Name: Een adipocytencelkweekmodel om de impact van eiwit- en micro-RNA-modulatie op de adipocytenfunctie te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Leer hoe je reverse-transfectie toepast op 3T3-L1 adipocyten om eiwit- en micro-RNA-expressie te manipuleren. Deze efficiënte methode behoudt celmorfologie en maakt functionele experimenten op insulinesignalering mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door INSERM, de Université Côte d'Azur en het Franse Nationale Onderzoeksagentschap (ANR) via het programma Investments for the future Laboratory of Excellence (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) en Initiative of Excellence (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. wordt ondersteund door subsidies van de Société Francophone du Diabète (SFD), de Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), het Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) en de Fondation Benjamin-Delessert. J.G. wordt ondersteund door ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. wordt ondersteund door ANR-subsidie ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 en een subsidie van de Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). We danken ook de Imaging Core Facility van C3M, gefinancierd door de Conseil Départemental des Alpes-Maritimes en de Région PACA, die ook wordt ondersteund door het GIS IBiSA Microscopy and Imaging Platform Côte d'Azur (MICA).

OPMERKING: Gebruik steriele technieken om alle stappen van het protocol uit te voeren in een laminaire flowcelkweekkap. Zie tabel met materialen voor meer informatie over alle reagentia en apparatuur.
1. Differentiatie van murine 3T3-L1 fibroblasten in adipocyten
<ol><li>Kweek de 3T3-L1 fibroblasten in 100 mm schotels in kweek medium-DMEM zonder pyruvaat, 25 mM glucose, 10% pasgeboren kalfsserum en 1% penicilline en streptomycine(Figuur 1A). Plaats de schalen in een weefselkweekincubator (7% CO2 en 37 °C).</li>
	<li>Verander twee dagen na confluentie het kweekmedium en vervang door DMEM zonder pyruvaat, 25 mM glucose, 10% foetaal kalfsserum (FCS) en 1% penicilline en streptomycine aangevuld met 0,25 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 0,25 μM dexamethason, 5 μg / ml insuline en 10 μM rosiglitazon. OPMERKING: Het duurt 5 dagen om samenvloeiing te bereiken wanneer de cellen worden gezaaid bij 300.000 cellen per 100 mm schaal.</li>
	<li>Vervang twee dagen later het kweekmedium door DMEM zonder pyruvaat, 25 mM glucose, 10% FCS en 1% penicilline en streptomycine aangevuld met 5 μg/ml insuline en 10 μM rosiglitazon en incubateer gedurende 2 dagen. Voed de cellen vervolgens om de 2 dagen met DMEM zonder pyruvaat, 25 mM glucose, 10% FCS en 1% penicilline en streptomycine(figuur 1B).</li>
	<li>Transfecteer de 3T3-L1 adipocyten 7-8 dagen na het begin van het differentiatieprotocol. OPMERKING: Het is belangrijk om een hoog niveau van differentiatie (>80%) te bereiken vóór de transfectie om de proliferatie van de resterende fibroblasten na de transfectie te voorkomen, wat zou leiden tot een gemengde populatie van cellen die de resultaten zou kunnen vertekenen.</li>
</ol>2. Bereiding van voorgecoate platen
<ol><li>Bereid op de dag voor of enkele uren voor de transfectie een oplossing van collageen type I bij 100 μg/ml in 30% ethanol uit een stamoplossing van 1 mg/ml. Voeg 250 μL collageen toe per putje van een 12-putplaat en 125 μL per putje van een 24-putplaat en verdeel de oplossing over het oppervlak van de put.</li>
	<li>Laat de plaat zonder deksel onder de kweekkap totdat het collageen droogt. Tweemaal wassen met Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (D-PBS). OPMERKING: Voorgecoate platen zijn te koop.</li>
</ol>3. Bereiding van het transfectiemengsel
OPMERKING: De uiteindelijke concentratie siRNA ligt tussen 1 en 100 nM (1 tot 100 pmol siRNA per put van een 12-well plaat). De uiteindelijke concentratie van de miR-nabootsing is 10 nM (10 pmol/put). Bepaal de beste concentratie van elk siRNA, miR-mimiek of ander oligonucleotide voordat het experiment wordt gestart om off-target effecten te voorkomen. Voer transfectie-experimenten uit in drievoud om statistische analyse van de resultaten te vergemakkelijken. Bereid alle reagentia in overmaat voor om rekening te houden met normaal verlies tijdens het pipetteren.
<ol><li>Meng door pipetteren (volume/volume) het siRNA (of andere oligonucleotiden) met verbeterde Minimal Essential Medium(tabel 1). Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voeg het transfectiereagens en het verbeterde Minimal Essential Medium toe aan het siRNA en pipetteer om te mengen(tabel 1). Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (ga gedurende deze tijd verder naar sectie 4). Voeg de transfectiemix toe aan elk putje van de met collageen beklede plaat.</li>
</ol>4. Bereiding van de 3T3-L1 adipocyten
<ol><li>Was de cellen in de petrischaal van 100 mm tweemaal met D-PBS. Voeg 5x trypsine toe aan de cellen (1 ml per 100 mm schaal) en zorg ervoor dat je het hele oppervlak bedekt met de trypsine. Wacht op 30 s en verwijder voorzichtig de trypsine.</li>
	<li>Incubeer de petrischaal gedurende 5-10 minuten bij 37 °C in de couveuse. Tik op de 100 mm schaal om de cellen los te maken.</li>
	<li>Voeg 10 ml DMEM zonder pyruvaat, 25 mM glucose, 10% FCS en 1% penicilline en streptomycine toe om de trypsine te neutraliseren. Pipetteer het medium voorzichtig op en neer om de cellen los te maken en de celsuspensie te homogeniseren.</li>
	<li>Tel de cellen met behulp van een Malassez-telkamer of een geautomatiseerde celteller en pas de concentratie van de cellen aan op 6,25 x10 5 cellen / ml medium. Zaad 800 μL van de celsuspensie/put van een 12-putplaat (5 x 105 cellen) of 400 μl van de celsuspensie/put van een 24-putplaat (2,5 x 105 cellen) die het transfectiemengsel bevat. OPMERKING: Een petrischaaltje van 100 mm met adipocyten maakt de bereiding van één 12-well-plaat of één 24-well-plaat mogelijk. Een schaal van 100 mm bevat meestal 6-7 x 106 adipocyten, wat overeenkomt met 5 x 105 adipocyten per put van een 12-well plaat.</li>
	<li>Incubeer de platen in een celkweekincubator(7% CO 2 en 37 °C) en verstoor de cellen gedurende 24 uur niet. Vervang de volgende dag voorzichtig het supernatant door verse DMEM zonder pyruvaat, 25 mM glucose, 10% FCS en 1% penicilline en streptomycine. OPMERKING: Het is ook mogelijk om de cellen in collageen-voorgecoate 48- en 96-well platen te zaaien, maar neem meer voorzorgsmaatregelen bij het vervangen van de media om loslating van de adipocyten te voorkomen.</li>
</ol>5. Functionele analyse van getransfecteerde 3T3-L1 adipocyten
<ol><li>Studie richt zich op knockdown 24-48 h en 48-96 h na siRNA of miR nabootsing voor respectievelijk mRNA en eiwit.</li>
	<li>Voer functionele analyses uit van getransfecteerde adipocyten om insulinesignalering, glucoseopname, adipokine-secretie, lipolyse en lipogenese te bestuderen.</li>
</ol>

<ol><li>Klöting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-sensitive+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li>
<li>Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarged+subcutaneous+abdominal+adipocyte+size%2C+but+not+obesity+itself%2C+predicts+type+II+diabetes+independent+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance.</a> Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).</li>
<li>Blüher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+dysfunction+contributes+to+obesity+related+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases.</a> Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).</li>
<li>Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+other+non-coding+RNAs+in+adipose+tissue+and+obesity%3A+emerging+roles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets.</a> Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-%7Balpha%7D+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li>
<li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+the+activation+of+the+p53+pathway+mediate+alterations+in+metabolic+and+secretory+functions+of+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li>
<li>Berthou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tpl2+kinase+regulates+the+COX-2%2Fprostaglandin+E2+axis+in+adipocytes+in+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions.</a> Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).</li>
<li>Ceppo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+the+Tpl2+kinase+in+inflammatory+changes+and+insulin+resistance+induced+by+the+interaction+between+adipocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages.</a> Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).</li>
<li>Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+through+down-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-%7Balpha%7D+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li>
<li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+as+hub+of+T+cell+regulation+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">miR-34a as hub of T cell regulation networks.</a> Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187(2019).</li>
<li>Brandenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34a+is+differentially+expressed+in+dorsal+root+ganglia+in+a+rat+model+of+chronic+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 708, 134365(2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor de differentiatie en transfectie van volwassen adipocyten. Deze omgekeerde transfectiemethode is een eenvoudige, economische en zeer efficiënte methode om oligonucleotiden zoals, maar niet beperkt tot, siRNA's, micro-RNA-nabootsingen en anti-micro-RNA's te transfecteren in 3T3-L1-adipocyten, wat een van de moeilijkste cellijnen is om te transfecteren. Deze methode heeft enkele beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden. Dit protocol is niet efficiënt voor tra...

Obesitas wordt beschouwd als een belangrijke risicofactor voor tal van stofwisselingsziekten, waaronder insulineresistentie (IR), diabetes type 2 (T2D) en hart- en vaatziekten1. De huidige therapieën zijn er niet in geslaagd om de voortdurend stijgende prevalentie van deze ziekten te stoppen, en het beheer van de IR van obese en diabetische patiënten blijft een belangrijk klinisch probleem. Vetweefsel speelt een cruciale rol bij de controle van energiehomeostase en de pathologische expansie tijdens obesitas draagt bij aan de ontwikkeling van IR en T2D2,3. Dit benadrukt de noodzaak om het moleculaire mechanisme dat betrokken is bij adipocytendisfunctie beter te begrijpen om nieuwe therapieën tegen obesitasgerelateerde ziekten te ontwikkelen. Veel onderzoeken hebben de rol van eiwitcoderende RNA's in de adipocytenfysiologie en hun associatie met obesitas onderzocht.
Meer recent heeft de ontdekking van niet-coderende RNA's (ncRNA's), met name micro-RNA's (miRs), nieuwe concepten gesmeed met betrekking tot het mechanisme van de regulatie van genexpressieprogramma's. Studies hebben aangetoond dat ncRNA's belangrijke regulatoren zijn van de adipocytenfunctie en dat hun ontregeling een belangrijke rol speelt bij stofwisselingsziekten4. De manipulatie van eiwitten en ncRNA's in adipocyten is dus cruciaal om hun rol in de adipocytenfunctie en hun impact op pathologieën zoals T2D te ontcijferen. Het manipuleren van de expressie van eiwitten en ncRNA's in vivo en in primaire adipocyten blijft echter zeer uitdagend, wat het gebruik van in vitro adipocytenmodellen bevordert.
Murine 3T3-L1 fibroblasten differentiëren gemakkelijk in volwassen, functionele en insuline-responsieve adipocyten, die een goed gekarakteriseerde cellijn zijn die wordt gebruikt om de adipocytenfunctie te bestuderen (bijv. Insulinesignalering, glucoseopname, lipolyse en adipokines-secretie)5,6,7,8,9,10. Deze eigenschappen maken 3T3-L1-adipocyten een aantrekkelijk model om de expressie van eiwitcoderende en nc-RNA's te moduleren om hun rol in de adipocytenfunctie en hun potentiële rol bij obesitasgerelateerde ziekten te ontcijferen. Helaas, terwijl 3T3-L1 fibroblasten gemakkelijk te transfecteren zijn met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia, zijn gedifferentieerde 3T3-L1-adipocyten een van de moeilijkste cellijnen om te transfecteren. Dit is de reden waarom talrijke studies die genexpressie in 3T3-L1-cellen manipuleren, zich hebben gericht op adipocytendifferentiatie in plaats van op de adipocytenfunctie.
Lange tijd was de enige efficiënte techniek om adipocyten te transfecteren elektroporatie5, wat vervelend en duur is en celschade kan veroorzaken. Dit artikel rapporteert een omgekeerde transfectietechniek met behulp van een gemeenschappelijk transfectiereagens, dat de hands-on tijd voor transfectie vermindert, geen effect heeft op de levensvatbaarheid van cellen en veel goedkoper is dan elektroporatie. Dit protocol is perfect geschikt voor de transfectie van siRNA en andere oligonucleotiden zoals micro-RNA-mimics (miR-mimics) en anti-miRs. Het principe van het reverse-transfectieprotocol is om het transfectiereagens en de oligonucleotiden te incuberen om een complex in de celkweekplaat te vormen en vervolgens de volwassen adipocyten in de putten te zaaien. Vervolgens hechten de adipocyten zich opnieuw aan het aanhangen van het plaatoppervlak in aanwezigheid van het oligonucleotiden / transfectiereagenscomplex. Deze eenvoudige, efficiënte en goedkope methodologie maakt het mogelijk om de rol van eiwitcoderende RNA's en miRs in de adipocytenfunctie en hun potentiële rol bij obesitasgerelateerde ziekten te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>12 well Tissue Culture Plate</td><td>Dutscher</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Trypsin (10x)</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>verdund met D-PBS tot 5x</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Accell Non-targeting Pool</td><td>Horizon Discovery</td><td>D-001910-10-05</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Collagen type I from calf skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>41965062</td><td>4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; geen Pyruvaat</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>FAM-labeled Negative Control si-RNA</td><td>Invitrogen</td><td>AM4620</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Free Glycerol Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol Standard Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7793</td><td></td></tr><tr><td>HSP90 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-131119</td><td>Verdunning: 0,5 µg/mL</td></tr><tr><td>Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)</td><td>Gibco</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Insulin, Human Recombinant</td><td>Gibco</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>miRIDIAN micro-RNA mimics</td><td>Horizon Discovery</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT Kit</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1</td><td>Qiagen</td><td>MS00001428</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>219073</td><td></td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum</td><td>Gibco</td><td>16010-159</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool</td><td>Horizon Discovery</td><td>L-056623-01-0005</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin and Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Perilipin-1 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>3470</td><td>Verdunning: 1/1000</td></tr><tr><td>Petri dish 100 mm x 20 mm</td><td>Dutscher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>PKB antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9272</td><td>Verdunning: 1/1000</td></tr><tr><td>PKB Phospho Thr308 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9275</td><td>Verdunning: 1/1000</td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>Transfection reagent (INTERFERin)</td><td>Polyplus</td><td>409-10</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-tubulin antibody</td><td>Sigma aldrich</td><td>T6199</td><td>Verdunning: 0,5 µg/mL</td></tr><tr><td>Vamp2 antibody</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB5136</td><td>Verdunning: 0,1 µg/mL</td></tr></tbody></table>

een adipocytencelkweekmodel om de impact van eiwit- en micro-rna-modulatie op de adipocytenfunctie te bestuderen

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

Verandering van de adipocytenfunctie draagt bij aan de pathogenese van metabole ziekten, waaronder diabetes type 2 en insulineresistentie. Dit benadrukt de noodzaak om het moleculaire mechanisme dat betrokken is bij adipocytendisfunctie beter te begrijpen om nieuwe therapieën tegen obesitasgerelateerde ziekten te ontwikkelen. Het moduleren van de expressie van eiwitten en micro-RNA's in adipocyten blijft zeer uitdagend. Dit artikel beschrijft een protocol om murine fibroblasten te differentiëren in volwassen adipocyten en om de expressie van eiwitten en micro-RNA's in volwassen adipocyten te moduleren door middel van omgekeerde transfectie met behulp van klein-interfererend RNA (siRNA) en micro-RNA nabootsen (miR mimic) oligonucleotiden. Dit omgekeerde transfectieprotocol omvat de incubatie van het transfectiereagens en de oligonucleotiden om een complex te vormen in de celkweekplaat waaraan de volwassen adipocyten worden toegevoegd. De adipocyten mogen zich vervolgens opnieuw hechten aan het aanhangen van plaatoppervlak in aanwezigheid van het oligonucleotiden /transfectiereagenscomplex. Functionele analyses zoals de studie van insulinesignalering, glucoseopname, lipogenese en lipolyse kunnen worden uitgevoerd op de getransfecteerde 3T3-L1 volwassen adipocyten om de impact van eiwit- of micro-RNA-manipulatie op de adipocytenfunctie te bestuderen.

Met behulp van de hier beschreven procedure van omgekeerde transfectie om de expressie van eiwitten of micro-RNA's in 3T3-L1-adipocyten te moduleren, is aangetoond dat de adipocyten hun morfologie behouden na de transfectie (Figuur 1B,C). Inderdaad, 2 dagen na de transfectie waren de adipocyten goed verspreid en bevestigd aan de plaat en presenteerden multiloculaire lipidedruppels die kenmerkend zijn voor volwassen 3T3-L1-adipocyten. Het lipi...

Hier wordt een protocol gepresenteerd om oligonucleotiden zoals klein-interfererend RNA (siRNA), micro-RNA-mimics (miRs) of anti-micro-RNA (anti-miR) af te leveren in volwassen adipocyten om eiwit- en micro-RNA-expressie te moduleren.

Een adipocytencelkweekmodel om de impact van eiwit- en micro-RNA-modulatie op de adipocytenfunctie te bestuderen

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

Dit protocol maakt het mogelijk om eiwitten, of microRNA-expressie, in gedifferentieerde adipocyten te manipuleren om hun rol in de adipocytenfunctie te bestuderen. Deze omgekeerde transfectiemethode is een eenvoudige, economische en zeer efficiënte methode om oligonucleotiden te transfecteren in muizen 3T3-L1-adipocyten. Deze methode kan ook worden toegepast op menselijke preadipocyten die zijn gedifferentieerd in adipocyten.Melanie Gaudfrin, een technicus van ons laboratorium, demonstreert de procedure. Kweek de 3T3-L1 fibroblasten in 100 millimeter schotels in DMEM zonder pyruvaat, 25 millimolaire glucose, 10% pasgeboren kalfsserum en één procent penicilline en streptomycine. Plaats de gerechten in een weefselkweekincubator bij 37 graden Celsius en zeven procent koolstofdioxide.Verander twee dagen na de samenvloeiing het kweekmedium en vervang het door DMEM zonder pyruvaat, 25 millimolaire glucose, 10% FCS en één procent penicilline en streptomycine aangevuld met 0,25 millimolaire IBMX, 0,25 micromolaire dexamethason, vijf microgram per milliliter insuline en 10 micromolaire rosiglitazon. Incubeer de gerechten gedurende twee dagen. Vervang twee dagen later het kweekmedium door DMEM zonder pyruvaat, 25 millimolar glucose, 10% FCS en één procent penicilline en streptomycine aangevuld met vijf microgram per milliliter insuline en 10 micromolaire rosiglitazon en incubateer nog twee dagen.Voed de cellen om de twee dagen met DMEM zonder pyruvaat, 25 millimolaire glucose, 10% FCS en één procent penicilline en streptomycine en houd de cellen in de couveuse. Bereid een dag of een paar uur voor de transfectie een oplossing van collageen type I bij 100 microgram per milliliter in 30% ethanol uit een voorraadoplossing van één milligram per milliliter. Voeg 250 microliter collageen toe per put van een 12-well plaat of 125 microliter per put van een 24-well plaat en verdeel de oplossing over het oppervlak van de put.Laat de plaat zonder deksel onder de kweekkap totdat het collageen droogt. Was het vervolgens twee keer met D-PBS. Pipetteer het siRNA met een verbeterd minimaal essentieel medium om te mengen en incubateer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Voeg het transfectiereagens en het verbeterde minimale essentiële medium toe aan het siRNA en pipet om te mengen. Incubeer het gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens het transfectiemengsel toe aan elke put van de met collageen bedekte plaat.Was de cellen in de 100 millimeter petrischaal twee keer met D-PBS. Voeg 5x trypsine toe aan de cellen en zorg ervoor dat je het hele oppervlak bedekt met de trypsine. Wacht 30 seconden en verwijder voorzichtig de trypsine.Incubeer de petrischaal vijf tot 10 minuten bij 37 graden Celsius in de couveuse. Tik vervolgens op de schaal om de cellen los te maken, waardoor celbeschadiging wordt voorkomen. Voeg 10 milliliter DMEM zonder pyruvaat, 25 millimolaire glucose, 10% FCS en één procent penicilline en streptomycine toe om de trypsine te neutraliseren.Pipetteer het medium voorzichtig op en neer om de cellen los te maken en de celsuspensie te homogeniseren. Tel de cellen met behulp van een Malassez-telkamer of een geautomatiseerde celteller en pas de concentratie van de cellen aan tot 0,625 miljoen cellen per milliliter medium. Zaad 800 microliter van de celsuspensie per put van een 12-well plaat of 400 microliter van de celsuspensie per put van een 24-well plaat met het transfectiemengsel.Incubeer de platen in een celkweekincubator en verstoor ze gedurende 24 uur niet. Vervang de volgende dag voorzichtig het supernatant door verse DMEM zonder pyruvaat, 25 millimolar glucose, 10% FCS en één procent penicilline en streptomycine en breng de cellen terug naar de incubator. Typische tijdstippen voor het detecteren van doel knockdown na siRNA- of miR-afgifte zijn 24 tot 48 uur voor mRNA en 48 tot 96 uur voor eiwit.Functionele experimenten kunnen worden uitgevoerd op getransfecteerde adipocyten, waaronder insulinesignalering, glucoseopname, adipokine-secretie, lipolyse en lipogenese. Van de adipocyten is aangetoond dat ze hun morfologie behouden na de transfectie. Twee dagen na transfectie presenteerden de adipocyten multiloculaire lipidedruppeltjes met een lipidengehalte dat niet verschilde tussen de getransfecteerde en niet-getransfecteerde adipocyten.De mRNA-expressie van verschillende differentiatiemarkers was onveranderd in getransfecteerde cellen in vergelijking met die in niet-getransfecteerde adipocyten. Het omgekeerde transfectieprotocol is efficiënt omdat meer dan 70% van de adipocyten getransfecteerd was. Drie dagen na de transfectie met siRNA tegen Perilipin-1 was het mRNA-niveau van Perilipin-1 met 70% afgenomen en het eiwitniveau met 63% Perilipin-1-expressie werd vier dagen na de transfectie ook geanalyseerd door fluorescentiemicroscopie en bleek met 92% te zijn afgenomen in vergelijking met de expressie in controleadipocyten.De omgekeerde transfectie van adipocyten met microRNA dat oligonucleotiden nabootst om de expressie van miR-34a te upreguleren, wordt hier getoond. De overexpressie van miR-34a leidde tot de afname van VAMP2-eiwitexpressie met 50%De knockdown van Perilipin-1 in 3T3-L1-adipocyten leidde tot een toename van basale lipolyse, terwijl de overexpressie van miR-34a leidde tot de remming van insuline-geïnduceerde eiwitkinase B-fosforylering en glucoseopname. Het is belangrijk om een hoog niveau van adipocytendifferentiatie te bereiken om de transfectie op nieuw gedifferentieerde adipocyten uit te voeren en om de behandeling van adipocyten met trypsine zorgvuldig te controleren.Na de transfectie is het mogelijk om functionele experimenten uit te voeren op de adipocyten om de impact van eiwitten of microRNA-manipulatie op insulinesignalering, glucoseopname, lipogenese en lipolyse te bestuderen.

an-adipocyte-cell-culture-model-to-study-impact-protein-micro-rna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Vetweefsel (AT) kan de homeostase van het hele lichaam beïnvloeden, daarom is het begrijpen van de moleculaire mechanismen van adipocytendifferentiatie en -functie van belang. We bieden een protocol voor het verkrijgen van nieuwe inzichten in deze processen door adipocytenhomeostase, differentiatie en blootstelling aan hypoxie te analyseren als een model voor geïnduceerde adipocytenapoptose.

Mechanisme van de verordening van Adipocyte Numbers in volwassen organismen door differentiatie en apoptose Homeostasis

Witte vetweefsel (WAT) heeft kritieke tekortkomingen in de huidige primaire cultuur modellen, belemmeren farmacologische ontwikkeling en metabole studies. Hier presenteren we een protocol voor de productie van een systeem van de obesitas microphysiological door klemmen WAT tussen bladen van stromale cellen. Deze constructie biedt een stabiele en flexibele platform voor primaire WAT cultuur.

Een Microphysiologic Platform voor menselijk vet: ingeklemd wit vetweefsel

Membraan volwassen adipocyte aggregaat cultuur (MAAC) is een nieuwe methode om de cultuur volwassen menselijke adipocyten. Hier beschrijven we hoe adipocyten te isoleren van menselijke veten en hoe maac op te zetten.

Isolatie en cultuur van menselijke volwassen adipocyten met behulp van membraan volwassen adipocyte aggregaat culturen (MAAC)

We beschrijven een 3D menselijke extracellulaire matrix-adipocyte in vitro cultuur systeem dat het mogelijk maakt dissectie van de rollen van de matrix en adipocytes in bij te dragen tot vetweefsel metabole fenotype.

Een menselijke 3D-extracellulaire matrix-Adipocyte cultuur model voor het bestuderen van matrix-cel metabole Overspraak

Dit protocol beschrijft de isolatie van muis preadipocyten uit onderhuids vet, hun differentiatie in volwassen adipocyten en de inductie van insulineresistentie. De werking van insuline wordt geëvalueerd door de fosforylering/activering van leden van de insulinesignaleringsroute door western blot. Deze methode maakt directe bepaling van insulineresistentie/gevoeligheid in primaire adipocyten mogelijk.

Gedifferentieerde muis adipocyten in primaire cultuur: een model van insulineresistentie

Dit protocol beschrijft de semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel om preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie in vitro te bereiken. Het gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering vermindert experimentele variatie en verhoogt de reproduceerbaarheid.

Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator

Hier beschrijven we een protocol voor het isoleren, kweken en fenotyperen van microvasculaire endotheelcellen uit menselijk onderhuids vetweefsel (hSATMVEC's). Daarnaast beschrijven we een experimenteel model van hSATMVEC-adipocyte overspraak.

Bestudering van overspraak van vet-endotheelcellen en adipocyten in menselijk onderhuids vetweefsel

De grootte en kwetsbaarheid van rijpe vetcellen hebben de technieken en hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor hun studie en isolatie beperkt. Hier wordt een protocol beschreven voor de isolatie van rijpe muizenadipocyten, dat gemakkelijk kan worden aangepast voor verschillende vetdepots en muizendiëten.

Isolatie en kweek van primaire adipocyten van muizen van magere en zwaarlijvige muizen

Het testen van visuele gevoeligheid bij hagedissen met behulp van een operante conditionering paradigma dat het afspelen van video van de random-dot kinematograms en computer-gegenereerde ongewervelde dieren in dienst heeft.

Het testen van visuele gevoeligheid voor de snelheid en richting van de beweging in Lizards

Computer-gegenereerde prikkels met behulp van de Jacky draak als een model.

Door de computer gegenereerde Animal Model Stimuli

Leer hoe je reverse-transfectie toepast op 3T3-L1 adipocyten om eiwit- en micro-RNA-expressie te manipuleren. Deze efficiënte methode behoudt celmorfologie en maakt functionele experimenten op insulinesignalering mogelijk.

Een adipocytencelkweekmodel om de impact van eiwit- en micro-RNA-modulatie op de adipocytenfunctie te bestuderen

Meer video's verkennen