Elektrisch-veld-geïnduceerde neurale precursor celdifferentiatie in microfluïdische apparaten
14 april 2021
In deze studie presenteren we een protocol voor de differentiatie van neurale stam- en voorlopercellen (NPC's) die uitsluitend worden geïnduceerd door gelijkstroom (DC) pulsstimulatie in een microfluïdisch systeem.
Deze studie presenteert een protocol voor de differentiatie van neurale precursorcellen die uitsluitend worden geïnduceerd door gelijkstroompulsstimulatie in een microfluïdisch systeem. Deze techniek biedt een gunstige aanpak voor het verminderen van de experimentele insteltijd, het monstervolume en het reagensvolume. Verder is de MOE-chip geschikt voor confocale microscopie observaties.
De eenvoudige gelijkstroompulsbehandeling kan het lot van de neurale precursorcellen van muizen controleren en kan worden gebruikt om therapeutische strategieën voor aandoeningen van het zenuwstelsel te ontwikkelen. Teken om te beginnen patronen voor afzonderlijke PMMA-lagen en de dubbelzijdige tape met behulp van de juiste software. Schakel de koolzuurlaserschrijver in en sluit deze aan op een personal computer.
Open het ontworpen patroonbestand met behulp van de software. Plaats de PMMA-vellen of dubbelzijdige tape op het platform van de laserschrijver en richt de laser vervolgens op het oppervlak van de PMMA-vellen of de dubbelzijdige tape met behulp van het gereedschap voor automatisch scherpstellen. Selecteer de laserschrijver als printer en gebruik vervolgens de laserschrijver om de directe ablatie op het PMMA-vel of dubbelzijdige tape te starten.
Verwijder de beschermfolie van de PMMA-platen en reinig het oppervlak met stikstofgas. Voor het aan elkaar lijmen van meerdere lagen PMMA-platen, stapelt u drie stukken van een millimeter PMMA-vellen en bindt u deze onder een druk van vijf kilogram per vierkante centimeter in een thermische verlijmer gedurende 30 minuten bij 110 graden Celsius om de stroom- of elektrische stimulatiekanaalassemblage te vormen. Hecht 12 stuks adapters aan de afzonderlijke openingen in laag één van de MOE-spaanassemblage met snelwerkende cyanoacrylaatlijm.
Desinfecteer de PMMA-substraten van één millimeter, de dubbelzijdige tape en de drie millimeter optische kwaliteit PMMA met behulp van ultraviolette bestraling gedurende 30 minuten voordat u de chip monteert. Hecht de PMMA-substraten van één millimeter op de drie millimeter optische kwaliteit PMMA met de dubbelzijdige tape om de PMMA-assemblage te voltooien. Bevestig het gereinigde afdekglas met de dubbelzijdige tape aan de PMMA-montage.
Sluit de openingen van de agarbrugadapters af met witte vingerdichte stekkers. Sluit de platte bodemconnector aan op de MOE-chipassemblage via de medium inlaat- en uitlaatadapters en sluit vervolgens de cone Luer-adapter aan op de driewegskraans. Voeg twee milliliter 0,01% PLL-oplossing toe met behulp van een spuit met drie milliliter die verbinding maakt met de driewegskraan van de middelgrote inlaat en sluit een lege spuit van drie milliliter aan op de driewegskraan van de mediumuitlaat.
Vul de celkweekgebieden met de PLL-oplossing en pomp de coatingoplossing langzaam heen en weer. Sluit de twee driewegkranen om de oplossing binnen de cultuurgebieden af te dichten. Incubeer de MOE-chip 's nachts op 37 graden Celsius in een incubator gevuld met 5% kooldioxideatmosfeer.
Open de twee driewegskraans en spoel bellen weg in de kanalen door de coatingoplossing handmatig heen en weer in het kanaal te pompen met behulp van de twee spuiten. Trek drie milliliter compleet medium in een spuit van drie milliliter die verbinding maakt met de driewegkraan van de medium inlaat en voeg deze toe om de coatingoplossing in de celkweekgebieden te vervangen. Vervang de witte vingerdichte stekker door de Luer-adapter en injecteer 3% hete agarose om de adapter te vullen.
Sluit de Luer-slotspuit aan op de Luer-adapter en injecteer 3% hete agarose door de zwarte rubberen bong om de Luer-slotspuit te vullen. Laat 10 tot 20 minuten staan voordat de agarose afkoelt en stolt. Installeer de cell seeded MOE-chip op de transparante ITO-kachel die is bevestigd op een programmeerbare XYZ gemotoriseerde fase die op 37 graden Celsius wordt gehouden.
Infuseer de mNPC's door handmatig via de medium-uitlaat in de MOE-chip te pompen en vervolgens de gezaaide MOE-chip op de ITO-kachel gedurende vier uur te incuberen. Gebruik elektrische draden om een EF multiplexer via de elektroden op de chip op de MOE-chip aan te sluiten. Sluit een EF-multiplexer en een functiegenerator aan op een versterker om dc-pulsen met vierkante golven uit te voeren.
Verwijder alle platte bodemconnector en adapters op de MOE-chip en vul de adapters met PBS en sluit vervolgens de adapteropeningen af met parafilm. Observeer na immunostaining de cellen met behulp van een confocale fluorescentiemicroscoop. De DC-pulsstimulatie resulteerde in gelijktijdige mNPC's die zich differentiëren in neuronen, astrocyten en oligodendrocyten in stamcelonderhoudsmedium.
De percentages neuronen, astrocyten en oligodendrocyten in de controlegroep en in de stimulatiegroep worden hier weergegeven. Na de DC-pulsbehandeling drukten de mNPC's significant hoge aantallen neuronen uit bij DIV zeven, astrocyten bij DIV 3 en oligodendrocyten bij DIV zeven en DIV 14 waren aanwezig op relatief hogere niveaus in de stimulatiegroepen dan in de controlegroep. Neurosferen gevormd door 30 tot 40 cellen hebben de voorkeur voor het initiëren van mNPC-differentiatie.
Overgroei van mNPC's zal de celoverleving tijdens het differentiatieproces aantasten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor de differentiatie van neurale precursorcellen geïnduceerd door stimulatie met gelijkstroompulsen in een microfluïdisch systeem. Deze techniek vermindert de tijd voor de experimentele opzet, het monster- en reagentievolume, waardoor het efficiënt is voor onderzoeksapplicaties.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Microfluidica
Achtergrond
- Neurale precursorcellen (NPC's) zijn essentieel voor het begrijpen van de neurale ontwikkeling.
- Stimulatie met gelijkstroompulsen kan het lot van de cellen beïnvloeden.
- Microfluïdische systemen maken een nauwkeurige controle van de experimentele condities mogelijk.
- Deze aanpak kan helpen bij de ontwikkeling van therapieën voor aandoeningen van het zenuwstelsel.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol op te stellen voor de differentiatie van NPC's.
- Om gelijkstroomstimulatie te gebruiken als methode om het cellot te beheersen.
- Om de effectiviteit van een microfluïdisch systeem in neurowetenschappelijk onderzoek aan te tonen.
Gebruikte methoden
- Het ontwerpen van patronen voor PMMA-lagen en dubbelzijdige tape.
- Het gebruik van een kooldioxide-lasersnijder voor de fabricage.
- Het toepassen van gelijkstroompulsstimulatie op NPC's.
- Het uitvoeren van confocale microscopie-observaties voor analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle differentiatie van NPC's met behulp van het voorgestelde protocol.
- Vermindering van de tijd voor de experimentele opzet en het gebruik van middelen.
- Haalbaarheid van het gebruik van de MOE-chip voor microscopie.
- Potentiële toepassingen in therapeutische strategieën voor aandoeningen van het zenuwstelsel.
Conclusies
- Het protocol biedt een gestroomlijnde aanpak voor de differentiatie van NPC's.
- Directstroomstimulatie is effectief bij het beheersen van het cellot.
- Microfluïdische systemen verbeteren de experimentele efficiëntie in de neurowetenschappen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit microfluidische platform maakt nauwkeurige controle van de differentiatie van neurale precursorcellen mogelijk middels stimulatie met gelijkstroompulsen, wat een schaalbaar en hulpbronenefficiënt model biedt voor targetvalidatie in onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten. Door de experimentele complexiteit en het verbruik van reagentia te verminderen, ondersteunt het de vroege mechanistische risicoreductie en het voorspellende vertrouwen in strategieën voor de modulatie van het cellot. De compatibiliteit van het systeem met langdurige stimulatie en geautomatiseerde beeldvorming maakt het geschikt voor integratie in discovery-workflows die gericht zijn op therapeutica voor het zenuwstelsel.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar elektrische signalen als regulatoren van het lot van neurale precursocellen mogelijk, ter ondersteuning van hypothesetesten van doelwitten in neurodevelopmentale paden.
- Operationele waarde: Vermindert monster- en reagentvolumes door microfluïdische opsluiting, waardoor de kosten bij vroege screeningcampagnes voor doelwitten worden verlaagd.
- Predictieve waarde: Biedt kwantitatieve read-outs van neuronale, astrocytaire en oligodendrocytaire differentiatie, wat datagestuurde go/no-go beslissingen over modulerende doelwitten mogelijk maakt.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare differentiatieresultaten onder gecontroleerde parameters van het elektrische veld, geschikt voor de optimalisatie van assays.
- Operationele waarde: Faciliteert het multiplex-testen van condities via kanaalgebaseerde ontwerpen, wat de doorvoer bij de evaluatie van verbindingen of stimuli verhoogt.
- Assay-gereedheid: Ondersteunt langetermijnkweek en time-lapse imaging, waardoor kinetische profilering van differentiatiedynamiek voor assay-validatie mogelijk wordt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Maakt gebruik van neurale precursorcellen van muizen in een gedefinieerde micro-omgeving, waardoor de relevantie voor in vivo neurale differentiatieprocessen wordt vergroot.
- Preklinische Modellering: Ondersteunt de generatie van gliale en neuronale lijnen vanuit een gemeenschappelijke progenitor, wat nuttig is voor het modelleren van aandoeningen van het zenuwstelsel.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Maakt beoordeling van differentiatiebias onder stimulatie mogelijk, wat bijdraagt aan mechanistische veiligheids- en werkingsprofielen.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen het continuüm van vroege ontdekking, met name in de fasen van targetvalidatie en leadidentificatie, waar een mechanistisch begrip van regulatoren van het cellot cruciaal is. Het ondersteunt screeningscampagnes door een gecontroleerd, kwantificeerbaar systeem te bieden voor het beoordelen van de biologische activiteit van elektrische of farmacologische modulatoren. De output van het platform — lineage-specifieke differentiatiemetrieken — wordt ingevoerd in analyse-pipelines die worden gebruikt om targets te prioriteren met voorspellend vertrouwen in neurale herstelmechanismen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van bio-elektrische signaleringspaden in neurale precursorcellen, waardoor ambiguïteit in het doelmechanisme wordt verminderd.
- Screening: Maakt reproduceerbare, kwantitatieve differentiatie-assays mogelijk onder gedefinieerde elektrische stimulatie, wat de betrouwbaarheid van de assay verbetert.
- Analytics: Levert meetbare eindpunten (bijv. % neuronen, astrocyten, oligodendrocyten) voor comparatieve analyse tussen verschillende condities.
- Translational Research: Modelleert differentiatiedynamiek die relevant is voor stoornissen van het zenuwstelsel, wat de preklinische continuïteit ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Ontworpen voor herhaald gebruik onder meerdere experimentele condities, wat standaardisatie en consistentie tussen projecten bevordert.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in targetvalidatie door elektrische stimulatie te isoleren als een gedefinieerde variabele bij de bepaling van het cellot.
- Operationele waarde: Standaardiseert differentiatieprotocollen door microfluïdische precisie, waardoor de reproduceerbaarheid tussen locaties en teams wordt verbeterd.
- Strategische waarde: Versnelt go/no-go-beslissingen door vroege, mechanistische read-outs van lineage commitment te leveren, wat het risico op falen in een laat stadium vermindert.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering mogelijk van targets die neurale differentiatie moduleren, wat de kapitaalefficiëntie in neurowetenschappelijke portfolio's verbetert.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de assemblage van microfluïdische apparaten, elektrofysiologie en kweek van neurale stamcellen.
- Is afhankelijk van toegang tot laserfabricatietools, ITO-verwarmers, EF-multiplexers en inverted microscopiesystemen.
- Necessiteert standaardisatie van elektrische parameters (pulsbreedte, frequentie, amplitude) over experimenten heen voor reproduceerbare resultaten.
- Aanpassing aan neurale precursorcellen van menselijke oorsprong kan optimalisatie van stimulatieparameters en kweekcondities vereisen.
- Langetermijnstabiliteit van elektroden en biofouling bij chronische stimulatiestudies vormen praktische beperkingen om rekening mee te houden.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:46
Design and Fabrication of the Multichannel, Optically Transparent, Electrotactic Chip and Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions
2:49
Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions and Preparation of the Salt Bridge Network
4:47
Setup of the Microfluidic System for DC Pulse Stimulation
5:55
Results: Differentiation of the mNPC Cells in the Control Group and in the DC Pulse Stimulation Group at DIV 3, 7, and 14
6:43
Conclusion
