High-Throughput Metabole Profilering voor Modelverfijningen van Microalgen

De fenotype micro-array technologie is een effectieve high-throughput methode die functioneel cellulaire metabole activiteiten bepaalt als reactie op een breed scala aan entry metabolieten. Het gebruik in deze technologie wordt gemeten in de vorm van cellulaire ademhaling bepaald door de hoeveelheid kleurontwikkeling geproduceerd door de NADH-reductie van een op tetrazolium gebaseerde redoxkleurstof. In dit werk zullen we het gebruik van fenotype micro array assays introduceren in de context van micro-algen met behulp van modelsoort Chlamydomonas reinhardtii.

Het doel van deze studie is om een betrouwbare methode vast te stellen voor het karakteriseren van metabole fenotypering van micro-algen die kan worden gebruikt om bestaande algen metabole netwerkmodellen uit te breiden of de reconstructie van nieuwe modellen te begeleiden. Chlamydomonas reinhardtii stam CC-503 kan worden verkregen bij het Chlamydomonas resource center aan de Universiteit van Minnesota USA. Laat de cellen groeien in verse Tris-acetaatfosfaat vetmedia tot halverwege de logfase.

Controleer de cellen onder de microscoop om er zeker van te zijn dat ze in goede staat zijn en zonder enige besmetting. Draai de cultuur op 2000 G-kracht gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren.

Bereid verse tapmedia met 0,1% tetrazolium violette kleurstof D"Voeg verschillende antibiotica, waaronder Timentin, Ampicilline en Kanamycine toe aan de media om de bacteriegroei te remmen. Vetmedia en deze stap moeten worden weggelaten uit voedingsstoffen, afhankelijk van elk plaattype. Suspensie van de pellet en de verse tapmedia tot een eindconcentratie van 1 miljoen cellen per milliliter.

Gebruik chemische samengestelde array-testplaten, zoals koolstofbronnen, stikstofbronnen, fosfor- en zwavelbronnenplaten en de peptidestikstofbronnen. Ent 100 microliter voldoende zelfbevattende media in elke put van de essayplaten. Zorg ervoor dat u de testen dupliceert.

Opgemerkt moet worden dat in dit stadium cellen moeten worden getest met gramnegatieve kleuring voor en na de test om bacteriële besmetting te controleren. Plaats de testplaten van het chemische verbindingsgebied in het microplaatlezersysteem. Incubeer alle platen op 30 graden gedurende maximaal zeven dagen en programmeer het microplaatlezersysteem om elke 15 minuten de kleurstofverandering te lezen.

Omdat de meeste microplaatlezers tijdens de incubatie geen bron van continu licht bieden, moeten de algen heterotrofe ademhaling kunnen uitvoeren. Exporteer de ruwe kinetische gegevens van de microplaatlezer als CSV-bestanden, die vervolgens worden gebruikt als invoer voor het fenotype microarray-softwarepakket en onze software. Om de fenotype microarray data analyse uit te voeren, gebruik je het OmniLog fenotype micro Erik OPM softwarepakket dat draait binnen de R software omgeving.

In R studio, de grafische gebruikersinterface voor R, installeert u het OPM-pakket en zijn afhankelijkheden met behulp van de opdrachten die in het manuscript worden beschreven. Navigeer naar de map met de CSV-bestanden van de kinetische gegevens en importeer de gegevens met behulp van de leesfunctie OPM. De kinetische gegevens kunnen worden geaggregeerd en gedisretiseerd met behulp van pref-parameterschatting.

Met behulp van de functie XY plot kunnen de ademhalings- of groeimetingen in kaart worden gebracht als functie van de tijd voor de test 96-well platen. De gegevens kunnen worden gevisualiseerd als een heatmap met behulp van de functieniveauplot om een snel vergelijkend overzicht van de kinetische gegevens mogelijk te maken. De volgende stap is het identificeren van de reacties en genen geassocieerd met de nieuwe metabolieten.

In geval van aanwezigheid van een bestaand model voor de algen, kan de data-analyse van het fenotype microarray-systeem worden gebruikt om dit model te verfijnen. Hier presenteren we de pijplijn die we gebruikten voor de verfijning van het metabole netwerk op genoomschaal voor het Chlamydomonas-model met behulp van fenotype microarray-gegevens. Wanneer een nieuwe verbinding positief test voor gebruik, worden de relevante reactieprofielen van de verbinding gedefinieerd met behulp van metabole kennisbasis, met de bijbehorende enzymcommissienummers.

De eerste stap is om Kegg en MetaCyc te doorzoeken om enzymcommissienummers, EC's, te identificeren voor reacties met behulp van gemetaboliseerde gevonden uit de chemische samengestelde arrays. Vervolgens gebruiken we de geïdentificeerde EC-nummers als zoekbasis in meerdere beschikbare algenannotatiebronnen, zoals joint genome Institute, JGI, Phytozome en peer-reviewed publicaties. De reacties en metabolieten worden toegevoegd aan het op COBRA gebaseerde Chlamydomonas reinhardtii metabole netwerkmodel, iRC1080, om het model uit te breiden en te verfijnen.

Als er geen genetisch bewijs wordt gevonden ter ondersteuning van het EC-nummer, kan een op profiel gebaseerde zoekopdracht zoals NCBI Position-Specific Iterative, NCBI PSI-BLAST, worden uitgevoerd om kandidaatgenen te identificeren die verband houden met de reactie. De resultaten worden vervolgens handmatig geëvalueerd. Degenen die deze QC-stap passeren met E-waarden van minder dan 0,05 voor relevantie voor de zoek-EC-nummers, worden vervolgens toegevoegd aan het metrische model.

De laatste stap van dit protocol is het verfijnen van het model, het evalueren en vergelijken van de modellen. Gebruik de nieuwste COBRA toolbox versie 3.0 en het MATLAB-platform om de stappen voor modelverfijning uit te voeren. Na het installeren van de Cobra toolbox kunt u het iRC1080 model downloaden.

Vervolgens is het eerste wat u in MATLAB moet doen, navigeren naar de map met het referentiemodel, iRC1080. Voeg de geïdentificeerde reacties met hun bijbehorende genen toe aan het metabole model, zoals iRC1080, met behulp van de Cobra toolbox-functies. Voeg reactie- en veranderingsgenassociatie toe.

Navigeer naar de map met het iRC1080-model en voer de opdrachten uit om het model te laden. Hernoem het en voeg een nieuwe reactie en het bijbehorende gen toe. In sommige gevallen waarin de metaboliet niet intracellulair wordt geproduceerd, maar uit het medium wordt gehaald, moeten transportreacties voor de nieuwe metabolieten aan het model worden toegevoegd met behulp van de add/exchange-reactiefunctie om de metaboliet in het extracellulaire medium in te voeren of uit te voeren.

Test het gedrag van het nieuwe resultaat en model, bijvoorbeeld iBD1106, door fluxbalansanalyse, FBA, uit te voeren met behulp van het cb-model voor functieoptimalisatie onder lichte en donkere omstandigheden voor de maximalisatie van biomassa als objectfunctie. De FBA-oplossing produceert onder andere drie vectoren, de reactiefluxen, de schaduwprijzen van de metaboliet en de reactie verlaagde kosten. Hier wordt een voorbeeld gegeven waarbij het iRC1080-model wordt vergeleken met zijn verfijnde versie, iBD1106, door de schaduwprijzen te verkrijgen die de gevoeligheid van de biomassa-objectieve functie voor veranderingen en metabolieten vertegenwoordigen die in elk model worden verantwoord.

Hier tonen we ademhaling XY-plots en niveauplots van de koolstofbronnen en stikstofbronnen testplaten voor blank en CC-503 in respectievelijk groenblauwe kleur en paars. Binnen elke put vertegenwoordigen ademhalingscurven de omzetting van kleurstof door reductie als functie van de tijd. De gemarkeerde piek in paneel A vertegenwoordigt de detectie van acetaat als de enige koolstofbron van deze plaat, wat consistent is met de literatuur van Chlamydomonas.

De vergelijking van het aantal metabolieten geïdentificeerd met behulp van drie verschillende methoden, iRC1080, het goed samengestelde Chlamydomonas metabole model, de gaschromatografietijd van vlucht GC-TOF en het fenotype microarray essay toont aan dat slechts zes metabolieten overlappen tussen de drie sets, terwijl 149 gemeenschappelijk waren tussen iRC1080 en de fenotype microarray assay set. Dit toont aan dat hoewel elke technologie een kracht heeft ten opzichte van het metabole profileringsonderzoek, de fenotype microarray-assayset een belangrijke bron van nieuwe metabole informatie kan zijn. De verkregen informatie werd gebruikt om het metabole netwerkmodel iRC1080 uit te breiden en te verfijnen.

Hier vergelijken we de inhoud van het iRC1080-model en het uitgebreide model iBD1106, inclusief het aantal reacties, het aantal metabolieten en het aantal genen. We laten zien dat onze modelraffinage meer dan 254 reacties heeft toegevoegd aan het nieuwe netwerk. Deze reacties worden ingedeeld in aminozuren, dipeptiden, tripeptiden en transportreacties.

De nieuw geïdentificeerde metabolieten werden gebruikt voor metabole netwerkuitbreiding en verfijning van het bestaande Chlamydomonas reinhardtii metabole model. De fenotype microarray assays kunnen worden gebruikt om metabole fenotypes van bestaande en nieuw geïsoleerde stammen te karakteriseren. Bovendien kan het protocol dat we gebruikten in de context van micro-algen de verfijning van metabole modellen van andere soorten begeleiden.