Name: Beoordeling van de lipidenbehandelingscapaciteit van het hele lichaam bij muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Leer eenvoudige assays voor het beoordelen van lipidenmetabolisme bij muizen. Deze toegankelijke methoden vereisen geen gespecialiseerde apparatuur en vergemakkelijken in vivo metabolismeonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door de National Institutes of Health (NIH), subsidie R00-DK114498, en het Amerikaanse ministerie van Landbouw (USDA), subsidie CRIS: 3092-51000-062 aan Y. Z.

Dieren worden gehuisvest in gestandaardiseerde omstandigheden volgens dierverzorgings- en experimentele protocollen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het Baylor College of Medicine (BCM). Dieren krijgen een standaard of speciaal dieet, water ad libitum, en worden gehouden met een dag / nachtcyclus van 12 uur.
1. Meting van nuchtere serumlipiden
<ol><li>Breng muizen over naar een nieuwe kooi na 17.00 uur en snel met vrije toegang tot water, 's nachts (met ongeveer 16 uur vasten vóór het experiment). Het nachtelijke vasten zorgt voor een volledige lediging van het maagdarmkanaal van de muizen. OPMERKING: Muizen eten hun uitwerpselen tijdens het vasten, dus voedselontwenning kan er niet voor zorgen dat ze voldoende vasten.</li>
	<li>Pak de volgende ochtend de muis bij de staart en plaats hem op een oppervlak. Trek voorzichtig terug aan de staart van de muis om de muis in de fixator te plaatsen. Plaats de neussteun om de beweging van de muis opnieuw te trainen terwijl u de muis nog steeds laat ademen. Draai de knop van de neussteun vast. Controleer borstbewegingen om ervoor te zorgen dat het dier normaal ademt en minimaliseer de tijd die een muis doorbrengt in fixatoren.</li>
	<li>Maak een oppervlakkige incisie (nick) in de staartader van de vrij bewegende muis en trek 25 μL bloed uit de incisie in een glazen capillair (dat ongeveer 1/3 van het capillair vult) zonder de muis te beperken. Blaas het bloed snel in een microcentrifugebuis.</li>
	<li>Stop het bloeden met behulp van styptische poeders, vul het voer in de kooi bij en zorg ervoor dat de muizen geen tekenen van stress vertonen.</li>
	<li>Voltooi de bloedonttrekking voor alle muizen.</li>
	<li>Laat het bloed stollen door het 1 uur ongestoord op kamertemperatuur te laten. Draai de gestolde bloedmonsters bij 2.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten in een gekoelde benchtop microcentrifuge en breng supernatant (serum) over voor analyse. OPMERKING: Serum kan gedurende enkele weken tot analyse worden bewaard bij –20 °C. Houd het serum voor langdurige opslag op –70°C.</li>
	<li>Analyseer elke lipidemetaboliet met behulp van het door de fabrikant geleverde protocol.</li>
</ol>2. Orale intralipid tolerantietest
<ol><li>Weeg na 17.00 uur de muizen voor de berekening van het intralipidevolume dat hen de volgende dag moet worden gegeven. Breng de muizen vervolgens over in een nieuwe kooi en vast ze 's nachts (16 uur).</li>
	<li>Markeer de volgende ochtend de staarten van de muizen die in één kooi zijn gehuisvest om ze te helpen identificeren in de daaropvolgende bloedstappen.</li>
	<li>Maak een inkeping in de staartader en trek 15 μL bloed uit de incisie in een glazen capillair (vult ongeveer 1/5 van het capillair) en blaas het bloed snel in een microcentrifugebuis voor T = 0 serum. OPMERKING: Het is niet nodig om het bloeden tijdens de test te stoppen, tenzij de muizen een teveel aan bloeding vertonen.</li>
	<li>Gavage muizen 20% intralipid met behulp van een 18G gavage naald in een verhouding van 15 μl per gram lichaamsgewicht, met behulp van het pre-nuchtere lichaamsgewicht. Stapel elke muis met 1 minuut. OPMERKING: Weeg het dier en bepaal de juiste naaldgrootte van de maagsonde. Over het algemeen is een 18 gauge gavage naald geschikt voor muizen >25 g, en een 20-22 gauge gavage naald zou meer geschikt zijn voor kleinere dieren. Krab de muis en grijp de huid over de schouders om het hoofd van het dier op zijn plaats te houden. Plaats de maagsondeaald in de mond en ga dan voorzichtig langs het bovenste gehemelte, totdat de slokdarm is bereikt. De buis moet zonder weerstand passeren. Zodra de juiste diepte is bereikt, kan de Intralipid langzaam worden toegediend. Verwijder de naald voorzichtig onder dezelfde hoek tijdens het inbrengen van de naald na toediening van de Intralipid. Breng het dier terug naar de kooi en controleer op tekenen van moeizame ademhaling of ander leed. OPMERKING: Onderzoekers die onervaren zijn met orale maagsonde- of staartbloedingstechnieken kunnen elke muis met 2 minuten of zelfs langer stapelen.</li>
	<li>Trek bloed af bij T = 1, 2, 3, 4, 5 en 6 uur: Trek 15 μL bloed (1/5 capillair) per muis door staartbloedingen en blaas het bloed snel in een microcentrifugebuis.</li>
	<li>Spin de bloedmonsters met 2.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in een microcentrifuge. Breng het supernatant, inclusief de drijvende vetlaag, over naar een PCR-buis voor opslag. Het supernatant kan tot de analyse enkele weken bij –20 °C worden bewaard. OPMERKING: Het supernatant moet plasma zijn. Als sommige monsters al zijn gestlonterd tegen de tijd van centrifugeren, heeft dit geen invloed op de triglyceridemeting.</li>
	<li>Stop na de laatste bloedafname het bloeden met behulp van styptische poeders, vul het voer in de kooi opnieuw en zorg ervoor dat de muizen geen tekenen van extreme stress vertonen.</li>
	<li>Laad 2 μL triglyceride standaard en verzamelde supernatanten in een 96-well plaat.</li>
	<li>Voeg 200 μL triglyceridenreagens toe en laat de plaat 5 minuten incuberen bij 37 °C voor kleurontwikkeling.</li>
	<li>Meet de absorptie bij 500 nm met een referentiegolflengte van 660 nm in een laboratoriumplaatlezer en bereken de concentratie van het monster.</li>
</ol>3. β3 Adrenerge receptoragonist CL 316.243 Gestimuleerde lipolysetest
<ol><li>Bereid CL 316,243 als een standaardoplossing van 5 mg/ml (50x) in steriele zoutoplossing en bewaar bij –20°C tot gebruik.</li>
	<li>Weeg 's ochtends de muizen om de hoeveelheid verdunde CL 316.243-oplossing te berekenen die nodig is voor het experiment. De muis krijgt 10 μL per gram lichaamsgewicht verdunde CL 316.243, voor een einddosis van 1 mg/kg lichaamsgewicht.</li>
	<li>Breng de muizen over in een nieuwe kooi met vrije toegang tot water en vast ze gedurende 4 uur.</li>
	<li>Maak voldoende 1x CL 316.243 oplossing uit 50x bouillon met zoutoplossing. De uiteindelijke concentratie van 1x CL 316,243 oplossing is 0,1 mg/ml. Gebruik zoutoplossing voor de controlebehandelingsgroep.</li>
	<li>Markeer de staarten van de muizen die zich in dezelfde kooi bevinden voor eenvoudige identificatie tijdens de bloedstappen.</li>
	<li>Maak een inkeping in de staartader en trek 15 μL bloed uit de incisie in een glazen capillair (vult ongeveer 1/5 van het capillair) en blaas het bloed snel in een microcentrifugebuis voor T = 0 monster. OPMERKING: Het is niet nodig om het bloeden tijdens de test te stoppen, tenzij de muizen een teveel aan bloeding vertonen.</li>
	<li>Injecteer verdunde CL 316.243 oplossing (of controle indien opgenomen in het experiment) intraperitoneaal bij een volume van 10 μL/g lichaamsgewicht. Stapel elke muis met 1 minuut. Gebruik maximaal 5 muizen voor elk experiment van 60 minuten, of 10 muizen voor een team van twee personen.</li>
	<li>Bloed afnemen bij T = 5, 15, 30, 60 minuten: trek 15 μL bloed (1/5 capillair) per muis door middel van staartbloedingen.</li>
	<li>Stop na de laatste bloedafname het bloeden met behulp van styptische poeders, vul het voer in de kooi opnieuw en zorg ervoor dat de muizen geen tekenen van extreme stress vertonen.</li>
	<li>Spin bloedmonsters bij 2.000 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten in een gekoelde microcentrifuge. Breng het supernatant over naar een PCR-buis voor opslag. Het supernatant kan enkele weken tot analyse bij –20°C worden bewaard.</li>
	<li>Laad 1 μL van 2x serieel verdunde glycerolstandaarden (0,156, 0,312, 0,625, 1,25 en 2,5 mg/ml Trioleïne-equivalente concentraties) en verzamelde supernatanten in een 96-well plaat. Voeg 100 μL vrij glycerolreagens toe en laat de plaat gedurende 5 minuten bij 37 °C incuberen om de kleur te ontwikkelen.</li>
	<li>Meet de absorptie bij 540 nm met behulp van een laboratoriumplaatlezer en bereken de concentratie van het monster.</li>
</ol>

<ol><li>Dixon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+chylomicron+uptake+into+lacteals%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of chylomicron uptake into lacteals.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, Suppl 1 52-57 (2010).</li>
<li>Nuno, J., de Oya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoprotein+lipase%3A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Cl%C3%ADnica+Espa%C3%B1ola%22%5BJournal%5D)">Lipoprotein lipase: review.</a> Revista Clínica Española. 170 (3-4), 83-87 (1983).</li>
<li>Williams, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+processes+that+handle+--+and+mishandle+--+dietary+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Molecular processes that handle -- and mishandle -- dietary lipids.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (10), 3247-3259 (2008).</li>
<li>Burla, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS-based+lipidomics+of+human+blood+plasma%3A+a+community-initiated+position+paper+to+develop+accepted+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">MS-based lipidomics of human blood plasma: a community-initiated position paper to develop accepted guidelines.</a> Journal of Lipid Research. 59 (10), 2001-2017 (2018).</li>
<li>Umpleby, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+measurement+guidelines%3A+Tracing+lipid+metabolism%3A+the+value+of+stable+isotopes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Hormone measurement guidelines: Tracing lipid metabolism: the value of stable isotopes.</a> Journal of Endocrinology. 226 (3), 1-10 (2015).</li>
<li>Mitchell, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paired+sibling+analysis+of+the+beta-3+adrenergic+receptor+and+obesity+in+Mexican+Americans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A paired sibling analysis of the beta-3 adrenergic receptor and obesity in Mexican Americans.</a> Journal of Clinical Investigation. 101 (3), 584-587 (1998).</li>
<li>Mahoney, L. B., Denny, C. A., Seyfried, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caloric+restriction+in+C57BL%2F6J+mice+mimics+therapeutic+fasting+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+in+Health+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Caloric restriction in C57BL/6J mice mimics therapeutic fasting in humans.</a> Lipids in Health and Disease. 5, 13(2006).</li>
<li>Hayek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fat+increases+high+density+lipoprotein+%28HDL%29+levels+both+by+increasing+the+transport+rates+and+decreasing+the+fractional+catabolic+rates+of+HDL+cholesterol+ester+and+apolipoprotein+%28Apo%29+A-I.+Presentation+of+a+new+animal+model+and+mechanistic+studies+in+human+Apo+A-I+transgenic+and+control+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Dietary fat increases high density lipoprotein (HDL) levels both by increasing the transport rates and decreasing the fractional catabolic rates of HDL cholesterol ester and apolipoprotein (Apo) A-I. Presentation of a new animal model and mechanistic studies in human Apo A-I transgenic and control mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 91 (4), 1665-1671 (1993).</li>
<li>Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+evidence+for+the+absence+of+a+functional+cholesteryl+ester+transfer+protein+gene+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+Part+B%3A+Biochemistry+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part B: Biochemistry & Molecular Biology. 135 (2), 219-229 (2003).</li>
<li>Tall, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+cholesterol+ester+transfer+protein+and+relationship+to+coronary+artery+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Functions of cholesterol ester transfer protein and relationship to coronary artery disease risk.</a> Journal of Clinical Lipidology. 4 (5), 389-393 (2010).</li>
<li>Singh, A. K., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triglyceride+and+cardiovascular+risk%3A+A+critical+appraisal%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Triglyceride and cardiovascular risk: A critical appraisal.</a> Indian Journal of Endocrinology and Metabolism. 20 (4), 418-428 (2016).</li>
<li>Miller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triglycerides+and+cardiovascular+disease%3A+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Triglycerides and cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 123 (20), 2292-2333 (2011).</li>
<li>Dron, J. S., Hegele, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Hypertriglyceridemia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Genetics of Hypertriglyceridemia.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 11, 455(2020).</li>
<li>Dole, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+relation+between+non-esterified+fatty+acids+in+plasma+and+the+metabolism+of+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A relation between non-esterified fatty acids in plasma and the metabolism of glucose.</a> Journal of Clinical Investigation. 35 (2), 150-154 (1956).</li>
<li>Bartelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue+activity+controls+triglyceride+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance.</a> Nature Medicine. 17 (2), 200-205 (2011).</li>
<li>de Souza, C. J., Burkey, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+3-adrenoceptor+agonists+as+anti-diabetic+and+anti-obesity+drugs+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Beta 3-adrenoceptor agonists as anti-diabetic and anti-obesity drugs in humans.</a> Current Pharmaceutical Design. 7 (14), 1433-1449 (2001).</li>
<li>Braun, K., Oeckl, J., Westermeier, J., Li, Y., Klingenspor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-adrenergic+control+of+lipolysis+and+thermogenesis+in+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Non-adrenergic control of lipolysis and thermogenesis in adipose tissues.</a> Journal of Experimental Biology. 221, Pt Suppl 1 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De drie beschreven testen functioneren robuust in het lab, met een paar kritische overwegingen. 's Nachts vasten is vereist voor het bepalen van nuchtere serumlipidespiegels en orale intralipidtolerantietest. Voor orale intralipid tolerantietest is het van cruciaal belang om het bloed bij kamertemperatuur te laten draaien om de vorming van een vetlaag te minimaliseren, vooral op de tijdstippen van 1 en 2 uur; het is belangrijk om deze vetlaag niet weg te gooien als deze zich vormt. Zorg ervoor dat u het supernatant overb...

Koolhydraten en lipiden zijn twee belangrijke substraten voor het energiemetabolisme. Afwijkend lipidenmetabolisme resulteert in veel menselijke ziekten, waaronder diabetes type II, hart- en vaatziekten, leververvetting en kankers. Voedingslipiden, voornamelijk triglyceriden, worden via de darm in het lymfestelsel opgenomen en komen in de veneuze circulatie in chylomicronen in de buurt van het hart1. Lipiden worden gedragen door lipoproteïnedeeltjes in de bloedbaan, waar de vetzuurmoieties worden geschonden door de werking van lipoproteïnelipase bij perifere organen zoals spieren en vetweefsel2. De resterende cholesterolrijke restdeeltjes worden door de lever opgeruimd3. Muizen zijn op grote schaal gebruikt in laboratoria als een onderzoeksmodel om het lipidenmetabolisme te bestuderen. Met uitgebreide genetische toolsets beschikbaar en een relatief korte fokcyclus, zijn ze een krachtig model voor het bestuderen van hoe lipiden worden geabsorbeerd, gesynthetiseerd en gemetaboliseerd.
Vanwege de complexiteit van het lipidenmetabolisme worden geavanceerde lipidomics-studies of isotopische tracerstudies meestal gebruikt om verzamelingen lipidesoorten of lipidegerelateerde metabole fluxen en lotgevallen te kwantificeren4,5. Dit creëert een enorme uitdaging voor onderzoekers zonder gespecialiseerde apparatuur of expertise. In dit artikel presenteren we drie assays die kunnen dienen als eerste tests voordat technisch uitdagende technieken worden gebruikt. Het zijn niet-terminale procedures voor de muizen en dus zeer nuttig voor het identificeren van potentiële verschillen in lipidenbehandelingscapaciteit en het beperken van de getroffen processen.
Ten eerste kan het meten van nuchtere serumlipidemoleculen helpen om het algehele lipidenprofiel van een muis vast te stellen. Muizen moeten worden vasten, omdat veel lipidesoorten na de maaltijd stijgen en de omvang van de toename sterk wordt beïnvloed door de samenstelling van het dieet. Veel lipidemoleculen, waaronder totaal cholesterol, triglyceride en niet-veresterd vetzuur (NEFA), kunnen worden gemeten met behulp van een commerciële kit en een plaatlezer die absorptie kan lezen.
Ten tweede evalueert een orale intralipide tolerantietest het lipidenbehandelingsvermogen als een netto-effect van absorptie en metabolisme. Een oraal toegediende intralipide veroorzaakt een piek in circulerende triglycerideniveaus (1-2 uur), waarna de serumtriglyceridenspiegels terugkeren naar basale niveaus (4-6 uur). Deze test biedt informatie over hoe goed een muis de exogene lipiden aankan. Hart, lever en bruin vetweefsel zijn actieve consumenten van triglyceriden, terwijl wit vetweefsel het opslaat als een energiereserve. Veranderingen in deze functies zullen leiden tot verschillen in de testresultaten.
Ten slotte wordt het bevorderen van lipolyse om opgeslagen lipiden te mobiliseren beschouwd als een mogelijke strategie voor gewichtsverlies. De β3-adrenerge receptorsignaleringsroute in het vetweefsel speelt een belangrijke rol bij adipocytenlipyse en de menselijke genetica heeft een functieverlies polymorfisme Trp64Arg geïdentificeerd in β3-adrenerge receptor gecorreleerd met obesitas6. CL 316.243, een specifieke en krachtige β3-adrenerge receptoragonist, stimuleert vetweefsel lipolyse en de afgifte van glycerol. Evaluatie van de reactie van een muis op CL 316.243 kan waardevolle informatie opleveren over de ontwikkeling, verbetering en begrip van de werkzaamheid van de verbinding.
Gezamenlijk kunnen deze tests worden gebruikt als een eerste scherm voor veranderingen in de lipide metabolische toestand van muizen. Ze zijn gekozen vanwege de toegankelijkheid van de instrumenten en reagentia. Met de resultaten van deze testen kunnen onderzoekers zich een algemeen beeld vormen van de metabole fitheid van hun dieren en beslissen over meer geavanceerde en gerichte benaderingen.

<table><tbody><tr><td>20% Intralipid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I141</td><td></td></tr><tr><td>BD Slip Tip Sterile Syringes 1ml</td><td>Shaotong</td><td>B07F1KRMYN</td><td></td></tr><tr><td>CL 316,243 Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5976</td><td></td></tr><tr><td>Curved Feeding Needles (18 Gauge)</td><td>Kent Scientific</td><td>FNC-18-2-2</td><td></td></tr><tr><td>Free Glycerol Reagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol Standard Solution</td><td>Sigma</td><td>G7793</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT A</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>999-34691</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT B</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>991-34891</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>995-34791</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>993-35191</td><td></td></tr><tr><td>Matrix Plus Chemistry Reference Kit</td><td>Verichem</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>Micro Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-168</td><td></td></tr><tr><td>Microhematrocrit Capillary Tube, Not Heparanized</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-574</td><td></td></tr><tr><td>NEFA STANDARD SOLUTION</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>276-76491</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BM-220</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Triglycerides Reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Total Cholesterol Reagents</td><td>Thermo Scientifi</td><td>TR13421</td><td></td></tr></tbody></table>

beoordeling van de lipidenbehandelingscapaciteit van het hele lichaam bij muizen

Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice

Het beoordelen van lipidemetabolisme is een hoeksteen van het evalueren van de metabole functie en wordt als essentieel beschouwd voor in vivo metabolismestudies. Lipiden zijn een klasse van veel verschillende moleculen met veel routes die betrokken zijn bij hun synthese en metabolisme. Een startpunt voor het evalueren van lipide hemostase voor onderzoek naar voeding en obesitas is nodig. Dit artikel beschrijft drie eenvoudige en toegankelijke methoden die weinig expertise of oefening vereisen om onder de knie te krijgen, en die door de meeste laboratoria kunnen worden aangepast om te screenen op lipidemetabolismeafwijkingen bij muizen. Deze methoden zijn (1) het meten van verschillende nuchtere serumlipidemoleculen met behulp van commerciële kits (2) het testen van het lipidenverwerkingsvermogen in de voeding door middel van een orale intralipidetolerantietest en (3) het evalueren van de respons op een farmaceutische verbinding, CL 316.243, bij muizen. Samen zullen deze methoden een overzicht op hoog niveau bieden van het vermogen om lipiden bij muizen te hanteren.

We laten met drie fragmenten zien dat elke test waardevolle informatie biedt over het lipidenmetabolisme van de muizen. Voor C57BL / 6J mannelijke muizen, uitgedaagd door acht weken vetrijk dieet (HFD) voeding vanaf acht weken oud, waren de totale cholesterolwaarden significant verhoogd, terwijl serumtriglyyceride en NEFA dat niet waren(tabel 1),wat suggereert dat triglyceride en NEFA in het bloed niet overwegend worden gereguleerd door een vetuitdaging in de voeding. In het tweede cohort muizen kregen C...

Dit artikel biedt drie eenvoudige en toegankelijke testen voor het beoordelen van het lipidemetabolisme bij muizen.

Beoordeling van de lipidenbehandelingscapaciteit van het hele lichaam bij muizen

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a ...

Het beoordelen van het lipidenmetabolisme is een hoeksteen van de evaluatie van de metabolische functie en wordt beschouwd als essentieel voor in vivo metabolismestudies. Vanwege de complexiteit van het lipidenmetabolisme worden meestal geavanceerde lipidomische studies of isotopentracerstudies gebruikt, wat een enorme uitdaging vormt voor onderzoekers zonder gespecialiseerde apparatuur of expertise. Dit protocol toont eenvoudige en toegankelijke assays voor het beoordelen van lipidenmetabolisme bij muizen.De procedure zal worden gedemonstreerd door Mingyang Huang, een onderzoeksassistent van het Zhu laboratorium. Begin door muizen over te brengen naar een nieuwe kooi en ze een nacht te vasten met vrije toegang tot water gedurende 16 uur voor het experiment, wat ervoor zorgt dat de gastro-intestinale kanalen van de muizen volledig worden ontdaan. De volgende ochtend maakt u een oppervlakkige incisie in de staarvan van de muis.En trek 25 microliter bloed uit de incisie in een glas capillair. Blaas het bloed snel in een microcentrifugebuisje. Stop het bloeden met septische poeders, vul vervolgens het voer in de kooi bij en zorg ervoor dat de muizen geen tekenen van extreme stress vertonen.Voer de bloedafname uit bij alle muizen. Laat het bloed stollen door het een uur ongestoord op kamertemperatuur te laten staan en centrifugeer vervolgens de gestolde bloedmonsters bij 2000 x g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten in een gekoelde tafelcentrifuge. Verzamel de supernatant voor lipidenmetabolietenanalyse.Na vijf uur 's avonds weegt u de muizen om het intralipidvolume te berekenen dat ze de volgende dag zullen krijgen. Breng ze vervolgens over naar een nieuwe kooi en laat ze een nacht vasten. De volgende ochtend markeert u de staarten van de muizen in één kooi om ze gemakkelijker te identificeren in de volgende bloedafnamestappen.Maak een insnijding in de staarvan en laat 15 microliter bloed uit de incisie druppelen in een glas capillair, en blaas het bloed snel in een microcentrifugebuisje voor T 0 serum. Geef muizen 20% intralipid via een 18 gauge gavagenaald met een verhouding van 15 microliter per gram lichaamsgewicht met behulp van het gewicht vóór het vasten. Trek bloed op 1, 2, 3, 4, 5 en 6 uur.Centrifugeer de bloedmonsters bij 2000 x g gedurende 10 minuten in een microcentrifuge. Breng de supernatant, inclusief de drijvende vetlaag, over naar een PCR-buisje voor opslag. De supernatant kan gedurende enkele weken worden bewaard bij min 20 graden Celsius tot analyse.Na de laatste bloedafname stopt u het bloeden met septische poeders, vult u het voer in de kooi bij en zorgt u ervoor dat de muizen geen tekenen van extreme stress vertonen. Laad twee microliter triglyceride-standaard en verzamelde supernatanten in een 96-wellsplaat. Voeg 200 microliter triglyceridereagens toe en laat de plaat vijf minuten incuberen bij 37 graden Celsius voor kleurontwikkeling.Meet de absorptie bij 500 nanometer met een referentiegolflengte van 660 nanometer in een plate reader en bereken de concentratie van het monster. 's Ochtends weegt u de muizen om de hoeveelheid verdunde CL 316, 243 verbindingsoplossing te berekenen die nodig is voor het experiment. Breng de muizen over naar een nieuwe kooi met vrije toegang tot water en laat ze vier uur vasten.Maak voldoende 1X CL-verbindingsoplossing van de 50X stock die werd bereid door vijf milligram CL 316, 243 poeder op te lossen in één milliliter steriele zoutoplossing of PBS. Gebruik steriele zoutoplossing of PBS voor de controlebehandelingsgroep. Filter door een Millipore 0,22 micron PES-membraanfiltereenheid om de oplossing te steriliseren.Markeer de staarten van de muizen in dezelfde kooi voor gemakkelijke identificatie tijdens de bloedafnamestap. Maak een insnijding in de staarvan en trek 15 microliter bloed uit de incisie in een glas capillair, blaas het bloed vervolgens snel in een microcentrifugebuisje voor het T 0-monster. Injecteer verdunde CL-verbindingsoplossing intraperitoneaal in een volume van 10 microliter per gram lichaamsgewicht.Gebruik maximaal vijf muizen voor elk 60-minutenexperiment of 10 muizen voor een tweepersoonsteam. Trek bloed op 5, 15, 30 en 60 minuten na de injectie. Na de laatste bloedafname stopt u het bloeden met septische poeders, vult u het voer in de kooi bij en zorgt u ervoor dat de muizen geen tekenen van extreme stress vertonen.Centrifugeer de bloedmonsters bij 2000 x g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten in een gekoelde microcentrifuge, breng vervolgens de supernatant over naar een PCR-buisje voor opslag. De supernatant kan gedurende enkele weken worden bewaard bij min 20 graden Celsius tot analyse. Laad een microliter van 2X opeenvolgend verdunde glycerolstandaarden en verzamelde supernatanten in een 96-wellsplaat.Voeg 100 microliter vrij glycerolreagens toe en laat de plaat vijf minuten incuberen bij 37 graden Celsius voor kleurontwikkeling. Meet de absorptie bij 540 nanometer met behulp van een laboratoriumplate reader en bereken de concentratie van elk monster. Toen C57BL6/J mannelijke muizen gedurende acht weken werden uitgedaagd door een hoog vetdieet, waren de totale cholesterolwaarden significant verhoogd.Ondertussen waren serumtriglyceriden en NEFA dat niet, wat suggereert dat triglyceriden en NEFA in het bloed niet overwegend worden beïnvloed door chronische hoogvetuitdaging. In de tweede cohort van muizen werden substrains van C57BL6 gedurende acht weken gevoerd met het hoogvetdieet, beginnend op de leeftijd van acht weken. Hun serumtriglycerideniveaus werden vergeleken na een orale intralipiduitdaging.De 6/J-substrain had een significant hoger piek in vergelijking met de 6/N-substrain, wat wijst op een verbeterde absorptie of een veel langzamere triglycerideklaring. Voor acht weken oude C57BL6/J muizen die normaal voer kregen, leidde een enkele CL 316, 243 behandeling tot een significante stijging van het serumglycerol. Echter, dagelijkse intraperitoneaal behandeling van muizen met CL-verbinding gedurende één week leidde tot een verminderde reactie op de CL-

assessing-whole-body-lipid-handling-capacity-in-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

We stellen robuuste biochemische en microscopische methoden voor het...

Biochemische en High Throughput microscopische beoordeling van Fat Mass in<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

De novo lipogenese en β-vetzuuroxidatie vormen belangrijke metabole routes in hepatocyte, trajecten die zijn verstoord in verschillende metabole stoornissen, met inbegrip van vette lever ziekte. Hier laten we de isolatie van muizen primaire hepatocyten en beschrijven kwantificering van β-vetzuuroxidatie en lipogenese.

Bepaling van vetzuuroxidatie en Lipogenese in Mouse primaire hepatocyten

Hier worden geoptimaliseerde methoden beschreven om in vivo en in vitro modellen van hepatische steatose te genereren en om de steatotische fenotypes en gerelateerde fysiologische parameters te analyseren.

Geoptimaliseerd Analyse van<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; In Vitro</em&gt; Leversteatose

Dit protocol beschrijft het gebruik van een lichaam samenstelling analyzer en metabole dierlijke controlesysteem te karakteriseren lichaamssamenstelling en metabole parameters in muizen. Een model van de obesitas geïnduceerd door vetrijke voeding wordt gebruikt als een voorbeeld voor de toepassing van deze technieken.

Lichaamssamenstelling en metabole kooien analyse in hoge vet Fed muizen

Shotgun massaspectrometrie-gebaseerde lipidomics levert een gevoelige kwantitatieve momentopname van een breed spectrum van lipidenklassen tegelijkertijd in een enkele meting van verschillende knaagdierweefsels.

Shotgun Lipidomics van Knaagdier weefsels

Het huidige protocol beschrijft een gedetailleerd chirurgisch protocol voor het isoleren van stromende darmlymfe als reactie op intraduodenale voedingsinfusies bij muizen. Dit maakt de fysiologische bepaling van de totale intestinale lipideabsorptie en chylomicronsynthese en -secretie mogelijk als reactie op verschillende experimentele voedingsstoffen.

De isolatie van stromende mesenteriale lymfe bij muizen om in vivo kinetiek van lipideabsorptie in de voeding en chylomicronsecretie te kwantificeren

Triglyceride lipolyse in adipocyten is een belangrijk metabolisch proces dat resulteert in de afgifte van vrije vetzuren en glycerol. Hier bieden we een gedetailleerd protocol om basale en gestimuleerde lipolyse te meten in adipocyten en ex vivo vetweefsel van muizen.

Het meten van de snelheid van lipolyse in ex vivo muizenvetweefsel en primaire preadipocyten gedifferentieerd in vitro

Dit protocol presenteert een gedetailleerde benadering voor het repliceren van een muizenmodel van door hyperlipidemie geïnduceerd hartfalen met behouden ejectiefractie (HFpEF). Het ontwerp combineert de toediening van adeno-geassocieerd virus, 9-cardiaal troponine, T-lipoproteïnereceptor met lage dichtheid (AAV9-cTnT-LDLR) en poloxamer-407 (P-407).

Een muizenmodel van door hyperlipidemie geïnduceerd hartfalen met behouden ejectiefractie

Insulineklaring in de lever is van cruciaal belang voor het reguleren van de glucosehomeostase. Dit artikel beschrijft een gebruiksvriendelijke leverperfusieprocedure voor het direct evalueren van de insulineklaringssnelheid in de lever in situ bij muizen.

Beoordeling van insulineklaring bij muizen via in situ leverperfusie

Geprogrammeerde elektrische stimulatie biedt de mogelijkheid tot geleiding eigenschappen van het hart te bepalen, en de mogelijkheid om te induceren en te beëindigen hartritmestoornissen met behulp van verschillende pacing protocollen. Met behulp van een katheter transveneuze, kan intracardiale elektrogram opnames worden verkregen bij muizen na geprogrammeerde elektrische stimulatie protocollen aritmogene substraten te identificeren.

Geprogrammeerde elektrische stimulatie in Muizen

Leer eenvoudige assays voor het beoordelen van lipidenmetabolisme bij muizen. Deze toegankelijke methoden vereisen geen gespecialiseerde apparatuur en vergemakkelijken in vivo metabolismeonderzoek.

Beoordeling van de lipidenbehandelingscapaciteit van het hele lichaam bij muizen

Meer video's verkennen