Time-Resolved Fluorescentie Beeldvorming en analyse van kankercelinvasie in het 3D Spheroid Model

Dit protocol kan worden gebruikt om de mechanismen voor de invasie van kankercellen in de extracellulaire matrix in realtime te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudig sferoïde beeldvormingsapparaat gebruikt, waardoor de sferoïde invasietest gemakkelijker is in te stellen en de efficiëntie en kosten ervan verbetert. Terwijl we demonstreren met behulp van de sferoïde invasietest om mammacarcinoom te modelleren, is deze test een uitstekend model voor de invasie van een solide tumor in het omringende gezonde weefsel.

Na 3D-printen van de afstandsmeter, weegt u een verhouding van 10:1 van basispolymeer tot kruis-linker in een plastic beker en gebruikt u een wegwerppipet om de resulterende PDMS-oplossing grondig in de beker te mengen. Plaats de beker in een vacuümkamer en laat snel de vacuümdruk los om alle lucht te verwijderen die aan het oppervlak van het mengsel is opgesloten en om de resterende luchtbellen te verwijderen. Incubeer de 3D-geprinte afstandsruimte gedurende vijf minuten op 100 graden Celsius om de flexibiliteit te vergroten en twee glasplaten schoon te maken met 100% isopropanol.

Plaats de afstandcrère zo dat deze vlak tussen de twee gereinigde platen staat en plaats twee grote bindclips aan de onderrand en één op de bovenhoek om de mal op de buitenranden van de platen af te dichten. Inspecteer het bovenste deel van de mal om ervoor te zorgen dat de afstandsbalk gelijk is met de glasplaten en gebruik een wegwerppipet met ongeveer twee centimeter uit de punt gesneden om het PDMS-mengsel langzaam maar continu toe te voegen aan de linkerbovenhoek van de mal. Wanneer de hele mal is gevuld, plaatst u de mal in de vacuümkamer om eventuele gevormde luchtbellen te verwijderen, voordat u het PDMS een uur lang uithard bij 100 graden Celsius.

Plaats de mal aan het einde van de incubatie op kamertemperatuur. Wanneer het koel is om aan te raken, verwijdert u de bindmiddelclips en glasplaten van de afstandhouder met het uitgeharde PDMS en gebruikt u een scheermesje om door de afdichting te snijden die aan alle vier de zijden van de mal tussen de afstandhouder en de glasplaat is gemaakt. Trek de mal uit elkaar om het PDMS-blad in de afstandsregelaar te onthullen en gebruik een pincet om het PDMS-blad voorzichtig van de afstandsregelaar te pellen.

Plaats het vel op een snijmat en gebruik een biopsiepons om een PDMS-schijf met een diameter van 17,5 millimeter uit te ponsen en vervolgens drie gelijkmatig verdeelde gaten van 5,5 millimeter in de schijf te ponsen. Gebruik tape om stofdeeltjes van elk inzetstuk te verwijderen en plak de gereinigde inzetstukken op een stuk dubbelzijdige tape. Wikkel de tape om het deksel van een Petri-schaal van 10 centimeter en plaats het deksel in een plasmamachine samen met open 35 millimeter glazen bodemschotels.

Activeer de inzetstukken en het glas met één minuut plasmabehandeling bij 300 millitorrs en gebruik een pincet om de behandelde kant van elk inzetstuk snel aan het glazen deel van één behandelde glazen bodemschaal per inzetstuk te bevestigen. Wanneer alle inzetstukken zijn aangebracht, gebruikt u de aanwijzervinger en duim om gelijkmatige druk uit te oefenen op elke insert terwijl u de schotel draait om de inzetstukken stevig aan de schotels te bevestigen. Wanneer alle inserts zijn vastgezet, moet u de resulterende sferoïde beeldvormingsapparaten gedurende 20 minuten bij 60 graden Celsius incuberen, voordat u een tweede ronde plasmabehandeling uitvoert zoals aangetoond.

Voeg na de tweede behandeling 35 microliter vers bereide coatingoplossing toe aan elk inzetgat. Verwijder na een uur op kamertemperatuur de coatingoplossing en spoel het apparaat drie keer af met gedestilleerd water. Voeg na de laatste wasbeurt 35 microliters kruisverglinkende oplossing toe aan elk gat voor een incubatie van 30 minuten bij kamertemperatuur.

Spoel het apparaat aan het einde van de incubatie drie keer met gedestilleerd water zoals aangetoond, voordat u elk apparaat vult met 70% ethanol gedurende een incubatie van 30 minuten onder UV-licht. Spoel de apparaten aan het einde van de sterilisatie drie keer met gedestilleerd water en voeg aan elk apparaat 2,5 milliliter opslagoplossing toe. Om de sferoïden in collageen te verankeren, wast u de apparaten drie keer met drie milliliter PBS per wasbeurt.

Laat de apparaten na de laatste wasbeurt volledig drogen, voordat u één sferoïde toevoegt in 30 microliters vers bereide college één oplossing in één gat van het inzetstuk en een timer start. Voeg na bevestiging van de aanwezigheid van de sferoïde in het gat sferoïden toe aan de andere twee gaten zoals aangetoond. Gebruik een pipettip van 10 microliter om sferoïden die zich dicht bij de PDMS-rand bevinden te recenter te maken, of om de sferoïden te scheiden als er meerdere sferoïden worden afgegeven en stop de timer.

Om de sferoïde verticaal in de collageenlaag te centreren, draait u het apparaat na het zaaien ondersteboven en incubeert u het apparaat op 37 graden totdat het collageen polymeriseert, waarbij de oriëntatie van het apparaat elke twee minuten gedurende in totaal 30 minuten wordt omgekeerd, voeg vervolgens 2,5 milliliter medium per apparaat toe en verkrijg een afbeelding van de sferoïden op het tijdspunt van nul uur. Het gebruik van een sferoïde beeldapparaat vergemakkelijkt de efficiënte inbedding en time-lapse-registratie van kankercelinvasie in het collageen of via longitudinale beeldvorming. Hoewel deze sferoïde in de loop van zes dagen in de lengterichting in beeld werd gegeven en de stabiele expressie van cytoplasmatische en/of nucleaire fluorescerende eiwitten vereist, kan vergelijkbare longitudinale beeldvorming over een kortere periode worden uitgevoerd met behulp van kleurstofetikettering.

Sferoïden kunnen ook worden bevestigd en immunolabeld. Deze sferoïden werden bijvoorbeeld immunolabeld voor epitheel-cadherine, cortactine en F-actine. In deze afbeeldingen kan een stapsgewijze illustratie van de beeldverwerkingsprocedure worden waargenomen met behulp van de Fiji-macro om het gebied van de sferoïde in de loop van de tijd te meten.

Zorg ervoor dat u één sferoïde in elk gat van het sferoïde beeldvormingsapparaat uitdeelt en de sferoïde in het midden van het gat in zowel XY- als Z-richtingen plaatst. Het apparaatontwerp kan eenvoudig worden gewijzigd door de grootte en opstelling van de gaten, inzetstukken en glazen bodemschotels te wijzigen om een hogere sferoïde doorvoer te huisvesten.