Een verbeterde test en tools voor het meten van mechanische nociceptie in Drosophila-larven

Dit protocol is belangrijk omdat het de gebruiker in staat stelt een hulpmiddel te bouwen dat kan worden gebruikt om mechanische nociceptie-reacties in genetisch hanteerbare Drosophila-larven nauwkeurig te meten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudige materialen gebruikt om aangepaste hulpmiddelen te bouwen die kunnen worden gebruikt om mechanische nociceptie te meten van de subdrempel tot volledig responsief bereik. Deze hulpmiddelen en methoden kunnen worden gebruikt om basale mechanische nociceptie en nociceptieve sensitisatie na verwonding of ziekte te meten.

Het onderzoeken van larven met aangepaste filamenten vereist oefening. Gebruikers moeten in staat zijn om dosis-responscurven te genereren met controlelarven voordat ze een experiment proberen. Om een mechanische sonde te construeren, gebruikt u een kleine draadsnijder om elk Nitinol-filament loodrecht op de lange as op de opgegeven lengte te knippen.

De filamenten zijn verkrijgbaar in drie verschillende vooraf ingestelde diameters. Onderzoek de punt van de filamenten onder een stereomicroscoop om er zeker van te zijn dat er geen scherpe of onregelmatige randen aanwezig zijn die weefselschade aan de larvenvacht kunnen veroorzaken en de kalibratie kunnen verstoren. Gebruik vervolgens een slijpsteen om de randen van de sonde handmatig glad te maken totdat er geen scherpe onregelmatigheden meer aanwezig zijn.

Gebruik vervolgens een hypodermische naald om een gat dicht bij het uiteinde van een houten Popsicle-stick te prikken. Breng houtlijm aan op een enkele Nitinol-draad en steek de met lijm beklede draad in de naaldgleuf. Wanneer de lijm is opgedroogd, drukt u de sonde tegen de schaal totdat de sonde buigt om de maximale kracht die in grammen kan worden geregistreerd te bepalen.

Gebruik de formule om de geregistreerde massa om te zetten in kracht in millinewton. Deel vervolgens de gemeten kracht door de oppervlakte van de punt van het filament om de berekende kracht om te zetten in kilopascals druk. Het voorbereiden van meerdere sondes met filamenten van verschillende diameters en lengtes genereert een volledige set, die het responsieve bereik voor Drosophila-larven beslaat.

Om Drosophila-larven voor te bereiden op een experiment, kweekt u de larvale nakomelingen op standaardvoedsel in een incubator van 25 graden Celsius gedurende ongeveer 96 uur. Wanneer de larven het derde larvenstadium bereiken, bereidt u een plug vliegvoer in een kleine petrischaal voor larven om te worden getest en gebruikt u een pincet om voorzichtig de middelgrote midden-derde larven te sorteren van de kleinere tweede en vroege derde en de grotere late of dwaaierige derde larven. Gebruik vervolgens het pincet om 20 tot 30 midden-derde larven over te brengen naar een kleine petrischaal met een kleine plug vliegvoer, bevochtigd met water op kamertemperatuur.

Om een mechanische nociceptie-assay uit te voeren, gebruikt u een pincet om een midden-derde larve op een donkere dunne vinylpad onder een Brightfield stereomicroscoop te plaatsen en rangschikt u optische vezelverlichting tussen de microscoopobjectieven en de pad. Gebruik een papieren handdoek om eventueel overtollig water rond de larve weg te vegen en beweeg de pad om het hoofd en de mond van de larve naar de niet-dominante hand van de onderzoeker te richten. Selecteer een mechanische sonde en breng de sonde aan op de achterste dorsale kant van de larve bij ongeveer het buiksegment A8 gedurende één tot twee seconden, waarbij de larve voorzichtig in de onderliggende pad wordt gecomprimeerd op het punt van sondecontact totdat de sonde buigt en de eerder gemeten hoeveelheid druk opwekt.

Een positieve nociceptieve respons wordt aangegeven als de larve binnen drie seconden een complete kurkscrewrol van 360 graden langs de as van zijn lichaam vertoont. Registreer de gedragsrespons voor elke larve. Gooi vervolgens de geteste larve weg en bereid de volgende larve voor op de test.

Deze aangepaste mechanische sondes met Nitinol-filamenten kunnen worden gebruikt om mechanisch uitgelokte gedragingen op te roepen en om een volledige gedragsdosis-responscurve te genereren met behulp van zowel onschadelijke als schadelijke mechanische sondes van verschillende intensiteit. Zoals deze gedragstestresultaten aantonen, roepen sondes die een druk van 200 kilopascal of minder uitoefenen geen aversieve rolreactie op bij Drosophila-larven. Zoals verwacht, veroorzaken deze subdrempel of niet-schadelijke mechanische sondes geen zichtbare schade aan neuronaal weefsel.

Omgekeerd roepen superdrempel of schadelijke sondes een versterkte gedragsrespons op, evenals weefselschade aan de perifere sensorische neuronen zelf op een dosisafhankelijke manier. Deze sondes kunnen ook worden gebruikt om mechanische overgevoeligheid na verwonding te meten. Ongeveer 20% van de larven reageert met aversieve rol zo vroeg als twee uur na UV-behandeling, terwijl 50% reageerde na vier uur in vergelijking met bespotten UV-bestraalde dieren.

Omdat de sonde die voor deze analyse werd gebruikt een normaal subdrempel van 200 kilopascal was, werd deze respons beschouwd als mechanische allodynie. Op latere tijdstippen is de gedragsrespons van de UV-behandelde larven licht verhoogd, maar statistisch niet verschillend van die van de mock-bestraalde controlegroep. Larven die werden onderzocht met een 462 kilopascal-sonde op vier, acht en 16 uur na UV-behandeling, vertoonden een significante toename van de aversieve rolreactie, waarbij vier uur het hoogtepunt van de gedragsovergevoeligheid was, aangezien de stimulus aanvankelijk schadelijk was.

De respons werd beschouwd als mechanische hyperalgesie. De voorbereiding van de sonde en de selectie en compressie van de larve zijn cruciaal voor het succes van het proces. Met behulp van deze sondes kunnen de basale nociceptie en mechanische nociceptieve overgevoeligheid worden gemeten na verwonding.

Met behulp van deze hulpmiddelen en het assay kunnen de moleculaire en genetische basis van mechanische nociceptie en nociceptieve overgevoeligheid worden gemeten in het genetisch hanteerbare Drosophila-model.