Name: High-Throughput Metabole Profilering voor Modelverfijningen van Microalgen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Leer hoe je fenotype-microarray-technologie gebruikt voor metabole profilering van Chlamydomonas reinhardtii. Deze methode verfijnt metabole netwerkmodellen en identificeert nieuwe reacties voor algenonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Belangrijke ondersteuning voor dit werk werd geleverd door het NYUAD Center for Genomics and Systems Biology (CGSB), gefinancierd door Tamkeen onder de New York University Abu Dhabi Research Institute grant (73 71210 CGSB9) en NYU Abu Dhabi Faculty Research Funds (AD060). W.F. werd bovendien ondersteund door het Hundred Talents Program van Zhejiang University. We bedanken Ashish Jaiswal voor hulp bij het opnemen van de video. We bedanken Hong Cai voor het genereren van de metabole fenotypegegevens.

1. Fenotype Microarray Experimenten
<ol><li>Verkrijg C. reinhardtii stam CC-503 van het Chlamydomonas Resource Center aan de Universiteit van Minnesota, VS (https://www.chlamycollection.org).</li>
	<li>Kweek de cellen in verse Tris-Acetaat-Fosfaat (TAP) media19 met eindconcentraties van 400 μg/ml timentine, 50 μg/ml ampicilline en 100 μg/ml kanamycine (om de bacteriegroei te remmen) onder 400 micromol fotonen/m2s, bij 25 °C, gedurende twee dagen tot halverwege de logfase.</li>
	<li>Draai de cultuur gedurende 10 minuten bij 22 °C bij 2.000 x g en gooi het supernatant weg zonder de pellet te storen.</li>
	<li>Bereid verse TAP-media met 0,1% tetrazolium violette kleurstof "D". OPMERKING: Wijzig TAP-media in deze stap om sommige voedingsstoffen uit te sluiten, afhankelijk van de metabolietcategorie die in elke plaat is getest (bijvoorbeeld ammoniumchloride uitsluiten voor stikstofbronplaten).</li>
	<li>Resuspend de pellet in verse TAP-media bereid (vanaf stap 1.2) tot een eindconcentratie van 1 x 106 cellen/ml.</li>
	<li>Gebruik chemische samengestelde array-testplaten (koolstofbronnen, stikstofbronnen, fosfor- en zwavelbronnenplaten en de peptidestikstofbronnen).</li>
	<li>Ent een aliquot van 100 μL celbevattende media in elke put van de testplaten. OPMERKING: Zorg ervoor dat u de testen dupliceert.</li>
	<li>Streep cellen op gistextract / peptonplaten en voer gramkleuring uit, zoals in Smith et al. 20 voor en na de test om bacteriële besmetting te controleren.</li>
	<li>Plaats de testplaten van de chemische samengestelde array in het microplaatlezersysteem.</li>
	<li>Incubeer alle platen bij 30 °C gedurende maximaal 7 dagen en programmeer het microplaatlezersysteem om elke 15 minuten de kleurstofverandering af te lezen. OPMERKING: Aangezien de meeste microplaatlezers geen bron van continu licht bieden tijdens de incubatie, moeten de algen heterotrofe ademhaling kunnen uitvoeren.</li>
</ol>2. Data-analyse
<ol><li>Exporteer de ruwe kinetische gegevens van de microplaatlezer als CSV-bestanden, die vervolgens worden gebruikt als invoer voor het Omnilog Phenotype Microarray (OPM) -pakket in R. Voeg de biologische informatie toe als metadata (bijv. Stamaanduiding, groeimedia, temperatuur, enz.).<ol>
<li>Met behulp van de PM Kinetic data converter software; laad de D5E-gegevensbestanden en converteer ze naar OKA-bestanden met behulp van de volgende opdrachtregels in de PM kinetic analysis software: Laad | Importeren (zoek de map van de OKA-bestanden) | Filters invullen | | importeren Alle platen toevoegen | Sluiten. | exporteren kies leesgegevens (Kinetic), kies formaat (CSV) (Tabulate Header)en kies platen (elke plaat (afzonderlijke bestanden)) | Gegevens exporteren | Redden.
</li>
		<li>Om de Phenotype Microarray (PM) data-analyse uit te voeren, gebruikt u het OPM-softwarepakket21,22 dat binnen de R-softwareomgeving wordt uitgevoerd. Het pakket, de zelfstudie en de referentiedocumentatie zijn beschikbaar op: http://www.goeker.org/opm/. Installeer in RStudio, een grafische gebruikersinterface voor R, het opm-pakket en de bijbehorende afhankelijkheden met behulp van de volgende opdrachten: bron (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R) bibliotheek (opm)
</li>
		<li>Navigeer naar de map met de CSV-bestanden van de kinetische gegevens en importeer de gegevens met behulp van de read_opm-functie: x <- read_opm(".", convert="grp", include=list ("csv:"))
</li>
		<li>Aggregeer en discretiseer de kinetische gegevens met behulp van curve-parameter schatting. Voor (i in 1 :length(x)) { x[[i]] <Ik _aggre(x[[i]], boot = 0 L, cores = 1 L, method ="splines", options = set_spline_options("smooth.spline")) x[[i]] <- do_disc(x[[i]], cutoff = FALSE) } #Collection van de metadata metadata <- collect_template(".") metadata$Stam <- c("BLANK","CC- 503") voor (I in 1 :length(x)) {x[[i]] <- include_metadata(x[[i]], md = metadata, replace = TRUE)}
</li>
		<li>Gebruik de functie xy_plot om de ademhalings- (of groei)metingen (y-as) in kaart te brengen als functie van de tijd (x-as) voor de geteste 96-putplaten. print (xy_plot(x[[ 1 ]], include ="Strain", theor.max = FALSE))
</li>
		<li>Visualiseer de gegevens als een heatmap met behulp van de functie level_plot om een snel vergelijkend overzicht van de kinetische gegevens mogelijk te maken. level_plot(x, main = list(), colors = opm_opt("color.borders"), panel.headers = metadata$Strain, cex = NULL, strip.fmt = list(), striptext.fmt = list(), legend.sep =" ", spatie ="Lab", bias = 0.7 , num.colors = 200 L)
</li>
		<li>Haal belangrijke biologische informatie, de curveparameters, uit de ruwe kinetische curven en omvatten de vertragingsfase (λ), de groeisnelheid (μ), de maximale celademhaling (A) en het gebied onder de curve (AUC)21. Om positieve metabolieten te identificeren, gebruikt u de A-waarden van de negatieve controle, die de abiotische reactiviteit van de kleurstof met het medium vertegenwoordigt, naast de blanco van elke microwellplaat als achtergrondaftrekkingswaarden. De extractfunctie wordt gebruikt om de parameter A te verkrijgen. opm_opt("curve.param") param <-extract (x, as.labels = list("Stam")))
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Identificatie van reacties en genen geassocieerd met nieuwe metabolieten
<ol><li>Zoek KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (http://www.genome.jp/kegg/) en MetaCyc (http://metacyc.org/) om enzymcommissienummers (EC's) te identificeren voor reacties met behulp van metabolieten gevonden uit chemische samengestelde arrays23,2423,24.</li>
	<li>Gebruik de geïdentificeerde EC-nummers als zoekbasis in meerdere beschikbare bronnen voor algenannotatie, zoals Joint Genome Institute (JGI), Phytozome (http://www.phytozome.net) en peer-reviewed publicaties23,25,26,27.</li>
	<li>Als een zoekopdracht geen genetisch bewijs levert voor een bepaald EC-nummer, identificeer dan de relevante geassocieerde eiwitten in andere organismen, te beginnen met soorten die het dichtst bij de C. reinhardtiiliggen, voer vervolgens een op profiel gebaseerde zoekopdracht uit met behulp van de NCBI PSI-BLAST-server met standaardinstellingen en gebruik niet-redundante eiwitten (nr) in C. reinhardtii (taxid:3055) om kandidaatgenen te identificeren die verband houden met de reactie12.</li>
	<li>Beheer PSI-BLAST-hits handmatig met E-waarden van < 0,05 voor relevantie voor het gezochte EC-nummer door die BLAST-hits op te vragen via EMBL-EBI Pfam (http://pfam.xfam.org/search) of InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/) eiwitdomeinvoorspellingsservers. Merk op dat de laatste twee scans kritieke stappen zijn om de identificatie van de juiste enzymatische activiteit voor het eiwit te garanderen.</li>
</ol>4. Verfijning en evaluatie van modellen
<ol><li>Gebruik de nieuwste COBRA Toolbox v.3.028in MATLAB29,30platform om de volgende stappen voor modelverfijning uit te voeren. De COBRA Toolbox kan worden geïnstalleerd door de stappen te volgen in: https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html . U kunt er ook rekening mee houden dat de COBRA Toolbox ook wordt geïmplementeerd in andere open-source programmeertalen, zoals Python (COBRApy31) en is verkrijgbaar bij: https://opencobra.github.io/cobrapy/ .<ol><li>Na het installeren van de COBRA Toolbox v.3.0, opent u MATLAB en voert u de volgende opdracht uit om de toolbox te initialiseren: initCobraToolbox;</li>
		<li>Voeg de geïdentificeerde reacties met hun bijbehorende genen toe aan het metabole model, zoals iRC1080, met behulp van de COBRA Toolbox-functies addReaction en changeGeneAssociation. Navigeer naar de map met het iRC1080-model, gedownload van http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 en voer de volgende opdrachten uit om het model te laden, te hernoemen en een nieuwe reactie en het bijbehorende gen toe te voegen. Belasting('iRC 1080 .mat') modelNieuw = iRC 1080; modelNieuw = addReactie(modelNieuw, 'D-ALA 2' , ... {'d-ala[c]" , "atp[c]" , ... "D-aladata[c]" , "adp[c]" , "pi[c]" , ... "h[c]" },[- 2 - 1 1 1 1 1 ],false); modelNIEUW = veranderingGeneAssociation(modelNieuw, ... "D-ALA 2","nl 14655 _t 1" );</li>
		<li>In sommige gevallen, wanneer de metaboliet niet intracellulair wordt geproduceerd maar uit het medium wordt opgenomen, voegt u transportreacties voor de nieuwe metabolieten toe aan het model. Deze transportreacties vertegenwoordigen passieve diffusie van een metaboliet van het extracellulaire medium naar het cytosol. Voeg bovendien een overeenkomstige kunstmatige uitwisselingsreactie toe met behulp van de addExchangeRxn-functie om de metaboliet in het extracellulaire medium in te voeren of uit te voeren. modelNieuw = addReactie(modelNieuw, 'CYCPt' , ... {'cycp[e]','cycp[c]' },[- 1 1 ],true)" modelNew = addExchangeRxn(modelNew, 'cycp[e]' ,- 1000 ,1000 );</li>
		<li>Test het gedrag van het nieuwe resulterende model, bijvoorbeeld iBD1106, door fluxbalansanalyse (FBA) uit te voeren met behulp van de functie optimizeCbModel onder lichte en donkere omstandigheden voor de maximalisatie van biomassa als objectieve functie. Stel voor lichtgroei de onder- en bovengrenzen van de PRISM-zonnelitho'-lichtreacties in op 646,07 (maximale snelheid). Stel voor donkere groei de grenzen van alle PRISM-lichtreacties op nul. Gebruik de biomassafunctie die eerder10 is gedefinieerd voor groei onder donkere en lichte omstandigheden. De FBA-oplossing zal twee vectoren produceren die overeenkomen met reactiefluxen (solution.v) en lagere kosten (solution.w), evenals één vector die overeenkomt met de schaduwprijzen van metabolieten (solution.y). %Simuleer groei onder lichtomstandigheden: modelNew = changeRxnBounds(modelNew,{ ... % "PRISM_solar_litho" , ... "PRISM_solar_exo" , ... "PRISM_incandescent_ 60 W" , ... "PRISM_fluorescent_cool_ 215 W" , ... "PRISM_metal_halide" , ... "PRISM_high_pressure_sodium" , ... "PRISM_growth_room" , ... "PRISM_white_LED" , ... "PRISM_red_LED_array_ 653 nm" , ... "PRISM_red_LED_ 674 nm" , ... "PRISM_fluorescent_warm_ 18 W" , ... "PRISM_design_growth" , ... }, 0, "b"); modelNieuw = veranderingObjectief(modelNieuw, 'BIOMASS_Chlamy_mixo'); FBAsolutionNew = optimizeCbModel(modelNieuw, 'max');</li>
		<li>Herhaal stap 4.1.4 voor iRC1080 om FBA-oplossingen verkregen voor iBD1106 te vergelijken met die verkregen voor iRC1080.</li>
		<li>Er is een reeks COBRA-methoden beschikbaar die kunnen worden gebruikt om modellen te vergelijken (bijv. Flux variability analysis, gene deletion studies, robustness analyses, flux split predictions, FBA, sampling, etc.). Gedetailleerde tutorials zijn te vinden op https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html. Hier wordt een voorbeeld gegeven waarbij het iRC1080-model wordt vergeleken met zijn verfijnde versie, iBD1106, door de schaduwprijzen (gevoeligheid van de biomassa-objectieve functie voor veranderingen in systeemvariabelen) van de metabolieten te verkrijgen die in elk model worden verantwoord. Verkrijg de schaduwprijzen voor de metabolieten: shadowPrices = table(modelNew.mets, ... modelNew.metNames, FBAsolutionNew.y);</li>
	</ol></li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Metabole fenotypering van de groene microalg, C. reinhardtii, werd hier beschreven met behulp van PM-testplaten met hoge doorvoer en een ongewijzigde PMI. De testen werden gebruikt voor in totaal 190 koolstofbronnen (PM01 en PM02), 95 stikstofbronnen (PM03), 59 fosforbronnen en 35 zwavelbronnen (PM04), samen met peptidestikstofbronnen (PM06-08). Positieve ademhaling werd waargenomen voor 148 voedingsstoffen (één positieve test voor C-brongebruik, vier positieve assays voor elk de S-source en P-source gebruik, en 139 positieve assays voor N-source gebruik). De componenten substraten of nutriënten (koolstof, stikstof, fosfor of zwavel) van de media mogen niet aan het gedefinieerde medium worden toegevoegd wanneer ze worden aangebracht op de relevante PM-microplaten die voor elk van deze bronnen worden getest.
De hier getoonde methode is effectief voor het karakteriseren van metabole microalgenfenotypen die kunnen worden gebruikt om bestaande metabole netwerkmodellen uit te breiden of de reconstructie van nieuwe modellen te sturen. Verder, omdat de voedingsbehoeften van de meeste microalgen niet bekend zijn, kan dit platform worden gebruikt om deze snel te definiëren. Nelson et al. 43 had deze methoden met succes toegepast om nieuwe verbindingen te identificeren die de groei van de microalgen Chloroidium sp. UTEX 3007 ondersteunen en gebruikte de verkregen informatie om de metabolieten van de soortinvoer te definiëren, die, in tegenstelling tot Chlamydomonas, 40 verschillende koolstofbronnen omvatten.
Een belangrijke beperking van de PM voor het profileren van microalgen is dat de PMI geen verlichting heeft in de incubatiekamer en dat de microalgen het heterotroof metabolisme moeten kunnen uitvoeren. De afwezigheid van licht kan van invloed zijn op de interpretatie van modellen die licht bevatten om metabole fluxen te berekenen. Genparen met coördinerende functies zijn mede geëvolueerd om metabole netwerkhubs te vormen, en het onderscheid tussen fotosynthetische en niet-fotosynthetische netwerkhubs kan worden gemaakt44. Over het algemeen zouden fotosynthetische netwerkhubs (d.w.z. sterk verbonden knooppunten in het model) buiten heterotrofe modellen worden gelaten. Voor praktische doeleinden moet het modelleren van heterotrofe bij mixotrofe soorten reacties waarvan bekend is dat ze door licht worden aangedreven, weglaten en rekening houden met de energiebalansverschillen tussen omstandigheden. Het modelleren van lichtafhankelijk en lichtonafhankelijk metabolisme is dus standaardpraktijk in Chlamydomonas metabole modellering6,45.
Van sommige groene microalgen, zoals Trebouxiophyten, is bekend dat ze een verscheidenheid aan koolstofmoleculen voor groei assimileren, en dit wordt verondersteld te zijn voortgekomen uit hun lange evolutionaire geschiedenis als leden van korstmossen46. Terwijl chlorofyten zoals Chlamydomonas acetaat kunnen gebruiken voor groei, kan de bruine mariene microalg Tisochrysis lutea, bekend om zijn potentieel om commercieel zeer lange-keten meervoudig onverzadigde vetzuren (VLC-PUFA's) te produceren, geen acetaat gebruiken, maar kan glycerol gebruiken voor groei47. Biomassaconcentratie van meer dan 100 g l−1 droge celgewicht is bereikt met Chlorella met geoptimaliseerde toevoeging van organische koolstofbronnen in een fed-batch-modus48. Verder kan de toevoeging van suiker aan Chlorellavulgaris de vastlegging van CO2verhogen, waardoor een additief voordeel wordt geboden tijdens fotosynthetische groei49. De meeste heterotrofe microalgen kunnen ook mixotrofisch groeien, maar van de Chlorofyt Chromochloris zofingiensis is aangetoond dat het de fotosynthese uitschakelt bij de toevoeging van suiker50.
Diatomeeën, behorend tot de divisie Bacillariophyta, zijn een belangrijke groep fytoplankton. Hoewel de meeste diatomeeën alleen fotoautotrofisch kunnen groeien, kunnen sommigen van hen mixotrofisch of heterotrofisch worden gekweekt51. Glycerol bleek bijvoorbeeld de groei in het licht te ondersteunen in afwezigheid van CO2 in sommige diatomeeën, waaronder de modelsoort Phaeodactylum tricornutum52. Ook kunnen sommige benthische diatomeeën zoals Nitzschia linearis in het donker op koolhydraten groeien53. Het is waarschijnlijk dat de PM-testen worden uitgebreid naar diatomeeën en andere algengroepen door geschikte organische koolstofbronnen aan te vullen om de cellen in staat te stellen heterotrofisch te groeien, en een mixotrofiestrategie kan mogelijk ook worden gebruikt voor de obligate autotrofe microalgen die een minimaal vereiste lichttoevoer bieden.
Om de reproduceerbaarheid van de gegevens te beoordelen, wordt het ten zeerste aanbevolen om dubbele testen uit te voeren voor alle platen. Een test kan alleen als positief worden beschouwd als, na aftrek van de negatieve controle en de respectieve blanco putten, de absorptie (PMI-waarde) positief is. Deze beschrijving, in aanwezigheid van de geteste verbinding, is een weerspiegeling van de abiotische reactie van de kleurstof met het medium.

Het optimaliseren van het algenmetabolisme voor een verbeterde en stabiele productie van gerichte metabolieten vereist de ontwikkeling van complexe metabole engineeringstrategieën door middel van analyses op systeemniveau van metabole netwerken. Metabole netwerkmodellen kunnen de rationele ontwerpen begeleiden voor de snelle ontwikkeling van optimalisatiestrategieën1,2,3,4. Hoewel ongeveer 160 microalgensoorten zijn gesequenced5,zijn er, voor onze weten, slechts 44 algen metabolische modellen beschikbaar4,6,7. Vanwege de moeilijkheid om metabole fenotypische gegevens met hoge doorvoer te verkrijgen voor experimentele validatie van genomische informatie, blijft de reconstructie van hoogwaardige netwerkmodellen achter bij de snelle ontwikkeling van algengenoomsequencing.
C. reinhardtii is een aantrekkelijk modelsysteem voor op algen gebaseerde studies. Deze soort kan fotoautotrofisch of heterotroof groeien en is veel gebruikt als modelorganisme in fundamenteel en toegepast onderzoek. De genoomsequentie werd gepubliceerd in 20078, met genoomschaal metabole modellen die vervolgens werden gereconstrueerd voor de soort9,10,11. Het genoomschaalmodel voor C. reinhardtii (iRC1080) werd gereconstrueerd door Chang et al. 10 gebaseerd op genomisch en literatuurkundig bewijs (met ~250 bronnen). Het heeft 1.706 metabolieten met 2.190 reacties10; de volledigheid van het model kon echter niet worden geverifieerd buiten het beschikbare gepubliceerde experimentele bewijsmateriaal op dat moment.
De fenotype microarrays (PM's) technologie is een high-throughput platform dat metabole profileringsinformatie kan leveren voor heterotrofe micro-organismen en weefselkweekcellen. In het bijzonder kan het worden gebruikt om de fenotype-tot-genotype kenniskloof in microalgen aan te pakken, zoals eerst gemeld voor Chlamydomonas reinhardtii12 en vervolgens voor een soort Chloroidium13 en Chlorella14. Door celresponsen op duizenden metabolieten, signaalmoleculen, osmolyten en effectormoleculen te bestuderen, kunnen de PM-assays functionele metabole profilering bieden en inzicht bieden in de functie, het metabolisme en de omgevingsgevoeligheid15,16,17. In het bijzonder detecteren PM-assays het gebruik van celmetabolieten in microplaten met 96-wells met verschillende voedingsstoffen, metabolieten of osmolyten in elke put. Bovendien is het ook mogelijk om bioactieve moleculen, zoals antibiotica en hormonen, te testen. Zoals bepaald door de intensiteit van de kleurproductie door de NADH-reductie van een op tetrazolium gebaseerde redoxkleurstof, wordt het metabolische gebruik van substraten geëvalueerd in termen van celademhaling15,16,17. De experimenten met 96-well microplaten kunnen in de loop van de tijd automatisch worden gemonitord en bepaald met het fenotype microarray instrument (PMI) platform. Twintig 96-well microplaten zijn ontworpen om de gemeenschappelijke set metabolieten te vertegenwoordigen om cellulaire fenotypen te bestuderen om koolstof-, stikstof-, zwavel- en fosforbronnen te gebruiken, samen met verschillende osmotische / ionen- en pH-effecten. De PM-technologie is met succes gebruikt voor het bijwerken en upgraden van een aantal bestaande metabolische modellen op genoomschaal voor micro-organismen15,16,17,18.
Het protocol en de gegevens die hier worden getoond, zijn gebaseerd op eerder gepubliceerd werk van Chaiboonchoe et al. 12 Het gepresenteerde werk beschrijft het gebruik van de PM-testmethode om de metabole fenotypen van microalgen te karakteriseren en een bestaand algenmetabool model van C. reinhardtii uit te breiden en de reconstructie van nieuwe metabole modellen te begeleiden.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin</td><td>VWR</td><td>97062-796</td><td></td></tr><tr><td>Biolog assay plates [ PM01-08]</td><td>Biolog, Hayward, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biolog Omnilog Instrument</td><td>Biolog, Hayward, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503</td><td>Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA.</td><td></td><td>Regents of the University of Minnesota</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>VWR</td><td>0408-EU-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tetrazolium Violet Dye &ldquo;D&rdquo;</td><td>Biolog, Hayward, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Timentin</td><td>GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd</td><td>42010012-2</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput metabole profilering voor modelverfijningen van microalgen

High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae

Metabole modellen worden gereconstrueerd op basis van de beschikbare genoomannotatie van een organisme en bieden voorspellende hulpmiddelen om metabole processen op systeemniveau te bestuderen. Metabole modellen op genoomschaal kunnen hiaten bevatten, evenals reacties die niet experimenteel zijn geverifieerd. Gereconstrueerde modellen van nieuw geïsoleerde microalgensoorten zullen resulteren in zwakheden als gevolg van deze hiaten, omdat er meestal schaars biochemisch bewijs beschikbaar is voor het metabolisme van dergelijke isolaten. De fenotype microarray (PM) technologie is een effectieve, high-throughput methode die functioneel cellulaire metabole activiteiten bepaalt in reactie op een breed scala aan entry metabolieten. Door de fenotypische assays met hoge doorvoer te combineren met metabole modellering kunnen bestaande metabole netwerkmodellen snel worden gereconstrueerd of geoptimaliseerd door biochemisch bewijs te leveren om genomisch bewijs te ondersteunen en uit te breiden. Dit werk zal het gebruik van PM-assays voor de studie van microalgen laten zien door de groene microalgal-modelsoort Chlamydomonas reinhardtii als voorbeeld te gebruiken. Experimenteel bewijs voor meer dan 254 reacties verkregen door PM werd in deze studie gebruikt om een genoomschaal C. reinhardtii metabolisch netwerkmodel, iRC1080, met ongeveer 25 procent uit te breiden en te verfijnen. Het protocol dat hier is gemaakt, kan worden gebruikt als basis voor het functioneel profileren van het metabolisme van andere microalgen, waaronder bekende microalgenmutanten en nieuwe isolaten.

Dit protocol demonstreert het gebruik van een fenotype microarray (PM) technologieplatform om metabolische vereisten van Chlamydomonas reinhardtii, een groene microalg, te definiëren en een bestaand metabolisch netwerkmodel te verfijnen.

High-Throughput Metabole Profilering voor Modelverfijningen van Microalgen

Metabolic models are reconstructed based on an organism&#39;s available genome annotation and provide predictive tools to study metabolic processes at a ...

De fenotype micro-array technologie is een effectieve high-throughput methode die functioneel cellulaire metabole activiteiten bepaalt als reactie op een breed scala aan entry metabolieten. Het gebruik in deze technologie wordt gemeten in de vorm van cellulaire ademhaling bepaald door de hoeveelheid kleurontwikkeling geproduceerd door de NADH-reductie van een op tetrazolium gebaseerde redoxkleurstof. In dit werk zullen we het gebruik van fenotype micro array assays introduceren in de context van micro-algen met behulp van modelsoort Chlamydomonas reinhardtii.Het doel van deze studie is om een betrouwbare methode vast te stellen voor het karakteriseren van metabole fenotypering van micro-algen die kan worden gebruikt om bestaande algen metabole netwerkmodellen uit te breiden of de reconstructie van nieuwe modellen te begeleiden. Chlamydomonas reinhardtii stam CC-503 kan worden verkregen bij het Chlamydomonas resource center aan de Universiteit van Minnesota USA. Laat de cellen groeien in verse Tris-acetaatfosfaat vetmedia tot halverwege de logfase.Controleer de cellen onder de microscoop om er zeker van te zijn dat ze in goede staat zijn en zonder enige besmetting. Draai de cultuur op 2000 G-kracht gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren.Bereid verse tapmedia met 0,1% tetrazolium violette kleurstof D"Voeg verschillende antibiotica, waaronder Timentin, Ampicilline en Kanamycine toe aan de media om de bacteriegroei te remmen. Vetmedia en deze stap moeten worden weggelaten uit voedingsstoffen, afhankelijk van elk plaattype. Suspensie van de pellet en de verse tapmedia tot een eindconcentratie van 1 miljoen cellen per milliliter.Gebruik chemische samengestelde array-testplaten, zoals koolstofbronnen, stikstofbronnen, fosfor- en zwavelbronnenplaten en de peptidestikstofbronnen. Ent 100 microliter voldoende zelfbevattende media in elke put van de essayplaten. Zorg ervoor dat u de testen dupliceert.Opgemerkt moet worden dat in dit stadium cellen moeten worden getest met gramnegatieve kleuring voor en na de test om bacteriële besmetting te controleren. Plaats de testplaten van het chemische verbindingsgebied in het microplaatlezersysteem. Incubeer alle platen op 30 graden gedurende maximaal zeven dagen en programmeer het microplaatlezersysteem om elke 15 minuten de kleurstofverandering te lezen.Omdat de meeste microplaatlezers tijdens de incubatie geen bron van continu licht bieden, moeten de algen heterotrofe ademhaling kunnen uitvoeren. Exporteer de ruwe kinetische gegevens van de microplaatlezer als CSV-bestanden, die vervolgens worden gebruikt als invoer voor het fenotype microarray-softwarepakket en onze software. Om de fenotype microarray data analyse uit te voeren, gebruik je het OmniLog fenotype micro Erik OPM softwarepakket dat draait binnen de R software omgeving.In R studio, de grafische gebruikersinterface voor R, installeert u het OPM-pakket en zijn afhankelijkheden met behulp van de opdrachten die in het manuscript worden beschreven. Navigeer naar de map met de CSV-bestanden van de kinetische gegevens en importeer de gegevens met behulp van de leesfunctie OPM. De kinetische gegevens kunnen worden geaggregeerd en gedisretiseerd met behulp van pref-parameterschatting.Met behulp van de functie XY plot kunnen de ademhalings- of groeimetingen in kaart worden gebracht als functie van de tijd voor de test 96-well platen. De gegevens kunnen worden gevisualiseerd als een heatmap met behulp van de functieniveauplot om een snel vergelijkend overzicht van de kinetische gegevens mogelijk te maken. De volgende stap is het identificeren van de reacties en genen geassocieerd met de nieuwe metabolieten.In geval van aanwezigheid van een bestaand model voor de algen, kan de data-analyse van het fenotype microarray-systeem worden gebruikt om dit model te verfijnen. Hier presenteren we de pijplijn die we gebruikten voor de verfijning van het metabole netwerk op genoomschaal voor het Chlamydomonas-model met behulp van fenotype microarray-gegevens. Wanneer een nieuwe verbinding positief test voor gebruik, worden de relevante reactieprofielen van de verbinding gedefinieerd met behulp van metabole kennisbasis, met de bijbehorende enzymcommissienummers.De eerste stap is om Kegg en MetaCyc te doorzoeken om enzymcommissienummers, EC's, te identificeren voor reacties met behulp van gemetaboliseerde gevonden uit de chemische samengestelde arrays. Vervolgens gebruiken we de geïdentificeerde EC-nummers als zoekbasis in meerdere beschikbare algenannotatiebronnen, zoals joint genome Institute, JGI, Phytozome en peer-reviewed publicaties. De reacties en metabolieten worden toegevoegd aan het op COBRA gebaseerde Chlamydomonas reinhardtii metabole netwerkmodel, iRC1080, om het model uit te breiden en te verfijnen.Als er geen genetisch bewijs wordt gevonden ter ondersteuning van het EC-nummer, kan een op profiel gebaseerde zoekopdracht zoals NCBI Position-Specific Iterative, NCBI PSI-BLAST, worden uitgevoerd om kandidaatgenen te identificeren die verband houden met de reactie. De resultaten worden vervolgens handmatig geëvalueerd. Degenen die deze QC-stap passeren met E-waarden van minder dan 0,05 voor relevantie voor de zoek-EC-nummers, worden vervolgens toegevoegd aan het metrische model.De laatste stap van dit protocol is het verfijnen van het model, het evalueren en vergelijken van de modellen. Gebruik de nieuwste COBRA toolbox versie 3.0 en het MATLAB-platform om de stappen voor modelverfijning uit te voeren. Na het installeren van de Cobra toolbox kunt u het iRC1080 model downloaden.Vervolgens is het eerste wat u in MATLAB moet doen, navigeren naar de map met het referentiemodel, iRC1080. Voeg de geïdentificeerde reacties met hun bijbehorende genen toe aan het metabole model, zoals iRC1080, met behulp van de Cobra toolbox-functies. Voeg reactie- en veranderingsgenassociatie toe.Navigeer naar de map met het iRC1080-model en voer de opdrachten uit om het model te laden. Hernoem het en voeg een nieuwe reactie en het bijbehorende gen toe. In sommige gevallen waarin de metaboliet niet intracellulair wordt geproduceerd, maar uit het medium wordt gehaald, moeten transportreacties voor de nieuwe metabolieten aan het model worden toegevoegd met behulp van de add/exchange-reactiefunctie om de metaboliet in het extracellulaire medium in te voeren of uit te voeren.Test het gedrag van het nieuwe resultaat en model, bijvoorbeeld iBD1106, door fluxbalansanalyse, FBA, uit te voeren met behulp van het cb-model voor functieoptimalisatie onder lichte en donkere omstandigheden voor de maximalisatie van biomassa als objectfunctie. De FBA-oplossing produceert onder andere drie vectoren, de reactiefluxen, de schaduwprijzen van de metaboliet en de reactie verlaagde kosten. Hier wordt een voorbeeld gegeven waarbij het iRC1080-model wordt vergeleken met zijn verfijnde versie, iBD1106, door de schaduwprijzen te verkrijgen die de gevoeligheid van de biomassa-objectieve functie voor veranderingen en metabolieten vertegenwoordigen die in elk model worden verantwoord.Hier tonen we ademhaling XY-plots en niveauplots van de koolstofbronnen en stikstofbronnen testplaten voor blank en CC-503 in respectievelijk groenblauwe kleur en paars. Binnen elke put vertegenwoordigen ademhalingscurven de omzetting van kleurstof door reductie als functie van de tijd. De gemarkeerde piek in paneel A vertegenwoordigt de detectie van acetaat als de enige koolstofbron van deze plaat, wat consistent is met de literatuur van Chlamydomonas.De vergelijking van het aantal metabolieten geïdentificeerd met behulp van drie verschillende methoden, iRC1080, het goed samengestelde Chlamydomonas metabole model, de gaschromatografietijd van vlucht GC-TOF en het fenotype microarray essay toont aan dat slechts zes metabolieten overlappen tussen de drie sets, terwijl 149 gemeenschappelijk waren tussen iRC1080 en de fenotype microarray assay set. Dit toont aan dat hoewel elke technologie een kracht heeft ten opzichte van het metabole profileringsonderzoek, de fenotype microarray-assayset een belangrijke bron van nieuwe metabole informatie kan zijn. De verkregen informatie werd gebruikt om het metabole netwerkmodel iRC1080 uit te breiden en te verfijnen.Hier vergelijken we de inhoud van het iRC1080-model en het uitgebreide model iBD1106, inclusief het aantal reacties, het aantal metabolieten en het aantal genen. We laten zien dat onze modelraffinage meer dan 254 reacties heeft toegevoegd aan het nieuwe netwerk. Deze reacties worden ingedeeld in aminozuren, dipeptiden, tripeptiden en transportreacties.De nieuw geïdentificeerde metabolieten werden gebruikt voor metabole netwerkuitbreiding en verfijning van het bestaande Chlamydomonas reinhardtii metabole model. De fenotype microarray assays kunnen worden gebruikt om metabole fenotypes van bestaande en nieuw geïsoleerde stammen te karakteriseren. Bovendien kan het protocol dat we gebruikten in de context van micro-algen de verfijning van metabole modellen van andere soorten begeleiden.

high-throughput-metabolic-profiling-for-model-refinements

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Werkwijze voor de bepaling van vetzuren en samenstelling microalgen gebaseerd op mechanische celdisruptie, oplosmiddelhoudende vetextractie, verestering en kwantificatie en identificatie van vetzuren met gaschromatografie wordt beschreven. Een tripentadecanoin interne standaard wordt gebruikt ter compensatie van eventuele verliezen bij de winning en onvolledige omestering.

Analyse van vetzuurgehalte en Compositie in Microalgen

Integratie van microalgencultivatiek met industrieel rookgas zal uiteindelijk zware metalen en andere anorganische verbindingen in de groeimedia introduceren. Deze studie presenteert een procedure die wordt gebruikt om het eindlot en de impact van zware metalen en anorganische verontreinigingen op de groei van Nannochloropsis salina gekweekt in fotobioreactoren te bepalen.

Kwantificering van zware metalen en andere anorganische contaminanten op de productiviteit van microalgen

De structuur en chemische eigenschappen van de plantencelmuur worden geëvalueerd om ideale grondstoffen voor biobrandstoffen en biomaterialen te identificeren. Standaardmethoden hebben beperkingen wanneer ze worden toegepast op grote datasets. Deze hoogdoorvoerpre-behandelings-, enzym-saccharificatie- en pyrolyse-moleculaire bundel massaspectrometrie-methoden vergelijken een groot aantal biomassamonsters met verminderde experimentele tijd en kosten.

High-throughput screening van weerspannigheid Variaties in lignocellulose: Total Lignine, Lignine monomeren, en enzymatische Sugar release

Een tweedimensionale gaschromatografie-tijd-van-vlucht-massaspectrometrie methode wordt beschreven voor de karakterisering van de waterige fractie van bio-crude geproduceerd uit hydrothermale liquefactie van algen. Dit protocol kan ook worden gebruikt om de waterige fractie van vloeibare producten te analyseren van snelle pyrolyse, katalytische snelle pyrolyse, katalytische deoxygenatie en hydro-behandeling.

Kwalitatieve Karakterisering van de waterfractie van hydrothermale liquefactie van algen gebruiken 2D gaschromatografie met Time-of-flight massaspectrometrie

Dit document beschrijft het montageproces en de werking van een fotokinetische biotactor met een schaalvergroting, die in combinatie met andere methoden kan worden gebruikt om de relevante kinetische groeiparameters te schatten. Dit systeem controleert de pH, het licht en de temperatuur voortdurend met behulp van sensoren, een dataverzamelings- en besturingseenheid en open-source data acquisition software.

Constructie en opstelling van een Benchschaal Alg Photosynthetic Bioreactor met Temperatuur, Licht en pH Monitoring voor Kinetische Groeitesten

Hier presenteren we een protocol om te bouwen van lab-schaal zeepbel kolom photobioreactors en ze gebruiken om cultuur microalgen. Het biedt ook een methode voor de bepaling van de groeisnelheid van de cultuur en de neutrale vetgehalte.

Teelt van groene microalgen in Bubble kolom Photobioreactors en een kwantitatieve analyse voor neutrale lipiden

Systeembrede analyse van meerdere biomoleules is cruciaal om functionele en mechanistische inzichten in biologische processen te krijgen. Hierbij wordt een uitgebreid protocol beschreven voor een hoge doorvoer extractie van lipiden, metabolieten, eiwitten en zetmeel uit een enkel monster geoogst uit gesynchroniseerde Chlamydomonas-cultuur.

Een multi-omics extractiemethode voor de diepgaande analyse van gesynchroniseerde culturen van de groene Alga Chlamydomonas Chlamydomonas

Bench-Scale, Axenische teelt vergemakkelijkt microalgal karakterisering en productiviteit optimalisatie voor verdere proces scale-up. Photobioreactoren zorgen voor de nodige controle voor betrouwbare en reproduceerbaar microalgal experimenten en kunnen worden aangepast om microalgen veilig te cultiveren met de corrosieve gassen (CO2, dus2, No2) van gemeentelijke of industriële verbrandingsemissies.

Microalgen teelt en biomassa kwantificering in een Fotobioreactor met een tafel schaal met corrosieve rookgas

Er wordt een protocol beschreven om de koolstofdioxide in het rookgas van aardgascentrales te gebruiken om microalgen te cultiveren in open raceway-vijvers. Rookgasinjectie wordt geregeld met een pH-sensor en de groei van microalgen wordt gemonitord met realtime metingen van de optische dichtheid.

Koppeling van koolstofafvang uit een energiecentrale met semi-geautomatiseerde open racewayvijvers voor de teelt van microalgen

Deze publicatie beschrijft het ontwerp van laboratoriumfotobioreactoren (PBR's) met aanpasbare lichtregimes. De groei van cyanobacteriën of microalgen, met bicarbonaat als koolstofbron, wordt continu bewaakt door de volumetrische zuurstofproductie te meten. Deze PBR's maken snelle, gerepliceerde laboratoriumgroeivergelijkingen mogelijk met weinig tussenkomst van de gebruiker tijdens experimenten.

Werking van laboratoriumfotobioreactoren met online groeimetingen en aanpasbare lichtregimes

Leer hoe je fenotype-microarray-technologie gebruikt voor metabole profilering van Chlamydomonas reinhardtii. Deze methode verfijnt metabole netwerkmodellen en identificeert nieuwe reacties voor algenonderzoek.

High-Throughput Metabole Profilering voor Modelverfijningen van Microalgen

Meer video's verkennen