Name: Het vaststellen van bestuivingsvereisten in Japanse pruim door fenologische monitoring, handbestuivingen, fluorescentiemicroscopie en moleculaire genotypering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-09T15:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Ontdek hoe je bestuivingsvereisten in Japanse pruim bepaalt door fenologische monitoring, handbestuivingen, fluorescentiemicroscopie en moleculaire genotypering toe te passen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gefinancierd door Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 en RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón — Europees Sociaal Fonds, Europese Unie (Grupo Consolidado A12-17R) en Junta de Extremadura — Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero werd ondersteund door een fellowship van Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología van Mexico (CONACYT, 471839).

1. Handbestuiving in het veld
<ol><li>
Pollenextractie
	<ol>
<li>Om stuifmeel te verkrijgen, verzamel bloemknoppen in stadium D24,volgens fase 57 op de BBCH-schaal25,26. OPMERKING: Meer bloemknoppen zijn nodig in Japanse pruimen dan in andere Prunus-soorten omdat hun helmknoppen minder stuifmeel produceren.</li>
		<li>Verwijder de helmdoeken met behulp van een plastic gaas (poriegrootte van 2 mm x 2 mm) en leg ze gedurende 24 uur op papier bij kamertemperatuur totdat ze verder gaan.</li>
		<li>Zeef de stuifmeelkorrels door een fijn gaas (0,26 mm x 0,26 mm poriegrootte) en bewaar ze in een glazen buis van 10 ml met een dop bij 4 °C tot gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bestuiving van uitgemergelde bloemen
	<ol>
<li>Wanneer tussen de 10% -20% van de bloemen open is, selecteert en labelt u verschillende takken. Verwijder open bloemen en jonge knoppen, waardoor alleen bloemknoppen overblijven in stadium D24,volgens fase 57 op de BBCH-schaal25,26.</li>
		<li>Verwijder de bloemblaadjes, kelkbladen en meeldraden van tussen de 800 en 1.000 bloemknoppen per behandeling met vingernagels of pincetten.</li>
		<li>Bestuiving de stampers met behulp van een fijne verfkwast 24 uur na vermagering. Sommige takken bevatten de helft van de stampers met stuifmeel van dezelfde cultivar, en de andere helft met compatibel stuifmeel van andere cultivar als controle. Zorg ervoor dat u de vingertop of verfkwast niet verontreinigt met stuifmeelkorrels van andere cultivars.</li>
		<li>Registreer wekelijkse tellingen van bloemen en ontwikkelende vruchten om het fruitdruppelpatroon te karakteriseren en kwantificeer de uiteindelijke vruchtzetting in elke bestuivingsbehandeling.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aanvullende bestuiving in het veld
	<ol>
<li>Sluit een paar dagen voordat de eerste bloemen opengaan geselecteerde bomen in een gaskooi van 0,8 mm om de komst van bestuivende insecten te voorkomen.</li>
		<li>Wanneer 10%-20% bloemen open zijn, selecteert en labelt u verschillende takken per bestuivingsbehandeling, waardoor er 1.000-1.500 bloemen per behandeling overblijven.</li>
		<li>Bestuiving de volgende dag, wanneer de bloemen open zijn, elke bloem met behulp van een penseel met het bijbehorende stuifmeel (stuifmeel van dezelfde cultivar voor zelfbestuiving en van andere compatibele cultivars als kruisbestuivingscontrole).</li>
		<li>Bestuiving om de dag tot alle bloemen opengaan.</li>
		<li>Registreer wekelijkse tellingen van bloemen en het ontwikkelen van vruchten van anthese tot oogst om het fruitdruppelpatroon te karakteriseren en de uiteindelijke vruchtzetting in elke bestuivingsbehandeling te kwantificeren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Handbestuiving in het laboratorium
<ol><li>Verzamel 50-100 bloemen in stadium D24,volgens fase 57 op de BBCH schaal25,26.</li>
	<li>In het laboratorium 30 bloemen per behandeling emasculeren (zelf- en kruisbestuiving). OPMERKING: Emasculatie moet zorgvuldig worden uitgevoerd om schade aan de stampers te voorkomen.</li>
	<li>Maak een verse snee op de basis van elke bloem pedicure onder water voordat je het op een stuk nat bloemistschuim legt (één stuk schuim voor elke bestuivingsbehandeling).</li>
	<li>Bestuif elke stamper 24 uur later met de hand met behulp van een fijne verfkwast met eerder verzameld stuifmeel (zie rubriek 1.1). Bestuif een set stampers met stuifmeel van dezelfde cultivar en de andere set met stuifmeel van een compatibele cultivar als bestrijding.</li>
	<li>Laat de bestoven stampers 72 uur na bestuiving bij kamertemperatuur staan. Het steekschuim moet continu nat zijn met water.</li>
	<li>Bevestig de stampers gedurende ten minste 24 uur in een fixatieve oplossing van ethanol/azijnzuur (3:1) bij 4 °C. Vervang het fixeermiddel door 75% ethanol. Monsters kunnen in deze oplossing bij 4 °C worden bewaard tot gebruik27. OPMERKING: Zorg ervoor dat de monsters volledig in de oplossing zijn ondergedompeld.</li>
</ol>3. Microscopische waarnemingen
<ol><li>
Evaluatie van in vitro pollenkieming
	<ol>
<li>Om stuifmeelkiemmedium uit te werken, lost u 25 g sucrose op 250 ml gedestilleerd water op en voegt u vervolgens 0,075 g calciumnitraat [Ca(NO3)2] en 0,075 g boorzuur (H3BO3) toe.</li>
		<li>Voeg 2 g agar toe aan de oplossing en meng totdat het volledig is opgelost28.</li>
		<li>Om het medium te steriliseren, autoclaaf het bij 120 °C gedurende 20 minuten. Koel het medium af en verdeel, voordat het stolt, 3 ml per steriel petrischaaltje (55 mm x 12 mm) in een steriele laminaire stromingskap. Bewaar na medium stolling de petrischaaltjes gewikkeld in aluminiumfolie bij 4 °C tot gebruik.</li>
		<li>Verspreid het stuifmeel van elke cultivar die eerder als stuifmeeldonor werd gebruikt in de gecontroleerde bestuivingen in twee petrischalen en incubeer ze bij 25 °C gedurende 24 uur. OPMERKING: De geënte kweekmedia kunnen onmiddellijk daarna met microscopie worden waargenomen of tot gebruik bij -20 °C worden bewaard. Voor dit doel moeten de petrischalen 24 uur vóór microscopiewaarnemingen van de vriezer naar de koelkast worden vervangen.</li>
		<li>Om de stuifmeelkorrels te observeren, bereidt u 1% (v / v) anilineblauwe oplossing die eeltvlekken. Bereid eerst een 0,1 N kaliumfosfaat tribasisische (K3PO4) oplossing door 7,97 g K3PO4 op te lossen in 1.000 ml gedestilleerd water. Om de anilineblauwe oplossing van 1% (v/v) uit te werken, lost u 1 ml anilineblauw op in 100 ml 0,1 N K3PO4.</li>
		<li>Voeg 2-3 druppels anilineblauwe oplossing toe aan elke petrischaalplaat en observeer na 5 minuten onder een UV-epifluorescentiemicroscoop met behulp van exciterfilter BP340-390 en barrièrefilter LP425. Tel levensvatbare en niet-levensvatbare stuifmeelkorrels in drie velden per plaat, elk veld bevat 100-200 stuifmeelkorrels, in twee petrischalen voor elke cultivar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Groei pollenbuis
	<ol>
<li>Spoel de vaste stampers driemaal met gedestilleerd water (elk 1 uur, 3 uur in totaal) en breng gedurende 24 uur over op 5% (b/v) natriumsulfiet (Na2SO3) bij 4 °C. Om deze oplossing te bereiden, lost u 5 g natriumsulfiet op in 100 ml gedestilleerd water.</li>
		<li>Autoclaaf de stampers bij 120 °C gedurende 8 min in 5% (w/v) natriumsulfiet om de weefsels te verzachten.</li>
		<li>Pompoen verzachte stampers in een druppel van 1% (v/v) anilineblauwe oplossing onder een dekglas op een glijbaan om eelt te vlekken.</li>
		<li>Observeer de groei van stuifmeelbuizen langs de stijl onder een microscoop met UV-epifluorescentie met behulp van exciterfilter BP340-390 en barrièrefilter LP425.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Incompatibiliteitsrelaties bepalen
<ol><li>DNA-extractie uit bladeren<ol>
<li>Om DNA te extraheren, verzamelt u 3-4 jonge bladeren van elke cultivar in het veld, bij voorkeur in het voorjaar. OPMERKING: DNA kan ook worden geëxtraheerd uit volwassen bladeren, maar DNA van jonge bladeren heeft minder fenolische verbindingen.</li>
		<li>Isoleer DNA met behulp van een commerciële kit en volg de meegeleverde protocolkit (zie Tabel met materialen).</li>
		<li>Kwantificeer de DNA-concentratie en evalueer de kwaliteit van het DNA van elk monster bij 260 nm in een UV-Vis microvolumespectrofotometer. Stel de DNA-concentratie in op 10 ng/μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR-voorwaarden voor fragmentversterking<ol>
<li>Label 0,2 ml PCR-buizen en -doppen.</li>
		<li>Bereid de PCR-reagentia volgens tabel 1 en laat ze op ijs ontdooien.</li>
		<li>Stel een volume mastermix in van elk paar primers in een microbuis van 1,5 ml op basis van het aantal reacties plus 10% van het overschot, rekening houdend met een volume van 16 μL per reactie. Voeg de reagentia toe volgens de volgorde in tabel 1 en meng grondig.</li>
		<li>Aliquot 16 μL mastermix in elke 0,2 ml PCR-buis met 4 μL DNA-sjabloon of 4 μL gesteriliseerd gedestilleerd water als negatieve controle (C-). Gebruik DNA van cultivars met bekend genotype als positieve controles. Meng voorzichtig, sluit de reactiebuizen met de doppen en centrifueer bij 2.000 x g gedurende 30 s om het volledige volume aan de onderkant van de reactiebuis te verzamelen.</li>
		<li>Plaats de reactiebuizen in de thermocycler en stel het PCR-programma in met behulp van het volgende temperatuurprofiel: een eerste stap van 3 min bij 94 °C, 35 cycli van 1 min bij 94 °C, 1 min bij 56 °C en 3 min bij 72 °C, en een laatste stap van 7 min bij 72 °C20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elektroforese en schatting van de fragmentgrootte<ol>
<li>Om een 1,7% (w/v) agarose minigel te bereiden, lost u 0,68 g agarose en 40 ml 1x TBE-buffer op in een Erlenmeyer van 100 ml. Smelt de oplossing door verhitting in een magnetron op 600 W met intervallen van 30 s om koken te voorkomen.</li>
		<li>Laat de oplossing op de bank blijven om af te koelen en voeg vervolgens 3,5 μL nucleïnezuurkleuringsoplossing toe.</li>
		<li>Plaats de gelbak in de gietstandaard en plaats de geselecteerde kam in de gelvorm. Zorg ervoor dat u voldoende putten hebt voor elk PCR-product en elke DNA-ladder.</li>
		<li>Giet de agarose-oplossing in de gelvorm en laat deze afkoelen tot polymerisatie. Verwijder de kam van de gepolymeriseerde gel. Plaats de gel in het horizontale elektroforesesysteem met voldoende 1x TBE-buffer om het oppervlak van de gel te bedekken.</li>
		<li>Laad de eerste en laatste putjes met 2 μL van de DNA moleculaire gewichtsladder (1 kb DNA Ladder). Laad 3 μL van elk product van de PCR in de andere putten. Sluit de kamer, schakel de stroom in en voer de gel gedurende 30 minuten op 100 V.</li>
		<li>Observeer de gel onder UV-licht met behulp van een geldocumentatiesysteem. Gebruik de DNA-molecuulgewichtsladder om de grootte van het versterkte fragment te bepalen en vergelijk het met de positieve controles om de overeenkomstige allelen te identificeren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Monitoring van bloemdata
<ol><li>Monitor de fenologie van verschillende bomen van elke cultivar bij de bloei over verschillende jaren. Bepaal de lengte van de bloeiperiode van de eerste (ongeveer 5%) tot de laatste open bloemen (ongeveer 95%). Volledige bloei wordt overwogen wanneer ten minste 50% van de bloemen zich in stadium F24bevindt, volgens fase 65 op de BBCH-schaal25,26.</li>
	<li>Om de bloeidata van intercompatibele cultivars te vergelijken en die te bepalen die elk jaar in bloeitijd samenvallen, werkt u een kalender van bloeitijden uit met gegevens van meerdere jaren.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hierin beschreven methodologie voor bestuivingsvereisten van Japanse pruimencultivars vereist het bepalen van de zelf-(in)compatibiliteit van elke cultivar door gecontroleerde bestuivingen in het veld of het laboratorium, en de daaropvolgende observatie van pollenbuisgroei met fluorescentiemicroscopie. De incompatibiliteitsrelaties worden vastgesteld door de karakterisering van de S-allelen door moleculaire genotypering. Ten slotte wordt de selectie van bestuivers uitgevoerd door de monitoringfenologie om die...

Japanse pruim(Prunus salicina Lindl.) is inheems in China1. In de19e eeuw werd dit gewas vanuit Japan naar de Verenigde Staten geïntroduceerd, waar het werd gekruist met andere Noord-Amerikaanse diploïde pruimen2. In de 20e eeuw werden sommige van deze hybriden verspreid naar gematigdestreken over de hele wereld. Tegenwoordig verwijst de term "Japanse pruim" naar een breed scala aan interspecifieke hybriden afgeleid van kruisingen tussen de oorspronkelijke P. salicina met maximaal 15 andere diploïde Prunus spp.3,4,5.
Japanse pruim vertoont, net als andere soorten van de Rosaceae-familie, Gametophytic Self-Incompatibility (GSI), die wordt gecontroleerd door een enkele en zeer polymorfe S-locusmet meerdere allelen6. De S-locus bevat twee genen die coderen voor een ribonuclease (S-RNase) uitgedrukt in de stamper, en een F-box eiwit (SFB) uitgedrukt in de stuifmeelkorrel7. In de zelfincompatibiliteitsreactie, wanneer het S-alleluitgedrukt in de stuifmeelkorrel (haploïde) hetzelfde is als een van de twee uitgedrukt in de stamper (diploïde), wordt de groei van de stuifmeelbuis over de stijl gestopt als gevolg van de afbraak van het pollenbuis-RNA door de werking van de S-RNase8. Omdat dit proces bevruchting van de vrouwelijke gametofyt in de eicel voorkomt, bevordert GSI de kruising tussen cultivars.
Hoewel sommige Japanse pruimencultivars zelfcompatibel zijn, zijn de meeste cultivars die momenteel worden gekweekt zelfcompatibel en hebben ze stuifmeel van intercompatibele donoren nodig om hun bloemen te bevruchten3. In steenfruitsoorten van het geslacht Prunus zoals amandel9,abrikoos10,11,12 en zoetekers 13kunnen bestuivingsvereisten van cultivars door verschillende benaderingen worden vastgesteld. Zelf-(in)compatibiliteit kan worden bepaald door zelfbestuiving van bloemen in het veld en daaropvolgende monitoring van vruchtzetting, of door semi-in vivo zelfbestuivingen onder gecontroleerde omstandigheden in een laboratorium en de observatie van stuifmeelbuizen onder de microscoop14,15,16,17,18 . Incompatibiliteitsrelaties tussen cultivars kunnen worden bepaald door kruisbestuivingen in het veld of in het laboratorium met behulp van stuifmeel van de potentiële bestuivercultivar, en door de identificatie van S-allelen van elke cultivar door PCR-analyse14,15,16,19,20,21,22 . Bij soorten zoals zoete kers of amandel kan zelf-(in)compatibiliteit ook worden beoordeeld door de identificatie van bepaalde S-allelen geassocieerd met zelfcompatibiliteit, zoals S4' in zoetekers 13 of Sf in amandel23.
Verschillende pruimenveredelingsprogramma's uit de belangrijkste producerende landen brengen een aantal nieuwe cultivars2,14uit,waarvan vele met onbekende bestuivingsvereisten. In dit werk wordt een methodologie beschreven voor de bepaling van bestuivingsvereisten in Japanse pruim-type hybriden. Zelf-(in)compatibiliteit wordt bepaald door zelfbestuivingen in zowel het veld als het laboratorium, gevolgd door observaties van pollenbuizen onder de fluorescentiemicroscopie. Selectie van bestuivercultivars combineert de identificatie van S-genotypen door PCR-analyse met de monitoring van de bloeitijd in het veld.

<table><tbody><tr><td>Azijnzuur Glacial</td><td>Panreac</td><td>131008.1611</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>25999</td><td></td></tr><tr><td>Anilineblauw</td><td>Difco</td><td>8504-88</td><td></td></tr><tr><td>Boorzuur (H3BO4)</td><td>Panreac</td><td>131015.1210</td><td></td></tr><tr><td>Calciumnitraat 4-hydraat (Ca(NO3)2&middot;4H2O)</td><td>Panreac</td><td>131231.1211</td><td></td></tr><tr><td>Dekglaasje</td><td>Deltalab</td><td>D102460</td><td>24 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>Digitale Camera</td><td>Imaging Developmet Systems</td><td>UI-1490SE</td><td></td></tr><tr><td>Digitale Camera Software Suite</td><td>Imaging Developmet Systems</td><td>4.93.0.</td><td></td></tr><tr><td>DNA Oligos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix, 10 mM elk</td><td>ThermoSischer Scientific</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green DNA polymerase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0713</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96&deg;</td><td>VWR-Chemicals</td><td>83804.360</td><td></td></tr><tr><td>1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb)</td><td>Invitrogen</td><td>15615-016</td><td>Size: 250&micro;g; Conc: 1.0 &micro;g/&micro;l</td></tr><tr><td>Gel Documentatie Systeem</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>Handteller</td><td>Tamaco</td><td>TM-4</td><td></td></tr><tr><td>Image Lab Software</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Image Analyse Systeem voor Gel Documentatie Systeem</td></tr><tr><td>MetaPhor Agarose</td><td>Lonza</td><td>50180</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5415 R</td><td>Eppendorf</td><td>Z605212</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop met UV epifluorescentie</td><td>Leica</td><td>DM2500</td><td>Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425</td></tr><tr><td>Microslides</td><td>Deltalab</td><td>D100004</td><td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>Mini Electroforese Systeem</td><td>Fisherbrand</td><td>14955170</td><td></td></tr><tr><td>Minicentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15334204</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrofotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND1000</td><td></td></tr><tr><td>Petri Schaaltjes</td><td>Deltalab</td><td>200201</td><td>55 mm x 14 mm</td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat Tribasic (K3PO4&middot;1.5H2O)</td><td>Panreac</td><td>141513</td><td></td></tr><tr><td>Primer voorwaarts 'Pru C2'</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer voorwaarts Pru T2'</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer reverse 'PCER'</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RedSafe Nucleïnezuur Kleuring Oplossing</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>21141</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Panreac</td><td>131621.1211</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsulfiet watervrij (Na2SO3)</td><td>Panreac</td><td>131717.1211</td><td></td></tr><tr><td>Speedtools plant DNA extractie Kit</td><td>Biotools</td><td>21272</td><td></td></tr><tr><td>TBE Buffer (10X)</td><td>Panreac</td><td>A0972,5000PE</td><td></td></tr><tr><td>Thermische Cycler T100</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>T1317</td><td></td></tr><tr><td>Verticale Autoclaaf Presoclave II</td><td>JP Selecta</td><td>4001725</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisherbrand</td><td>11746744</td><td></td></tr></tbody></table>

het vaststellen van bestuivingsvereisten in japanse pruim door fenologische monitoring, handbestuivingen, fluorescentiemicroscopie en moleculaire genotypering

Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping

De Japanse pruimencultivars die gewoonlijk worden gekweekt, zijn interspecifieke hybriden die zijn afgeleid van kruisingen tussen de oorspronkelijke Prunus salicina met andere Prunus-soorten. De meeste hybriden vertonen gametofytische zelfincompatibiliteit, die wordt bestuurd door een enkele en zeer polymorfe S-locus die meerdere allelen bevat. De meeste gekweekte hybriden zijn zelfincompatibel en hebben stuifmeel van een compatibele donor nodig om hun bloemen te bevruchten. Het vaststellen van bestuivingseisen bij Japanse pruimen wordt steeds belangrijker door het grote aantal nieuwe cultivars met onbekende bestuivingseisen. In dit werk wordt een methodologie beschreven voor de bepaling van bestuivingsvereisten in Japanse pruim-type hybriden. Zelf-(in)compatibiliteit wordt bepaald door handbestuivingen in zowel het veld als in het laboratorium, gevolgd door het monitoren van pollenbuisverlenging met fluorescentiemicroscopie en ook het monitoren van de fruitrijping in het veld. Selectie van bestuivercultivars wordt beoordeeld door de identificatie van S-genotypen door PCR-analyse te combineren met de monitoring van de bloeitijd in het veld. Het kennen van de bestuivingsvereisten van cultivars vergemakkelijkt de selectie van cultivars voor het ontwerp van nieuwe boomgaarden en maakt de vroege detectie van productiviteitsproblemen in verband met bestuivingstekort in gevestigde boomgaarden mogelijk.

Elke Japanse pruimenbloemknop bevat een bloeiwijze met 1-3 bloemen. Net als bij andere steenvruchtensoorten bestaat elke bloem uit vier kransen: carpel, meeldraden, bloemblaadjes en kelkbladen, die zijn samengesmolten tot een beker aan de basis van de bloem. Bloemstructuren zijn kleiner dan andere steenvruchten, met een korte en fragiele stamper omringd door de meeldraden die een kleine hoeveelheid stuifmeelkorrels bevatten. Bij volle bloei lijken de bloemen van elke bloeiwijze gescheiden op korte stengels, met de witte ...

Een methodologie voor de bepaling van bestuivingsvereisten in Japanse pruimentype hybriden wordt beschreven, die veld- en laboratoriumbestuivingen en waarnemingen van pollenbuizen onder de fluorescentiemicroscopie combineert met de identificatie van S-genotypen door PCR en de monitoring van de bloei voor de selectie van bestuiver.

Het vaststellen van bestuivingsvereisten in Japanse pruim door fenologische monitoring, handbestuivingen, fluorescentiemicroscopie en moleculaire genotypering

The Japanese plum cultivars commonly grown are interspecific hybrids derived from crosses between the original Prunus salicina with other Prunus species. ...

Dit protocol wordt steeds belangrijker vanwege het hoge aantal nieuwe zelf-incompatible Japanse pruimenrassen met onbekende bestuivingsvereisten. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de bepaling van de bestuivingsvereisten van cultivars mogelijk maakt door twee complementaire benaderingen te combineren in veld- en laboratoriumomstandigheden. Deze aanpak kan ook worden toegepast om bestuivingsvereisten en andere zelf-incompatible vruchtbomen zoals abrikoos of zoete kers te bepalen.Voor pollenextractie, verzamel bloemknoppen in de ballonfase volgens stadium 57 op de BBCH-schaal. Verwijder de meeldraden met een plastic gaas en plaats ze op papier bij kamertemperatuur gedurende 24 uur tot de meeldraden openspringen. Zeef de pollenkorrels door een fijn gaas en bewaar ze in een glasbuisje van 10 millimeter met een dop op vier graden Celsius tot gebruik.Wanneer 10 tot 20%van de bloemen open staan, selecteer en label verschillende takken, waarbij 1.000 tot 1.500 bloemen per bestuivingsbehandeling worden achtergelaten. De volgende dag, wanneer meer bloemen open staan, bestuif elke bloem met een penseel met pollen van hetzelfde ras voor zelfbestuiving en pollen van andere rassen als controle voor kruisbestuiving. Bestuif elke dag tot alle bloemen open staan.Noteer wekelijkse tellingen van bloemen en zich ontwikkelende vruchten van anthesis tot oogst om het fruitvalpatroon te karakteriseren en de uiteindelijke vruchtaanzet in elke bestuivingsbehandeling te kwantificeren. Verzamel 50 tot 100 bloemen in de ballonfase volgens stadium 57 op de BBCH-schaal. Emasculeer 30 bloemen per behandeling in het laboratorium voor zelf- en kruisbestuiving.Maak een verse snede aan de basis van elke bloemsteel onder water en plaats deze op een stukje natte bloemistenschuim. Gebruik een stuk schuim voor elke bestuivingsbehandeling. Na 24 uur bestuif elk stamper met het eerder verzamelde pollen met een fijn penseeltje.Bestuif een set stampers met pollen van hetzelfde ras en de andere set met pollen van een ander compatibel ras als controle. Fixeer deze bestoven stampers in een fixeeroplossing van ethanol en azijnzuur gedurende ten minste 24 uur bij vier graden Celsius. Verdeel het pollen van elke cultivar die eerder werd gebruikt als pollendonor in de bestuivingen in twee Petri-schotels en incubeer ze gedurende 24 uur bij 25 graden Celsius.Om de pollenkorrels te observeren, voeg twee tot drie druppels anilineblauw oplossing toe aan elke Petri-schaal en observeer ze na vijf minuten onder een UV-epifluorescentiemicroscoop. Tel levensvatbare en niet-levensvatbare pollenkorrels in de drie velden per Petri-schaal met elk veld ongeveer 100 tot 200 pollenkorrels in twee Petri-schotels voor elke cultivar. Om de pollenbuisjes te observeren, vermaal verzachte stampers in een druppel 1% anilineblauw oplossing onder een dekglas op een dia.Observeer de groei van de pollenbuisjes langs de stijl onder een microscoop met UV-epifluorescentie met behulp van exciterfilter BP340-390 en barrièrefilter LP425. Verzamel drie tot vier jonge bladeren van elke cultivar in het veld en extraheer DNA uit de bladeren. Stel een mastermix op voor elk paar primers in 1,5 milliliter microbuisjes.Voeg alle reagentia toe en meng grondig. Pipetteer 16 microliter van deze mastermix in elke 200 microliter PCR-buis met vier microliter DNA-sjabloon of controle. Meng ze voorzichtig, sluit de doppen en centrifugeer 2.000 keer G gedurende 30 seconden.Plaats de buis in de thermocycler en voer het PCR-programma uit zoals vermeld in het tekstmanuscript. Voor het schatten van de fragmentgrootte door gelelektroforese, laad de eerste en laatste putten met twee microliter van de DNA-ladder en drie microliter van het PCR-product in de andere putten. Sluit de kamer en laat de gel 30 minuten bij 100 volt lopen.Observeer de gel onder UV-licht met behulp van een gelbeeldsysteem. Gebruik de DNA-ladder om de grootte van de versterkte fragmenten te schatten en vergelijk deze met de positieve en negatieve controles. Volg de fenologie van verschillende bomen van elke cultivar over verschillende jaren van bloei.Stel de lengte van de bloeiperiode vast van de eerste tot de laatste open bloemen. Volledige bloei wordt beschouwd wanneer ten minste 50%van de bloemen zich in stadium F bevindt volgens stadium 65 op de BBCH. Het patroon van fruitval van handbestoven bloemen na emasculatie of aanvullende bestuiving toonde aan dat de meeste bloemen twee tot drie weken na bestuiving vielen, maar 4%van de zelfbestoven bloemen bleven in de boom, wat aangeeft dat dit ras zelf-compatibel is.Levensvatbare pollenkorrels vertoonden een pollenbuis langer dan de lengte na 24 uur in het kweekmedium en niet-levensvatbare pollenkorrels ontkiemden niet. Tijdens de bestuiving werden pollenkorrels overgebracht naar de stijl. Elke ontkiemende pollenkorrel produceerde een pollenbuis, die door de stijlstructuren groeide.Bij zelfincompatible cultivars stopte de pollenbuis met groeien in de bovenste derde van de stijl. Bij zelf-compatibele cultivars kon de pollenbuis echter door de stijl groeien, de eierstok bereiken en een eicel bevruchten. PCR-analyse werd uitgevoerd met behulp van primers van de geconserveerde regio's van sRNA's van zoete kers en Japanse pruim, waardoor het mogelijk werd om de grootte van S-allelen in elk ras te bepalen.De lengte van de bloeiperiode voor een totaal van vier jaar werd berekend. Bloei onder boomgaardsomstandigheden maakte het mogelijk om vast te stellen welke cultivars elk jaar gelijktijdig bloeien. Bij het uitvoeren van dit protocol, zorg ervoor om een hoger aantal bloemen van Japanse pruim te gebruiken voor handbestuivingen, aangezien het percentage vruchtaanzet erg laag is in vergelijking met andere Prunus-soorten.Het is niet mogelijk om zelfincompatibiliteit te bepalen door moleculaire benaderingen. Verder werk aan S-allel-sequencing is vereist om te beoordelen of sommige S-allelen geassocieerd zijn met zelfcompatibelheid. De combinatie van veld

establishing-pollination-requirements-japanese-plum-phenological

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We hebben een methode voor het uitvoeren van kruisen in Setaria viridis (S. viridis) ontwikkeld. Bij deze methode wordt het snoeien van de pluim voorafgaand aan een warm water behandeling om levensvatbare pollen doden. Kruisen worden uitgevoerd na een goed gecontroleerde groei regime en meestal tot gevolg dat het herstel van 1-7 kruisbestuiving zaad / s per pluim.

Methoden voor het uitvoeren van Kruisen in<em&gt; Setaria viridis</em&gt;, Een Nieuw Model Systeem voor de Grassen

Bestuiver de effectiviteit van een bepaalde plantensoort openbaren, zijn meerdere methoden veldexperimenten ontwikkeld. Deze studie toont de fundamentele methoden van veldexperimenten voor bestuiving ecologie gebruik van de case study van Lycoris sanguinea var. Sanguinea en de roman bestuiving mechanisme, het breken-knop bestuiving.

Veldexperimenten van Bestuiving Ecologie: De zaak van<em&gt; Lycoris sanguinea</em&gt; Var.<em&gt; sanguinea</em

Hier presenteren we een protocol om te dwingen bloei in mandarin bomen onder Fytotron omstandigheden. Water stress, hoge verlichtingssterkte en een gesimuleerde voorjaar fotoperiode toegestaan levensvatbare bloemen kunnen worden verkregen in een korte periode van tijd. Deze methodologie kan onderzoekers hebben meerdere bloei-perioden in 1 jaar.

Gedwongen bloei in Mandarin bomen onder Fytotron voorwaarden

We demonstreren een methode om de succesvolle of mislukte bevruchting te bepalen op basis van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting met behulp van een epifluorescentie Microscoop.

Evaluatie van de bemesting staat door het traceren van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting

We presenteren een methodologie om de bestuivingsvereisten van abrikoos(Prunus armeniëca L.) cultivars vast te stellen die de bepaling van zelf-(in)compatibiliteit door fluorescentiemicroscopie combineren met de identificatie van het S-genotype door PCR-analyse.

Bepaling van zelf- en inter-(in)compatibiliteitsrelaties in abrikoos die handbestuiving, microscopie en genetische analyses combineren

Dit protocol biedt een snelle methode voor het bepalen van stuifmeelcompatibiliteit en incompatibiliteit in citruscultivars.

Bepaling van zelf-(in)compatibiliteit en inter-(in)compatibiliteitsrelaties in citrusvruchten met behulp van handmatige bestuiving, microscopie en S-genotype-analyses

Hier beschrijven we een verbetering van de semi-in vitro (SIV) methode voor het observeren van pollenbuisgeleiding en -ontvangst in Arabidopsis thaliana, die de ontvankelijkheid van eitjes verhoogt. De high-throughput SIV cum septum-methode kan worden gekoppeld aan gametofytmarkerlijnen en genetisch gecodeerde biosensoren om het dynamische proces van bevruchting te volgen.

Live beeldvorming van Arabidopsis pollenbuisontvangst en dubbele bevruchting met behulp van de semi-in vitro cum septum methode

Een verbeterde methode om pollenhydratatieprofielen in Arabidopsis thaliana te meten wordt hier beschreven. De nieuwe methode biedt een hogere resolutie, is niet-invasief en is zeer reproduceerbaar. Het protocol vertegenwoordigt een nieuw hulpmiddel voor een fijnere ontleding van de processen die de vroege stadia van bestuiving reguleren.

Een hoge resolutie, enkelkorrelig, in vivo pollenhydratatiebioassay voor Arabidopsis thaliana

Eiwitniveaus in cellen en weefsels vaak zijn gereguleerd door het evenwicht van eiwitproductie en klaring. Met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP), kan de klaringskinetiek van eiwitten experimenteel worden gemeten in vivo.

Meten Eiwit Stabiliteit in Living zebravis embryo&#39;s met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP)

Om het mechanisme van lipidenbeschikbaarheid in dooierzakmembranen tijdens de late stadia van embryonale ontwikkeling van vogels te bestuderen, hebben we een primaire Japanse kwartelembryonale endoderm epitheliale celkweeksysteem opgezet.

Primaire endodermale epitheelcellen Cultuur van de dooierzak membraan van de Japanse kwartel embryo

Ontdek hoe je bestuivingsvereisten in Japanse pruim bepaalt door fenologische monitoring, handbestuivingen, fluorescentiemicroscopie en moleculaire genotypering toe te passen.

Het vaststellen van bestuivingsvereisten in Japanse pruim door fenologische monitoring, handbestuivingen, fluorescentiemicroscopie en moleculaire genotypering (Video) | JoVE Journal

Het vaststellen van bestuivingsvereisten in Japanse pruim door fenologische monitoring, handbestuivingen, fluorescentiemicroscopie en moleculaire genotypering

Meer video's verkennen