Xenopus laevis | Voorbereiding van ei-extract en live beeldvormingsmethoden voor het visualiseren van dynamische cytoplasmatische organisatie
6 juni 2021
We beschrijven een methode voor de bereiding en live beeldvorming van onverdunde cytoplasmatische extracten van Xenopus laevis-eieren .
Deze methode is geschikt voor live beeldvorming van cytoplasmatische dynamica met behulp van kikkereierenextracten, waardoor de studie van ruimtelijke patrooninformatie in het cytoplasma mogelijk wordt. Monsters kunnen worden gevormd tot een laag met een uniforme en instelbare dikte en worden afgebeeld over een 2D-veld of 3D-volume. Deze methode is kosteneffectief en eenvoudig te implementeren.
Begin met het aanbrengen van een laag FEP-plakband op een glazen glijbaan met een rollerapplicator. Knip overtollige tape over de randen af met een schoon scheermesje. Bereid vervolgens FEP-tape gecoate afdekslips op dezelfde manier voor.
Breng vervolgens een dubbelzijdige kleverige beeldafstandhouder aan op de met FEP-tape gecoate kant van de dia, waarbij de beschermende voering ongepeld blijft. Breng de eieren over in een glazen bekerglas van 400 milliliter en verwijder zoveel mogelijk legbuffer door te decanteren. Incubeer vervolgens de eieren in 100 milliliter vers bereide dejellying-oplossing en draai ze voorzichtig rond.
Giet na ongeveer drie minuten de oplossing af en voeg 100 milliliter verse dejellying-oplossing toe. Ga door met de incubatie totdat de eieren stevig zijn verpakt, maar vermijd eieren langer dan vijf minuten in de dejellying-oplossing te laten zitten. Verwijder na de incubatie de dejellying-oplossing zoveel mogelijk en was de eieren in een buffer van 0,25x MMR.
Draai de eieren rond en giet vervolgens de buffer af. Herhaal dit een paar keer totdat in totaal een liter van de buffer is gebruikt voor de wasbeurten. Was vervolgens de eieren een paar keer met een totaal van 400 milliliter eierlysisbuffer, waarbij abnormale eieren tussen de wasbeurten worden verwijderd.
Gebruik vervolgens een transferpipet met een brede gesneden punt om de eieren over te brengen naar een 17 milliliter ronde bodemcentrifugebuis met één milliliter eierlysisbuffer. Draai de buis in een klinische centrifuge op 400 g gedurende 15 seconden om de eieren te verpakken. Verwijder vervolgens zoveel mogelijk van de eierlysisbuffer met een Pasteur-pipet.
Bepaal het geschatte volume van de verpakte eieren. voeg vervolgens vijf microgram per milliliter elk van aprotinine, leupeptine en cytochalasine B en 50 microgram per milliliter cyclohexamide direct bovenop de verpakte eieren toe. Plet de eieren door de buis gedurende 15 minuten te centrifugeren op 12.000 g en vier graden Celsius in een zwaaiende emmerrotor.
Bevestig vervolgens een naald van 18 gauge aan een spuit. Met de schuine kant van de naaldpunt naar boven prikt u de buis vanaf de zijkant aan de onderkant van de cytoplasmatische laag door en herstelt u het extract door langzaam te tekenen. Breng het teruggewonnen cytoplasmatische extract over naar een nieuwe microcentrifugebuis en bewaar het op ijs.
Wanneer u klaar bent om te imagen, vult u het extract aan met de gewenste reagentia en fluorescentiebeeldvormingsondes. Verwijder de bovenste beschermende voering van de beeldvormende afstandhouder op de voorbereide dia en deponeer ongeveer zeven microliter extract in het midden van de put. Breng onmiddellijk de FEP tape gecoate afdekslip aan met de FEP-kant naar het extract gericht om de put af te dichten en ga snel over tot beeldvorming.
Plaats de dia op een omgekeerde of rechtopstaande microscoop met een gemotoriseerd podium en een digitale camera. Beeld de extracten af op de gewenste ruimtelijke posities in tijdsintervallen in zowel heldere veld- als fluorescentiekanalen. Een time-lapse-experiment met xenopus laevis-ei-extracten om de zelforganisatie van het cytoplasma tijdens interfase te bestuderen, wordt hier getoond.
Na ongeveer 20 minuten incubatie bij kamertemperatuur waren gebieden uitgeput van lichtverstrooiing cytoplasmatische componenten zichtbaar in zowel heldere veld- als mitochondriënkanalen. Tegen ongeveer 60 minuten bij kamertemperatuur moet een ruimtelijk patroon bestaande uit celachtige compartimenten goed zijn vastgesteld met microtubuli die een holle kransachtige structuur vormen en mitochondriën die duidelijk in elk compartiment zijn verdeeld. Een vergelijking van de extractprestaties in beeldkamers met en zonder FEP-tapes op glas wordt hier getoond.
In de kamer gemaakt met FEP getapt glas het extract zelf georganiseerd in normale celachtige patronen. In de kamer waar de glasoppervlakken niet door de FEP-tape werden bedekt, vertoonde het extract abnormale heldere veld- en microtubulepatronen die in de loop van de tijd steeds meer verstoord raakten. Er werden geen significante verschillen waargenomen in de nucleaire import van het GST-mCherry-NLS eiwit.
De belangrijke dingen om te onthouden zijn om de glazen oppervlakken te passiveren met FEP-tape en om alle slechte eieren te verwijderen tijdens de extractvoorbereiding. Met dit systeem kunnen we eenvoudig de dikte van het extractmonster regelen, waardoor de weg wordt vrijgemaakt voor het in beeld brengen van cytoplasmatische patronen in 3D, met behulp van light sheet microscopie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een gestroomlijnde methode voor het prepareren en live imageren van onverdunde cytoplasmatische extracten van Xenopus laevis-eieren. De techniek maakt het mogelijk om cytoplasmatische dynamiek en de ontwikkeling van ruimtelijke patronen binnen het cytoplasma te onderzoeken, wat inzicht geeft in de cellulaire organisatie.
Belangrijkste componenten van het onderzoek
Onderzoeksgebied
- Celbiologie
- Microscopie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Cytoplasmatische dynamiek is cruciaal voor het begrijpen van de cellulaire organisatie.
- Extracten van kikker-eicellen bieden een relevant systeem voor het bestuderen van deze processen.
- Live-imagingtechnieken maken de exploratie van ruimtelijke patroonvorming in het cytoplasma mogelijk.
Gebruikte methoden
- Bereiding van onverdunde cytoplasmatische extracten uit Xenopus laevis-eieren.
- Gebruik van FEP-tape voor monsterstabiliteit tijdens beeldvorming.
- Live-imaging met gebruik van fluorescente markers en lichtveldmicroscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van zelforganisatie in cytoplasmatische extracten gedurende een bepaalde tijd.
- Vorming van celachtige compartimenten met gedefinieerde microtubuli-structuren.
- Vergelijking van de beeldvormingsprestaties op basis van oppervlaktebehandelingen wees op significante effecten op de organisatie van het extract.
Conclusies
- De studie beschrijft een praktische methode voor het in beeld brengen van cytoplasmatische structuren en dynamiek.
- De resultaten verbeteren ons begrip van cellulaire processen en benadrukken het belang van preparatietechnieken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze methode maakt live-imaging van cytoplasmatische dynamiek in eiextracten van Xenopus laevis mogelijk, wat een schaalbaar en kosteneffectief systeem biedt voor het bestuderen van ruimtelijke patroonvorming en zelforganiseringsprocessen die relevant zijn voor de cellulaire organisatie. Door het elimineren van de noodzaak voor chemische oppervlaktebehandelingen en het gebruik van in massa geproduceerde verbruiksartikelen, ondersteunt het een reproduceerbare, hoge-resolutie visualisatie van de organisatie van microtubuli, kernen en mitochondriën in een gecontroleerde in vitro omgeving. De aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen in mechanistische studies naar cytoplasmatisch gedrag, wat vroege targetvalidatie en assay-ontwikkeling in discovery-pipelines ondersteunt.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen met betrekking tot cytoplasmatische zelforganisatie en ruimtelijke patroonvormingsmechanismen te onderzoeken.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door dynamische cytoplasmatische organisatie te visualiseren in een fysiologisch relevant extractsysteem.
- Translationele biomarker: Faciliteert de identificatie van dynamische cytoplasmatische kenmerken die kunnen correleren met functionele cellulaire toestanden.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Standaardisatie van de assay: Biedt een reproduceerbaar platform voor het bereiden van extracten met een uniforme dikte en stabiliteit door middel van FEP-tape passivering.
- Kwantitatieve resultaten: Maakt meting van cytoplasmatische dynamiek en ruimtelijke organisatie mogelijk via time-lapse brightfield- en fluorescentie-imaging.
- Klaar voor screening: Biedt een schaalbaar, kosteneffectief systeem dat compatibel is met wide-field- en confocale microscopie voor de evaluatie van het effect van verbindingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevant systeem: Dient als mechanistisch model voor het bestuderen van geconserveerde cytoplasmatische processen die relevant zijn voor celdeling en organisatie.
- Voorspellende betrouwbaarheid: Ondersteunt het verminderen van risico's bij targets die betrokken zijn bij cytoskeletregulatie en ruimtelijke patroonvorming door directe visualisatie van de zelforganisatie van het extract.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekkingswaarnemingen en preklinische validatie door het vaststellen van een consistent, beeldvormingsklaar cytoplasmatisch model.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege hypothesetoetsing van targets tot assayontwikkeling en preklinische validatie, in het bijzonder voor targets die de cytoskeletdynamiek en subcellulaire organisatie beïnvloeden.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door directe visualisatie van microtubuli- en mitochondriële dynamiek in interfasestracten mogelijk te maken.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde extractbereiding en stabiele beeldvormingscondities zonder chemische oppervlaktebehandelingen.
- Analytics: Genereert kwantitatieve spatiale en temporele data over cytoplasmatische organisatie, wat comparatieve analyse tussen verschillende condities mogelijk maakt.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan op preklinisch werk door een consistent model te bieden voor het bestuderen van geconserveerde cellulaire organisatieprocessen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar, kostenefficiënt beeldvormingsplatform dat aanpasbaar is aan meerdere targets en screeningcampagnes.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in studies naar cytoplasmatische organisatie te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door gestandaardiseerde extractbereiding en oppervlaktepassivering op basis van FEP-tape.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege visualisatie van fenotypische effecten op cytoplasmatische dynamiek mogelijk te maken.
- Portfolio-impact: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door mechanistische inzichten te bieden in verbindingen die de cellulaire organisatie beïnvloeden.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de hantering van Xenopus-eieren, de bereiding van extracten en live-imagingtechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot centrifuges, microscopiesystemen (wide-field/confocaal), FEP-plakband en imaging-spacers.
- Vereist cross-team standaardisatie van protocollen voor het wassen van eieren, het verwijderen van de gelei (dejellying) en het terugwinnen van extracten.
- Aanpassing aan 3D-imaging kan integratie met light-sheet microscopie en optimalisatie van de controle over de monsterdikte vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de gevoeligheid voor de kwaliteit van de eieren en de noodzaak om abnormale eieren tijdens de bereiding te verwijderen om de consistentie van het extract te waarborgen.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:35
Preparation of Slides and Coverslips
1:06
Preparation and Live Imaging of Interphase-Arrested Egg Extracts
4:06
Result: Microscopy Analysis of Interphase-Arrested Egg Extracts Self-Organized into Cell-Like Compartments
5:23
Conclusion
