Het bouwen van een eenvoudig en veelzijdig verlichtingssysteem voor optogenetische experimenten
12 januari 2021
Dit protocol beschrijft hoe optogenetische experimenten kunnen worden uitgevoerd voor het beheersen van genexpressie met rood en verrood licht met behulp van PhyB en PIF3. Inbegrepen zijn stapsgewijze instructies voor het bouwen van een eenvoudig en flexibel verlichtingssysteem, dat de controle van genexpressie of andere optogenetica met een computer mogelijk maakt.
Het systeem stelt onderzoekers in staat om eenvoudig een goedkoop en veelzijdig verlichtingssysteem voor optogenetische experimenten te bouwen. Voordelen van deze techniek zijn onder meer de mogelijkheid om de LED-verlichtingstiming te programmeren met beschikbare golflengten die het zichtbare nabij-IR-spectrum overspannen, en dat de LED's in verschillende contexten kunnen worden gebruikt Om een elektrisch circuit te bouwen, klemt u de printplaat op de helpende handen en plaatst u de jumperdraden, verbindt u ze om de A1- en A3-gaatjes op de grond te vormen, de D2 jumper draad in de D6 pinhole, en de voeding plus nummer zeven jumper draden in de A7 pinhole. Buig de terminals 45 graden en voeg flux toe.
Na het solderen knipt u de achterkanten van de draden bij. Steek het ene uiteinde van de gesoldeerde vrouwelijke draad naar de draadconnector in het A5-gat. Sluit vervolgens het ene uiteinde van de weerstand aan op het A5-gat.
Sluit het andere uiteinde van de connector aan op de massa. Sluit vervolgens het andere uiteinde van de weerstand aan op de massa en soldeer de verbinding. Voor de Arduino-connector krimpt u de uiteinden van de draad naar draadconnectoren en duwt u de gekrompen uiteinden door de rechthoekige connector.
Om de LED's op te zetten, kunt u een draad tin door van onderaf te verwarmen terwijl u soldeer van bovenaf toevoegt. Plaats een royale hoeveelheid soldeermiddel over de grote soldeerpunt en gebruik de punt om de LED-basis te verwarmen bij het contact met flux. Sleep na een paar seconden het soldeer individueel over elk contact en bevestig de zwarte draad op de kathode met behulp van een haarclip.
Plaats een royale hoeveelheid soldeer op de grote soldeerpunt en druk de punt op de draad totdat het soldeer op de LED-basis smelt. Houd de draad ingedrukt en verwijder de soldeerbout terwijl u de draad op zijn plaats houdt. Plaats een kleine hoeveelheid soldeerpasta op de pads voor de LED-aansluitingen en gebruik een tang om de LED over de pads te plaatsen.
Houd de voorgeklikte rode draad op de anode en gebruik een haarclip om de draad te knippen. Voeg soldeer toe aan de grote punt zoals gedemonstreerd en druk de punt op de aansluiting totdat het soldeer op de LED-basis smelt en de soldeerpasta smelt en zilver wordt. Voor het maken van de LED-draden plaatst u een krimpbuis van 4,76 millimeter over de op lengte gesneden draad en een krimpbuis van 3,18 millimeter over de draad-naar-draadconnector.
Strip en voeg flux toe aan de draaduiteinden. Gebruik de helpende handen om de draad naar de draadconnector te knippen en draai het connectoruiteinde met één draaduiteinde. Soldeer de materialen aan elkaar en bevestig de andere draad op dezelfde manier aan de opstelling en soldeer.
Klem vervolgens de LED-draden aan de helpende handen met tape onder de LED-basis. Meng vervolgens epoxy volgens de instructies van de fabrikant en verdeel de epoxy over de bovenkant van de gesoldeerde LED. Boor met behulp van de spadeboor een gat van 1,5 centimeter door de bovenkant van de doos waarop de LED wordt geplaatst en gebruik een snel roterend gereedschap om een inkeping aan één kant van het gat te maken om ruimte te maken voor de LED-draad.
Plak een stuk privacyfilm van 25 tot 30 millimeter op de zwarte doos die het gat bedekt waar de LED doorheen zal branden en plak de LED buiten de zwarte doos op het gat. Boor voor een vier LED-besturingssysteem vier gaten van 0,83 centimeter op 3,81 centimeter afstand van elkaar in het deksel van de doos en gebruik een snel roterend gereedschap om een rechthoekig gat van 1,19 bij 1,90 centimeter in de linkerbovenhoek te snijden. Boor met behulp van een spadeboor een gat van 1,5 centimeter in de achterkant van de doos en steek een grommet in het gat.
Schuur voor de computergestuurde LED's het gebied waar de microcontroller in de doos wordt gelijmd en de onderkant van de microcontrollerhouder. Klik de microcontroller op de houder en epoxy vervolgens de houder en de doos samen voordat u de houder in de zwarte doos vastzet. Plaats vervolgens dubbelzijdige tape op de clip en bevestig de clip in de doos.
In monsters die zijn getransfecteerd om fytochroom B tot expressie te brengen, maar niet fycocyanine biline, neemt de lekheid toe naarmate de hoeveelheid reporter-DNA toeneemt. Bovendien, wanneer de volledige fytochroom B-genschakelaar inclusief de phycocyanine bilin chromofour producerende plasmide wordt verlicht met ver rood licht, neemt luciferase-expressie ook toe met de toenemende hoeveelheden reporterconstructie binnen de transfectiemix. Evenzo, wanneer de lichtgevoelige cellen worden verlicht met rood licht, neemt de luciferase-expressie ook toe met een verhoogde hoeveelheid reporter.
Bij het vergelijken van inductieniveaus van de met rood licht behandelde cellen met de met rood licht behandelde cellen, wordt een kleine afname van de vouwactivering gevonden bij toenemende hoeveelheden reporter. Het is essentieel om elke stap zorgvuldig te volgen bij het bouwen van het elektrische circuit en om de pinhole-nummers regel voor regel te controleren voordat u elk onderdeel soldeert. Dit protocol kan worden gebruikt voor de optische stimulatie van vele soorten monsters of optogenetische hulpmiddelen met behulp van een verscheidenheid aan golflengten en maakt het programmeren van verlichtingsschema's mogelijk.
Overzicht
Dit protocol beschrijft de constructie van een veelzijdig verlichtingssysteem voor optogenetische experimenten, waarmee controle van genexpressie met rood en verrood licht mogelijk is. Stap-voor-stap instructies worden gegeven voor het bouwen van het systeem en het programmeren van LED-verlichting.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Optogenetica
- Genexpressie controle
- Verlichtingssystemen
Achtergrond
- Optogenetica maakt precieze controle van cellulaire functies met behulp van licht mogelijk.
- PhyB en PIF3 zijn sleutelcomponenten in lichtresponsieve genregulatie.
- LEDs kunnen worden geprogrammeerd voor verschillende verlichtingsschema's.
- Dit systeem is ontworpen om kosteneffectief en aanpasbaar te zijn voor verschillende experimentele opstellingen.
Doel van de Studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor het construeren van een optogenetisch verlichtingssysteem.
- Om onderzoekers in staat te stellen genexpressie te controleren met behulp van specifieke golflengten van licht.
- Om het gebruik van optogenetische tools in diverse experimentele contexten te vergemakkelijken.
Gebruikte Methoden
- Constructie van een elektrische circuit voor LED controle.
- Programmeren van LED verlichting timing en golflengten.
- Assembleren van een microcontroller voor geautomatiseerde controle.
- Testen van het systeem met verschillende reporter constructies.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle constructie van een flexibel verlichtingssysteem.
- Verhoogde luciferase expressie waargenomen met hogere hoeveelheden reporter DNA.
- Aangetoond controle over genexpressie met behulp van rood en verrood licht.
- Systeem staat optische stimulatie toe over verschillende monstersoorten heen.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor optogenetisch experimenteren.
- Onderzoekers kunnen dit systeem gebruiken voor verschillende toepassingen in genregulatie.
- Zorgvuldige naleving van het protocol verzekert succesvolle resultaten.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Optogenetic control of cellular pathways enables precise mechanistic interrogation in target validation and phenotypic screening. A low-cost, programmable illumination system supports reproducible light delivery for gene expression studies, reducing technical variability in preclinical models. This approach enhances predictive confidence by allowing standardized optical stimulation across diverse experimental contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables hypothesis testing of light-sensitive gene switches to clarify pathway function and target mechanism.
- Operational Value: Provides adjustable LED intensity and timing for controlled perturbation of signaling pathways in cellular assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports preparation of standardized biological systems for quantifying optogenetic responses across compound or genetic perturbations.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through programmable illumination schedules and wavelength selection for reproducible readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates continuity from discovery through preclinical validation by enabling optical stimulation of disease-relevant systems with tunable light parameters.
- Operational Value: Allows risk-adjusted advancement decisions by quantifying dose-dependent responses to red and far-red light in reporter-based assays.
Pipeline & Workflow Integration
The illumination system integrates into discovery biology workflows by enabling controlled optical perturbation of gene expression, supporting lead identification through quantifiable phenotypic outputs.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by allowing precise temporal and spatial control of optogenetic tools to interrogate target function.
- Screening: Enables quantitative dependent variable measurements such as luciferase expression under defined illumination conditions.
- Analytics: Generates reproducible light-dose response data that inform statistical analysis for target validation and hit confirmation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing a reusable platform for testing optogenetic constructs in disease models.
- Enterprise Reuse: Designed as a scalable, adaptable capability for multiple projects requiring optical control of cellular processes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in light-controlled experiments.
- Operational Value: Standardization and scalability of illumination protocols across laboratories and experimental setups.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via reliable, quantifiable optogenetic readouts that reduce false positives in target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on reproducible optical stimulation outcomes.
Implementation Considerations
- Basic electronics proficiency for circuit assembly and soldering of LED connections.
- Access to Arduino-compatible microcontrollers and soldering instrumentation for system construction.
- Standardization of illumination protocols across teams to ensure reproducible experimental conditions.
- Adaptation considerations for different optogenetic tools requiring specific wavelengths or intensity ranges.
- Practical limitation: Manual calibration may be required to optimize LED positioning and light penetration for specific sample types.
