Cerebellaire regionale dissectie voor moleculaire analyse

Traditionele moleculaire studies van het cerebellum zijn uitgevoerd op volledige cerebellaire extracten, wat eventuele verschillen tussen specifieke cerebellaire regio's kan maskeren. Dit protocol maakt het mogelijk om afzonderlijke regio's van het cerebellum te beoordelen en stelt ons in staat om moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag kunnen liggen aan hun unieke bijdragen aan verschillende gedragingen en ziekteprogressie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de reproduceerbare en snelle dissectie van vier cerebellaire regio's mogelijk maakt: de diepe cerebellaire kernen, de voorste en achterste cerebellaire cortex van de Vermis en de cerebellaire cortex van de hemisferen.

Na het onthoofden van de geëuthanasieerde muis, maak een incisie met een scheermes langs de mediale sagittale lijn van het hoofd, beginnend bij de neus en doorlopend tot achteraan. Scheid de huid en gebruik het scheermes om de spieren aan elke kant weg te snijden, door te snijden tot voorbij de gehoorkanalen. Gebruik dissectiescharen om veel wervelkolomregio's bij te snijden tot waar de hersenstam het cerebellum ontmoet, en zorg ervoor dat het cerebellum niet beschadigd raakt.

Plaats een van de vaatjes van de schaar in de ruimte tussen de hersenstam en de wervelkolom en snij richting het gehoorkanaal, terwijl u omhoog tilt tijdens het snijden om schade aan het weefsel te beperken. Blijf snijden langs de rand van de schedel tot aan de reukbollen. Gebruik de stompe pincet om voorzichtig de achterkant van de schedel af te pellen om de achterste regio van de hersenen en het cerebellum bloot te leggen.

Plaats de stompe pincet langs de gesneden rand van de schedel en pel de schedel omhoog en over de hersenen. Snijd de rest van de schedel af met de vaatjescharen en stompe pincet, waarbij u de meeste delen van de bovenkant van de hersenen verwijdert. Til de hersenen licht op met de microspatel om de reukbollen van de resterende schedel te verwijderen en de optische tractusvezels los te koppelen.

De hersenen zouden op dit punt gemakkelijk los moeten komen. Plaats de hersenen in de petrischaal, die op ijs staat, en verwijder eventueel resterend schedelstuk of ander puin. Plaats de hersenen voorzichtig in de hersenmatrix met de dorsale zijde naar boven.

Zorg ervoor dat deze vlak in de matrix staat en dat de middenlijn in het midden is. Plaats een scheermes langs de sagittale middenlijn, en zorg ervoor dat het mes helemaal tot de bodem van de matrix doordringt. Plaats een ander scheermes één millimeter naast het eerste mes.

Plaats twee meer mesjes, waardoor er drie mesjes aan één kant van de hersenen zijn, allemaal één millimeter uit elkaar. Herhaal dit aan de andere kant. Grijp voorzichtig de voor- en achterkant van de scheermessen en til ze recht omhoog uit de matrix.

Gooi het weefsel aan de buitenkant van de scheermessen weg. Scheid langzaam één scheermes tegelijk van de andere, en zorg ervoor dat de weefselsecties niet beschadigd raken. Schuif de weefselsectie van het scheermes af en plaats deze met de microspatel op de glazen plaat.

Er moeten zes sagittale hersensecties worden verzameld. De voorste laterale secties zullen DCN zichtbaar hebben. Om de DCN te isoleren, houd een trim tot 200 microliter pipette tip loodrecht over de DCN en druk stevig door het weefsel heen terwijl u in alle richtingen zwaait.

Til de pipette op en bevestig visueel de aanwezigheid van het weefsel in de punt. Plaats een vinger aan de bovenkant van de punt en druk naar beneden, waardoor het weefsel uitpuilt. Plaats de punt in een correct gelabelde microfichebuis en zorg ervoor dat de weefselpons in de bodem van de buis wordt geplaatst.

Herhaal dit voor de resterende drie secties, en plaats de DCN-ponsen in dezelfde buis. Bevries de buis snel in vloeibare stikstof. Duw de rest van het hersenweefsel rond het cerebellum weg in de secties waar de DCN is geëxtraheerd.

Gebruik stompe pincet om voorzichtig deze hemisferische cerebellaire cortexsecties op te pakken en plaats ze in respectieve microfichebuizen, en bevries ze vervolgens snel. Voor de laatste twee vermale secties, duw omliggend hersenweefsel weg om alleen het cerebellum over te laten. Gebruik een scheermes om een snede te maken die de voorste labialen scheidt van de achterste labialen.

Zorg ervoor dat de snede net na de vorming van labiale zes is en niet labiale 10 omvat. Gebruik stompe pincet om voorzichtig de voorste cerebellaire cortexsecties en achterste cerebellaire cortexsecties in hun respectieve microfichebuizen te plaatsen en bevries ze snel door de buizen vijf minuten in vloeibare stikstof te laten staan. Plaats de microfichebuizen op ijs om te voorkomen dat het weefsel te snel ontdooit en breng 150 microliter koude RNA-isolatieoplossing in de microfichebuis aan, en homogeniseer met een gesteriliseerde stamper.

Zodra het weefsel gehomogeniseerd is, pipet de oplossing op en neer om er zeker van te zijn dat er geen intact weefsel meer over is. Verder, breek eventuele kleine weefselstukken op door het een paar keer in een insulinespuit te trekken. Voeg nog eens 350 microliter van het reagens toe, pipet op en neer om grondig te mengen en laat het vijf minuten op kamertemperatuur staan.

Voeg 150 microliter chloroform toe aan de buis en schud deze krachtig, laat het vervolgens twee tot drie minuten rusten. Centrifugeer bij 12.000 keer G bij 15 graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig de buizen uit de centrifuge en stel de temperatuur van de centrifuge in op vier graden Celsius.

Breng alleen de heldere waterige fase over in een nieuwe buis, en zorg ervoor dat de ondoorzichtige interface niet wordt verstoord. Bewaar of gooi de resterende oplossing in de buizen weg. Voeg 100% isopropylalcohol toe in een verhouding van één op twee en meng grondig door op en neer te pipetten.

Laat het monster gedurende 10 minuten op kamertemperatuur staan om het RNA uit de oplossing te laten be