeren, bereidt u de kristallisatiebuffer voor van 40% PEG 6000, 0,1 molair Tris-HCl met een pH van zeven en 0,15 molair magnesiumchloride. Meng vooraf 50 microliter zaadvoorraad en 100 microliter kristallisatieoplossing en meng met eiwitoplossing in de centrifugebuis van 1,5 milliliter. Draai de buis gedurende 10 seconden en plaats deze op een rocker of shaker bij 20 graden Celsius.

Neem elke 20 minuten een aliquot van 2,5 microliter van de batchoplossing. Controleer de grootte en het aantal kristallen met behulp van een hemocytometer. Tel het aantal kristallen en meet hun grootte onder de microscoop.

Wanneer de kristallen ongeveer 15 micron dimensie hebben bereikt, dooft u de reactie met 150 microliter 0,5 molair natriumacetaat aangevuld met 0,5 molair Tris-HCl, 0,075 molair magnesiumchloride en 20% PEG 6000. Controleer de kristalgrootte en -concentratie opnieuw met behulp van de hemocytometer. Bewaar de kristallen bij 20 graden Celsius.

De endothiapepsine morfogram analyse suggereerde dat nucleatie werd beïnvloed door zowel eiwit- als precipitantconcentraties. De MetaStable, nucleatie en neerslaggebieden van het diagram kunnen mooi worden onderscheiden. De toevoeging van zaden verhoogde het kristalgetal aanzienlijk in vergelijking met druppels zonder zaden.

Analyse van de endothiapepsine microkristallisatie in volumes van 200 tot 300 microliter onthulde de veranderingen in kristalnucleatie en de langste dimensie in de loop van de tijd. Het verhogen van de PEG-concentratie tot 35% verbeterde de kristallisatie, met een uiteindelijke kristalconcentratie van ongeveer 3,6 keer 10 tot de zes per milliliter, en de langste kristaldimensie van 42 micrometer. Om de grootte van de uiteindelijke kristallen te verkleinen, werd een eiwitconcentratiereductiebenadering toegepast, die helaas de kristalconcentratie aanzienlijk verminderde en uiteindelijk nog grotere kristallen produceerde.

De aanpak van het verhogen van de PEG-concentratie tot 40% leverde echter kristallen op van ongeveer 3,1 keer 10 tot zes per milliliter en een grootte van ongeveer 39 micrometer. Verder leidde het toevoegen van zaden tot een aanzienlijke toename van de kristalconcentratie, ongeveer 1,1 keer 10 tot acht per milliliter en kleinere afmetingen van ongeveer 4,2 micrometer. Het bluseffect dat in de kristallisatiereactie werd geprobeerd, gaf een uiteindelijke kristalconcentratie van ongeveer 2,6 maal 10 tot de zes per milliliter en een grootte van ongeveer 15 micrometer.

De CC-helft uitgezet tegen de resolutie van de röntgengegevens vertoonde een lichte afname van de kristalresolutie van de volumes van 10 microliter naar 200 tot 300 microliter. Het kristal diffracteerde echter nog steeds tot 1,5 angstrum, wat voldoende werd geacht. Endothiapepsine is een vergevingsgezind eiwit om mee te werken.

We hopen dat het proberen van dit protocol van endothiapepsine nuttige ideeën en methoden voor andere eiwitten zal genereren. Vooral bij kristallografie is het nuttig om te zien hoe dingen eruit zien en voelen in plaats van alleen te proberen een geschreven protocol te volgen. Deze video zal je hopelijk een deel van dat gevoel geven.