Name: In vivo Evaluatie van mucociliaire klaring bij muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Leer mucociliaire klaring meten in muizen via SPECT/CT-beeldvorming met radionucliden. Deze reproduceerbare methode ondersteunt onderzoek naar luchtwegfunctie en geneesmiddelontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

M.Z. en K.S.F. en dit werk werd ondersteund door een subsidie toegekend in het kader van de Pitt Innovation Challenge (PInCh), via het Clinical and Translational Science Institute aan de Universiteit van Pittsburgh, en NHLBI R01 grant HL153407, toegekend aan M.Z.

De Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Pittsburgh heeft alle dierprotocollen goedgekeurd die in deze publicatie zijn gespecificeerd voordat een van deze dierproeven werd uitgevoerd.
OPMERKING: Dit protocol beschrijft hoe u in vivo mucociliaire klaringsstudies uitvoeren met behulp van radionuclide-beeldvorming met een SPECT/CT-scanner met dubbele modaliteit. De aangetoonde technieken zijn het uitvoeren van systeemkalibraties, het verdoven van muizen, tracheale intubatie van muizen, het inbrengen van de isotoop in de longen, dual-modality imaging, co-registratie van deze beelden en analyse.
1. SPECT/CT-systeeminstellingen
<ol><li>Ontwerp een geschikte workflow en stel deze in voordat u experimenten uitvoert met levende dieren.<ol>
<li>Gebruik een SPECT-acquisitie bestaande uit 60 projecties met een stapgrootte van 6o tussen projecties met een rotatieradius van 40 cm. De CT-acquisitie bestaat uit 220 projecties met een hoek van 1,6o tussen projecties.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zorg ervoor dat het systeem de juiste MWB-collimators voor muizen en SPECT-beeldvorming heeft. Als de ongepaste collimators zijn geïnstalleerd, gebruikt u de wizard collimator om de juiste te installeren.</li>
	<li>Voer de benodigde systeemkalibraties uit om het systeem klaar te maken voor gebruik. OPMERKING: De SPECT- en CT-componenten van de scanner moeten worden gekalibreerd. Kalibreer de CT-componenten met behulp van een bronconditionering en een Dark/Light (D/L) kalibratie eenmaal per dag, een Center Offset (COS) kalibratie om de 2 weken en evalueer de röntgenhardware elke maand. De SPECT-componenten moeten eenmaal per jaar worden gekalibreerd.<ol>
<li>Als u de röntgenhardware wilt evalueren, schakelt u het selectievakje Röntgenhardware evalueren tijdens CT-kalibraties(aanvullend CT-kalibratiemenu) in.</li>
		<li>Als u bronconditionering wilt uitvoeren, schakelt u het selectievakje Bronconditionering uitvoeren tijdens CT-kalibraties(aanvullend CT-kalibratiemenu ) in.</li>
		<li>Als u een D/L-kalibratie wilt uitvoeren, vinkt u het vakje D/L aan naast het CT-acquisitieprotocol dat wordt gebruikt tijdens experimenten tijdens CT-kalibraties. Schakel alle andere protocollen uit(aanvullend CT-kalibratiemenu).</li>
		<li>Als u een COS-kalibratie wilt uitvoeren, vervangt u het bed door het gereedschap kalibratiering, past u de instellingen van het bedtype aan in de instellingen voor bewegingsbesturing en vinkt u het COS-vakje aan naast het CT-acquisitieprotocol dat wordt gebruikt tijdens experimenten tijdens CT-kalibraties. Schakel alle andere protocollen uit(aanvullend CT-kalibratiemenu, aanvullende kalibratiering).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Muisintubatie en instillatie
<ol><li>Weeg de te scannen muizen af. Als u meerdere muizen scant, moet u ervoor zorgen dat de muizen worden gemarkeerd voor identificatiedoeleinden met behulp van methoden zoals oorponseren of het markeren van de staart.</li>
	<li>Verdoof een muis met 1,5% isofluraan met een gasstroom van 2 L/min O2 in een gaskamer gedurende ~5 minuten om anesthesie van voldoende diepte te produceren, totdat de ademhaling vertraagt tot ~55-65 ademhalingen per minuut 16 (Figuur 1A).</li>
	<li>Verwijder de muis uit de kamer en hang aan de voorste snijtanden op een intubatiestandaard op een helling van 45o. Rust de intubatiestandaard uit met een neuskegel om ervoor te zorgen dat de muis wordt verdoofd tijdens de intubatie (figuur 1B).</li>
	<li>Sluit het ene uiteinde van een glasvezeldraad van 50 μm aan op een lichtbron en rijg er een 20-gauge canule overheen met behulp van de draad om als gids te fungeren(figuur 1C).</li>
	<li>Open de mond van de muis en trek de tong naar voren met een stompe tang. Verlicht de geleidingsdraad en gebruik deze om de stembanden te visualiseren (afbeelding 1D).</li>
	<li>Passeer de geleidingsdraad door de stembanden, zodat de draad net voorbij de stembanden ligt en in de bovenste luchtpijp rust. Schuif de 1 inch canule naar voren langs de draad om de muis te intuberen en passeer de canule diep genoeg zodat de naaf ervan tegen de snijtanden van het dier is (figuur 1E). Verwijder de draad en laat de canule op zijn plaats.</li>
	<li>Test de intubatie door de canule kort met een vinger aan te sluiten en te controleren op veranderingen in de ademhaling. Gestopte ademhaling of gespannen ademhaling tijdens het stoppen en versnelde ademhaling bij het loslaten zijn tekenen van een goede tracheale intubatie. Als er geen verandering is in ademhalingspatronen bij het aansluiten van de canule, is dit laatste waarschijnlijk in de slokdarm.</li>
	<li>Bereid 0,2 mCi van 99 mtechnetium-zwavel colloïde(99mTc-Sc) in een volume van 10 μL, en pipet in de canule. Laat de muis hem spontaan inademen in de longen gedurende 1-2 min (Figuur 1F). Verwijder de canule voordat u de muis naar de pallet van de scanner brengt. OPMERKING: Het radionuclide werd bereid en gefilterd door Cardinal Health.</li>
</ol>3. SPECT/CT Beeldvorming
<ol><li>Breng de muis over op een pallet van 25 mm met een neuskegel en zet vast met tape, zorg ervoor dat de borst en buik niet te strak worden vastgebanden om te voorkomen dat de ademhaling wordt belemmerd. Zorg ervoor dat u metalen oormerken verwijdert die aan de muis zijn bevestigd.</li>
	<li>Bereid een radioactief fantoom bestaande uit 0,05 mCi in 200 μL en plaats deze hoeveelheid in een PCR-buis van 0,2 ml. Plaats de buis door op de pallet onder de onderbuik van de muis te tikken, vermijd overlapping met de longen. OPMERKING: Het fantoom wordt gebruikt voor het co-registreren van CT- en SPECT-beelden, evenals een negatieve controle voor klaring.</li>
	<li>Plaats de muis in het SPECT/CT-systeem, selecteer de imagingworkflow en voer Setupuit.</li>
	<li>Stel de positionering van de detectoren op de muis in en voer de imagingworkflow uit.</li>
	<li>Bereid een kooi voor op muizen die na de procedure radioactiviteit hebben gekregen, met onbeperkte toegang tot voedsel en water, en duidelijke etikettering met behulp van een stralingsveiligheidssticker.</li>
	<li>Verwijder na voltooiing van de workflow de muis van de imagingpallet en laat deze gedurende 6 uur tussen scans (einde van scan 1 tot begin van scan 2) herstellen in de voorbereide kooi met ad libitum-toegang tot voedsel en water. 6 uur werd gekozen omdat het overeenkomt met de tijdsperiode waarin lineaire klaring afhankelijk van de trilharenfunctie plaatsvindt met zeer weinig alveolaire klaring.</li>
	<li>Na 6 uur verdooft u de muis opnieuw en scant u, samen met het fantoom, met behulp van dezelfde workflow om de hoeveelheid isotoop te meten die uit de luchtwegen is verwijderd. OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de muis te laten herstellen, omdat ononderbroken anesthesie met isofluraan gedurende 6 uur zal leiden tot een significant trilharendepressivumeffect, wat resulteert in bijna nul slijmvliesklaringen.</li>
</ol>4. Analyse
<ol><li>Voer na beeldvorming nabewerking uit om volledige 3D-stackafbeeldingen te reconstrueren.<ol>
<li>Histogram de SPECT-beelden met behulp van de fabrieksstandaardinstellingen voor 99mTc en reconstrueer vervolgens met behulp van een MAP3D-algoritme en psf-reconstructie (point spread function). OPMERKING: De reconstructie is uitgevoerd met behulp van 8 iteraties en 6 subsets. Een effectieve reconstructie vereist een verhouding tussen deelverzamelingen en projecties om 1:10 of gelijkmatig verdelen in het aantal projecties, dus 6 deelverzamelingen werden gebruikt vanwege de verwerving met behulp van 60 projecties.</li>
		<li>Reconstrueer de CT-beelden met behulp van het Feldkamp-algoritme en een Shepp-Logan-filter. OPMERKING: De reconstructie is uitgevoerd met behulp van 4 iteraties.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwerk de CT- en SPECT-afbeeldingen in FIJI ImageJ21 met behulp van de reslice-tool om coronale weergaveafbeeldingen te genereren uit de standaard axiale afbeeldingen. Voer vervolgens een z-stack somprojectie uit op de SPECT-afbeelding om de telgegevens van elk segment toe te voegen en één afbeelding te genereren voor analysegemak.</li>
	<li>Formaat wijzigen en co-registreren van de CT- en SPECT-beelden met behulp van de fantoom-Eppendorf-buis als referentie (figuur 2A,B). Volg en gebruik consistente metingen van het formaat van alle monsters.</li>
	<li>Binariseer de CT-afbeelding met behulp van automatische drempelwaarden, gevolgd door het omkeren van de stack en het uitvoeren van een z-stack somprojectie om een overzicht van de longen te genereren voor analyse (figuur 2C).</li>
	<li>Draai de CT- en SPECT-afbeeldingen en voeg de afbeelding samen met behulp van de kanaalgereedschappen. Bereken MCC door een ROI rond de rechterlong te tekenen en te meten (Figuur 2D). OPMERKING: Deze meting is van het totale aantal in de rechterlong voor de tijdpunten van 0 en 6 uur, waarbij de 6 uur beelden gecorrigeerd zijn voor radioactief verval met behulp van de formule: N(t) = N0e−t. 99m Tc-Sc heeft een vervalconstante van 3,21e−5 per seconde met een halfwaardetijd van ~6 uur. Deze waarden kunnen vervolgens worden gebruikt om een procentuele klaring te berekenen. OPMERKING: Rechterlong wordt gekozen voor ROI-tekening en meettellingen, omdat de slijmvliesklaring de radio-isotoop uit de longen naar de keelholte zal transporteren van waaruit deze zal worden ingeslikt en in de maag terechtkomt. Vrij vaak kunnen tellingen in de maag worden gezien die kunnen overlappen met de linkerlong en dus onjuiste tellingen veroorzaken. Deze verwarring kan worden vermeden door alleen tellingen in de rechterlong te meten.</li>
</ol>

<ol><li>Afzelius, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-related+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Cilia-related diseases.</a> Journal of Pathology. 204 (4), 470-477 (2004).</li>
<li>Mitchell, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+eukaryotic+cilia+and+flagella+as+motile+and+sensory+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The evolution of eukaryotic cilia and flagella as motile and sensory organelles.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 607, 130-140 (2007).</li>
<li>Carvalho-Santos, Z., Azimzadeh, J., Pereira-Leal, J. B., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution%3A+Tracing+the+origins+of+centrioles%2C+cilia%2C+and+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution: Tracing the origins of centrioles, cilia, and flagella.</a> Journal of Cell Biology. 194 (2), 165-175 (2011).</li>
<li>Randell, S. H., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((University+of+North+Carolina+Virtual+Lung%2C+G.+Effective+mucus+clearance+is+essential+for+respiratory+health%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">University of North Carolina Virtual Lung, G. Effective mucus clearance is essential for respiratory health.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 20-28 (2006).</li>
<li>Wanner, A., Salathe, M., O'Riordan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucociliary+clearance+in+the+airways%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mucociliary clearance in the airways.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 154, Pt 1 1868-1902 (1996).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+genetic+analysis+in+mice+unveils+central+role+for+cilia+in+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease.</a> Nature. 521 (7553), 520-524 (2015).</li>
<li>Zahid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+ciliary+dysfunction+and+respiratory+symptoms+in+patients+with+transposition+of+the+great+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Airway ciliary dysfunction and respiratory symptoms in patients with transposition of the great arteries.</a> PLoS One. 13 (2), 0191605(2018).</li>
<li>Stewart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+ciliary+dysfunction%3A+Association+with+adverse+postoperative+outcomes+in+nonheterotaxy+congenital+heart+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Airway ciliary dysfunction: Association with adverse postoperative outcomes in nonheterotaxy congenital heart disease patients.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (2), 755-763 (2018).</li>
<li>Garrod, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+ciliary+dysfunction+and+sinopulmonary+symptoms+in+patients+with+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">Airway ciliary dysfunction and sinopulmonary symptoms in patients with congenital heart disease.</a> Annals of the American Thoracic Society. 11 (9), 1426-1432 (2014).</li>
<li>Harden, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+postoperative+respiratory+complications+in+heterotaxy+congenital+heart+disease+patients+with+respiratory+ciliary+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Increased postoperative respiratory complications in heterotaxy congenital heart disease patients with respiratory ciliary dysfunction.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 147 (4), 1291-1298 (2014).</li>
<li>Leigh, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+genetic+aspects+of+primary+ciliary+dyskinesia%2FKartagener+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clinical and genetic aspects of primary ciliary dyskinesia/Kartagener syndrome.</a> Genetics in Medicine. 11 (7), 473-487 (2009).</li>
<li>Donaldson, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ivacaftor+on+mucociliary+clearance+and+clinical+outcomes+in+cystic+fibrosis+patients+with+G551D-CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Effect of ivacaftor on mucociliary clearance and clinical outcomes in cystic fibrosis patients with G551D-CFTR.</a> JCI Insight. 3 (24), (2018).</li>
<li>Donaldson, S. H., Corcoran, T. E., Laube, B. L., Bennett, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucociliary+clearance+as+an+outcome+measure+for+cystic+fibrosis+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">Mucociliary clearance as an outcome measure for cystic fibrosis clinical research.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 4 (4), 399-405 (2007).</li>
<li>Ledowski, T., Hilmi, S., Paech, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchial+mucus+transport+velocity+in+patients+receiving+anaesthesia+with+propofol+and+morphine+or+propofol+and+remifentanil%5BTitle%5D)+AND+%22Anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Bronchial mucus transport velocity in patients receiving anaesthesia with propofol and morphine or propofol and remifentanil.</a> Anaesthesia. 61 (8), 747-751 (2006).</li>
<li>Donnelley, M., Morgan, K. S., Siu, K. K., Parsons, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+deposition+of+pollutant+and+marker+particles+onto+live+mouse+airway+surfaces+enhances+monitoring+of+individual+particle+mucociliary+transit+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">Dry deposition of pollutant and marker particles onto live mouse airway surfaces enhances monitoring of individual particle mucociliary transit behaviour.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, Pt 4 551-558 (2012).</li>
<li>Christopher, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+temperature+and+anesthetic+agents+on+ciliary+function+in+murine+respiratory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">The effects of temperature and anesthetic agents on ciliary function in murine respiratory epithelia.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 111(2014).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+quantitative+study+of+airway+functional+microanatomy+using+micro-optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography.</a> PLoS One. 8 (1), 54473(2013).</li>
<li>Lam, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+6-mediated+selective+autophagy+regulates+COPD-associated+cilia+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 6-mediated selective autophagy regulates COPD-associated cilia dysfunction.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5212-5230 (2013).</li>
<li>Bhashyam, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pilot+study+to+examine+the+effect+of+chronic+treatment+with+immunosuppressive+drugs+on+mucociliary+clearance+in+a+vagotomized+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A pilot study to examine the effect of chronic treatment with immunosuppressive drugs on mucociliary clearance in a vagotomized murine model.</a> PLoS One. 7 (9), 45312(2012).</li>
<li>Ortiz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Mucociliary+Clearance+by+Three+Dimension+Micro-CT-SPECT+in+Guinea+Pig%3A+Role+of+Bitter+Taste+Agonists%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Mucociliary Clearance by Three Dimension Micro-CT-SPECT in Guinea Pig: Role of Bitter Taste Agonists.</a> PLoS One. 11 (10), 0164399(2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Solomon, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+ciliary+phenotype+in+primary+ciliary+dyskinesia+by+micro-optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Assessment of ciliary phenotype in primary ciliary dyskinesia by micro-optical coherence tomography.</a> JCI Insight. 2 (5), 91702(2017).</li>
<li>Nakhleh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+respiratory+ciliary+dysfunction+in+congenital+heart+disease+patients+with+heterotaxy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">High prevalence of respiratory ciliary dysfunction in congenital heart disease patients with heterotaxy.</a> Circulation. 125 (18), 2232-2242 (2012).</li>
<li>Whaley, S. L., Renken, S., Muggenburg, B. A., Wolff, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+aerosol+deposition+restricted+to+the+nose+in+beagle+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicology+and+Environmental+Health%22%5BJournal%5D)">Technique for aerosol deposition restricted to the nose in beagle dogs.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health. 23 (4), 519-525 (1988).</li>
<li>Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+the+measurement+of+mucociliary+function+in+the+mouse+by+scintigraphy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy.</a> Journal of Applied Physiology. 90 (3), 1111-1117 (2001).</li>
<li>Bhashyam, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagal+control+of+mucociliary+clearance+in+murine+lungs%3A+a+study+in+a+chronic+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vagal control of mucociliary clearance in murine lungs: a study in a chronic preparation.</a> Autonomic Neuroscience. 154 (1-2), 74-78 (2010).</li>
<li>Van Audenhaege, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+SPECT+collimator+selection%2C+optimization%2C+and+fabrication+for+clinical+and+preclinical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Physics%22%5BJournal%5D)">Review of SPECT collimator selection, optimization, and fabrication for clinical and preclinical imaging.</a> Medical Physics. 42 (8), 4796-4813 (2015).</li>
</ol>

Geen enkele had met dit werk te maken.

De rol van beweeglijke respiratoire trilharen bij zowel ziekte als ontwikkeling blijft evolueren en wordt beter gewaardeerd. Synchroon, metachronaal kloppen van meerdere beweeglijke trilharen op het apicale oppervlak van cellen langs de tracheobronchiale boom genereren cephaladstroom producerende mucociliaire klaring of MCC. MCC wordt gecompromitteerd in ciliopathieën zoals PCD22, verworven ziekten zoals COPD18, en het belang ervan wordt erkend in CHD's, niet traditioneel beschouwd als ciliopathieën. Recente gegevens hebben aangetoond respiratoire ciliaire dysfunctie bij zowel CHD met heterotaxy23 als zonder heterotaxie7. Van een dergelijke motiele trilharing bleek zich te vertalen in grotere ademhalingssymptomen9 en grotere postoperatieve morbiditeit8. De meeste, zo niet alle, van deze ziekten hebben muismodellen beschikbaar en ons protocol voor het meten van MCC bij muizen is een waardevol hulpmiddel dat kan worden gebruikt om potentiële therapieën te testen.
Diermodellen bieden nut voor het begrijpen van ziekten en de ontwikkeling van therapieën. In vivo dierlijke beeldvorming biedt verder nut met de mogelijkheid om meerdere gegevenspunten van dezelfde dieren te verkrijgen, zonder dat de dieren hoeven te worden geofferd, waardoor onderzoekers het longitudinale verloop van de ziekte en de duur van de behandelingseffecten kunnen volgen. Het muismodel van MCC is in de loop van decennia ontwikkeld door meerdere onderzoekers, aanvankelijk uitgevoerd op beaglehonden met behulp van planaire scintigrafie, een tweedimensionale nucleaire beeldvormingstechniek24. De techniek werd een decennium later aangepast voor gebruik bij muizen, gevolgd door aanpassing aan SPECT-beeldvorming een decennium na die25,26. De ontwikkeling van deze techniek in muismodellen was een belangrijke ontwikkeling in de relevantie van deze techniek, vanwege de beschikbaarheid van meerdere muismodellen van menselijke ziekten zoals PCD waarin de ciliaire functie aanzienlijk wordt gewijzigd. MCC is beoordeeld in muismodellen van longdenervatie en immunosuppressie en kan worden gebruikt in combinatie met andere modellen19,26. MCC-meetstudies bij menselijke patiënten met luchtwegaandoeningen zoals CF, astma, PCD en ciliopathieën geassocieerd met CHD zijn uitgevoerd en hebben resultaten opgeleverd dat de techniek zowel studies naar longfysiologie als therapeutische werkzaamheid kan helpen13.
Een belangrijk onderdeel van dit protocol is het opzetten van acquisities met de juiste beeldparameters om nauwkeurige beelden te verkrijgen voor kwantificering. Een aantal factoren zijn essentieel bij het ontwerpen van SPECT-acquisitie-instellingen, waaronder welke collimators worden gebruikt, het aantal projecties dat per omwenteling moet worden verworven en de grootte van de rotatiestap. Collimatorselectie is een belangrijke factor in de gevoeligheid en resolutie van de overname, en acquisitie-instellingen moeten mogelijk worden aangepast aan de collimator die wordt gebruikt27. Als alternatief, bij het gebruik van grotere dieren zoals ratten, zouden de collimators moeten worden aangepast. Meerdere pinhole collimators zijn bijvoorbeeld gevoeliger, maar er moet op worden gelet bij het selecteren van een stapgrootte om overlappende projecties te voorkomen en ongewenste multiplexing te veroorzaken, wat de gevoeligheid van de acquisitie verder kan verhogen ten koste van enige beeldambiguïteit die reconstructie-artefacten kan veroorzaken25. Reconstructie-instellingen zijn ook de sleutel om kwantificeerbare afbeeldingen te genereren. MAP3D is een veelgebruikt iteratief reconstructiealgoritme en PSF is een veelgebruikt reconstructiemodel. Beide zijn betrouwbaar voor het reconstrueren van afbeeldingen, maar er moet voorzichtig mee worden omgegaan bij het instellen van het aantal iteraties en subsets. Een hoger aantal iteraties zal de rekentijd die nodig is voor de reconstructie verhogen en de kwaliteit van de reconstructie verhogen met afnemende rendementen bij verdere toename.
Om afbeeldingen in ImageJ te kwantificeren, is RawIntDen de ideale meettool om te gebruiken, waarmee de somwaarde van pixels in een selectie wordt uitgevoerd. Bij het kwantificeren van SPECT-gegevens over verschillende long-ROC's biedt het gebruik van RawIntDen een absolute meting van tellingen en voorkomt het aanpassen van de meting aan het gebied van de ROI, zoals de gemiddelde meting21zou zijn.
Deze techniek heeft een aantal bijbehorende bronnen van fouten waarvan de onderzoeker op de hoogte moet zijn bij het toepassen van deze techniek. Een opmerkelijke confounder is het gebruik van verdovingsmiddelen. Isofluraan is een snelwerkend, geïnhaleerd verdovingsmiddel waarvan de muizen snel herstellen na voltooiing van een overname. Er moet echter op worden gelet dat de muizen voldoende tijd hebben om in hun kooien te herstellen en niet langer verdoofd worden gehouden dan nodig is. In onze persoonlijke ervaring (ongepubliceerde gegevens) toonden muizen die continu werden verdoofd met behulp van geïnhaleerde isofluraan tussen het tijdspunt van 0 en 6 uur verwaarloosbare klaring. Evenzo is een gecontroleerde dosis verdoving ook nodig om een snel herstel te garanderen. Bij het vastzetten van het dier aan de pallet voor beeldvorming, moet de fantoombuis die wordt gebruikt voor co-registratie laag op de maag worden gehouden om te voorkomen dat artefacten overlappen met de longen. Evenzo, om een CT-beeld van hoge kwaliteit te garanderen, moet u ervoor zorgen dat metalen tags van de muis worden verwijderd om artefacten van röntgenverstrooiing te voorkomen.
Het huidige MCC-protocol kan worden toegepast op talloze diermodellen. Deze techniek heeft een verwaarloosbaar effect op de gezondheid van het gescande dier, wordt goed verdragen door muizen en kan daarom worden gebruikt met ziektemodellen zonder de gezondheid van reeds delicate muizen te riskeren. De kracht van deze methodologie komt voort uit het feit dat het een in vivo techniek is, die het mogelijk maakt om consistente en herhaalbare metingen van de luchtwegfunctie te verkrijgen zonder het offer van dieren aan accijnstracheas voor videomicroscopie, die ex vivo-modellen vereisen26. De consistentie van deze techniek bij het produceren van herhaalbare metingen over meerdere scans van dezelfde dieren, maakt het mogelijk om hetzelfde dier te behandelen met verschillende middelen of potentiële therapeutische middelen, en statistische vergelijkingen tussen hetzelfde dier om de biologische variabiliteit te verminderen die inherent is aan elk diermodel, waardoor de steekproefgrootte wordt verminderd die nodig is om statistisch significante verschillen aan te tonen.
De beoordeling van de luchtwegfunctie met behulp van de MCC-techniek kan worden aangepast aan een verscheidenheid aan diermodellen en worden toegepast op veel verschillende modellen van luchtweggezondheid, evenals het testen van nieuwe therapieën. De luchtwegen van muismodellen van PCD kunnen met behulp van deze techniek worden beoordeeld, evenals modellen van COPD. Onze methode kan ook worden gebruikt om differentiële effecten van verschillende anesthetica op MCC te bestuderen die in gemeenschappelijk klinisch gebruik zijn. Tot slot kunnen de effecten van therapeutische middelen op de luchtwegen ook met dit model worden beoordeeld. Zoals eerder vermeld, maar draagt herhaling, omdat het een in vivo meting is, maakt het mogelijk om MCC-beoordelingen in de loop van een ziekte te herhalen, evenals testvoordelen van therapeutische interventies in de loop van de tijd. Bovendien zijn muizen de meest voorkomende proefdieren die worden gebruikt om menselijke ziekten na te bootsen / bestuderen, met in sommige gevallen meerdere transgene muismodellen van menselijke ziekten beschikbaar om uit te kiezen.

Trilharen zijn cellulaire organellen op basis van microtubuli die in de evolutionaire geschiedenis van algen tot mensen bewaard zijn gebleven. Ze komen voort uit celoppervlakken en hebben een aantal functies1, variërend van herkenning van lokale omgevingssensorische signalen tot beweeglijkheid, functies die kunnen worden getraceerd van mensen tot vroege eencellige eukaryotische organismen2,3. Trilharen kunnen niet-beweeglijk zijn en dienen als de gespecialiseerde antenne van een cel om omgevingssignalen te verwerken; of beweeglijk en meervoudig, kloppend in gesynchroniseerde, metachronale golven om vloeistofstroom te genereren, zoals in het slijmvlies van de eileiders en de bovenste en onderste luchtwegen, met uitzondering van de terminale bronchiolen die naar de longblaasjesleiden 1,2.
Het uitgebreide epitheeloppervlak van de luchtwegen wordt blootgesteld aan een constante spervuur van verontreiniging in de vorm van een verscheidenheid aan potentieel gevaarlijke geïnhaleerde verontreinigende stoffen en pathogenen, waardoor een verdediging nodig is. Een belangrijk verdedigingsmechanisme is het slijmvliesapparaat van de tracheobronchiale boom, waar een continue stroom van afgescheiden slijm mechanisch uit de luchtwegen wordt getransporteerd door het kloppen van meerdere beweeglijke trilharen langs de apicale oppervlakken van de tracheo-bronchiale epitheelcellen. Deze functie om geïnhaleerde verontreinigingen in de val te lokken, en door hun continue, synchrone afstraffing, transporteren ze cephalad4,5.
Van trilharen is aangetoond dat zij een sleutelrol spelen, zoals bij de ontwikkeling van links-rechts-patronen bij de ontwikkeling van embryo's, waarbij beweeglijke trilharen bij de embryonale knoop symmetrie breken6. Mutaties in trilharen gerelateerde genen zijn in verband gebracht met ziekten zoals congenitale hartziekte (CHD) als gevolg van de asymmetrische structuur van het hart6. Recente studies hebben een hoge incidentie van ciliaire disfunctie in de luchtwegen van patiënten met CHD gemeld, evenals een verhoogde prevalentie van postoperatieve ademhalingscomplicaties en chronische luchtwegsymptomen in de bovenste en onderste luchtwegen7,8,9,10. Van patiënten met CHD en ciliaire disfunctie, met of zonder heterotaxie, is aangetoond dat zij een verhoogd risico hebben op ademhalingscomplicaties en negatieve ademhalingsresultaten postoperatief5,8,10. Naast hun rol in signalering en ontwikkeling, is het belang van luchtwegcilia aangetoond door ciliopathieën, waarvan een goed voorbeeld primaire ciliaire dyskinesie (PCD) is. PCD is een aangeboren aandoening die het gevolg is van een aantal mutaties die de beweeglijke luchtwegcilia aantasten, wat leidt tot terugkerende longinfecties, bronchiectasis en mogelijk de noodzaak van longtransplantatie11. Bovendien, hoewel trilharen normaal zijn bij cystische fibrose (CF), de meest voorkomende aangeboren aandoening in de Kaukasische bevolking, is MCC aangetast als gevolg van dik, stroperig slijm als gevolg van mutaties in het CFTR-gen12. Er zijn meerdere muismodellen van PCD en CF, evenals een steeds groter aantal modellen CHD. Uiteindelijk zijn trilharen veelzijdige structuren met veel sleutelrollen, en een methode om de functie van beweeglijke respiratoire trilharen in vivo te beoordelen, kan waardevol zijn voor preklinisch onderzoek en het beoordelen van effecten van mutaties en geneesmiddelen op mucociliaire klaring (MCC)13. De methode zou ook waardevol zijn bij het beoordelen van effecten van nieuwe geneesmiddelen, gentherapie of interventies op MCC in deze muismodellen.
Er zijn veel verschillende modellen die zijn gebruikt om MCC te beoordelen. Een opmerkelijke methode omvat het gebruik van methyleenblauwe kleurstof die in de bronchus is ingebracht, met klaring gemeten door fiberoptische meting van kleurstofbeweging14. Deze methode wordt beperkt door het vermogen om de beweging van de kleurstof te observeren, wat meer routine is bij mensen dan in preklinische muismodellen. Een andere opmerkelijke methode is synchrotron fase-contrast röntgenbeeldvorming (PCXI), die kan worden gebruikt om individuele deeltjes in een luchtweg te volgen. Deze methode is relatief nieuw en niet breed toegankelijk15. Er zijn tal van ex vivo methoden om de luchtwegen te beoordelen door een luchtpijp af te snijden voor videomicroscopie, maar deze modellen bieden weinig nut bij menselijke patiënten16. Hoge resolutietechnieken voor trilharing zoals optische coherentietomografie zijn op dezelfde manier beperkt17.
In dit artikel presenteren we een reproduceerbare methode om MCC in vivo te meten die is gebruikt om longklaringen in talloze diermodellen te meten, evenals MCC te bestuderen bij chronische obstructieve longziekte en de effecten van immunosuppressieve geneesmiddelen te beoordelen18,19. Deze methode volgt de klaring van de radiofarmaceutische 99mtechnetium-zwavel colloïde(99mTc-Sc), een onoplosbare deeltjesradiotracer, na instillatie in de longen. Het radionuclide kan vervolgens worden gevolgd met behulp van single photon emission computed tomography (SPECT)18,20. We hebben deze techniek voor het meten van MCC verder verfijnd met behulp van dual modality SPECT en computed tomography (CT) imaging met co-lokalisatie van radio-isotopentellingen naar de longen en het meten van de afname van deze tellingen gedurende 6 uur. Dual-modality imaging, met co-registratie van CT- en SPECT-beelden, maakt een nauwkeurige lokalisatie van stralingstellingen naar onze interesseregio, de longen, mogelijk. Hoewel we de methode voor MCC-meting bij muizen in detail beschrijven, kan het protocol worden aangepast om MCC bij ratten te bestuderen. De collimators moeten worden aangepast, evenals de stralingsdosis. Naar onze mening zijn muis MCC-scans technisch uitdagender vanwege de kleine diergrootte, maar nuttiger dan ratten vanwege het grote aantal gevestigde muismodellen van een aantal menselijke aandoeningen. Bovendien is een grotere steekproefgrootte, vanwege hun lagere kosten en kosten van onderhoud in dierenkolonies, beter haalbaar bij muizen.

<table><tbody><tr><td>500 &micro;m Unjacketed Fiber Optic Wire</td><td>Edmund Optics</td><td>02-532</td><td></td></tr><tr><td>99mTechnecium-Sulfur Colloid</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia Vaporizer</td><td>Vetland Medical</td><td>A13480</td><td></td></tr><tr><td>Durmont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>99150-20</td><td></td></tr><tr><td>FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Introcan Safety Catheters 20G 1inch</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1534477</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>118-2097</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Intubation Stand</td><td>Kent Scientific</td><td>ETI-MSE-01</td><td></td></tr><tr><td>Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT</td><td>Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single Channel Anesthesia Stand</td><td>Summit Anesthesia Solutions</td><td>22860</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo evaluatie van mucociliaire klaring bij muizen

In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

Respiratoire beweeglijke trilharen, gespecialiseerde organellen van de cel, bekleden het apicale oppervlak van epitheelcellen langs de luchtwegen. Door op een metachronale, synchrone manier te kloppen, genereren deze meervoudige, beweeglijke, actine-gebaseerde organellen een cephalad vloeistofstroom die de luchtwegen van geïnhaleerde verontreinigende stoffen en pathogenen vrijmaakt. Met toenemende milieuvervuiling, nieuwe virale pathogenen en opkomende multi-drug resistente bacteriën, cilia gegenereerde mucociliaire klaring (MCC) is essentieel voor het behoud van de gezondheid van de longen. MCC is ook depressief bij meerdere aangeboren aandoeningen zoals primaire ciliaire dyskinesie, cystische fibrose en verworven aandoeningen zoals chronische obstructieve longziekte. Al deze aandoeningen hebben, in sommige gevallen meerdere, muismodellen vastgesteld. In deze publicatie beschrijven we een methode met behulp van een kleine hoeveelheid radioactiviteit en SPECT/CT-beeldvorming met dubbele modaliteit om MCC nauwkeurig en reproduceerbaar te meten bij muizen in vivo. De methode maakt herstel van muizen na beeldvorming mogelijk, waardoor seriële metingen mogelijk zijn en potentiële therapieën in de loop van de tijd in de lengterichting worden getest. De gegevens in wilde muizen tonen de reproduceerbaarheid van de MCC-meting aan, zolang er voldoende aandacht voor detail wordt besteed en het protocol strikt wordt nageleefd.

Met behulp van dit protocol verdoofden we muizen in een isofluraankamer (figuur 1A). Na het bereiken van een adequaat anesthesieniveau werden muizen op verticale steunen geplaatst (figuur 1B) en werden de stembanden gevisualiseerd met behulp van een verlichte geleidingsdraad (figuur 1C-1D). De muizen werden geïntubeerd en ingebracht met 0,2 mCi 99mTc-Sc in volumes van 10 μL via een canule en muizen mochten spontaan inademen in de longen (Figuur 1E-1F). Na beeldverwerving en -verwerking werden de CT- en SPECT-beelden colocalized (figuur 2A) met behulp van de fantoombuis als oriëntatiepunt (figuur 2B). Maskers van de longen werden gegenereerd uit het CT-beeld (figuur 2C) en gebruikt om ROC's rond de rechterlong te tekenen voor analyse bij 0 (figuur 2D) en 6 uur (figuur 2E-2F). Om de reproduceerbaarheid van het protocol te testen, werden in totaal 8 muizen tweemaal gescand op verschillende dagen met identieke experimentele omstandigheden, waarbij analyse met behulp van een gekoppelde t-test geen significant verschil liet zien tussen de herhalingsscans (p-value=0,9904) (figuur 3A). Nog eens 2 muizen werden drie keer gescand op verschillende dagen met identieke experimentele omstandigheden, waarbij analyse met behulp van eenrichtings-ANOVA significante matching tussen de herhaalde scans (p-waarde van 0,0041) (figuur 3B) liet zien. In totaal werden 8 muizen gescand en twee representatieve beelden weergegeven (figuur 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig01.jpg"> Figuur 1: Muizenintubatie en isotopeninstillatie. Afbeeldingen van de stappen die nodig zijn om isotoop in de luchtwegen te intuberen en in te brengen. A) De muis wordt verdoofd in een kamer. B) De verdoofde muis wordt op een verticale steun geplaatst, opgehangen door de snijtanden aan de voorkant. C) Een verlichte 0,5 mm glasvezeldraad die als geleidedraad dient, wordt voorbereid door deze door een canule van 20 G te laten lopen. D) De mond van de muis wordt geopend met een tang en verlicht met behulp van de verlichte geleiddraad om de stembanden te visualiseren. E) De canule wordt over de stembanden geduwd en de voerdraad wordt verwijderd. F) Oplosbare isotoop wordt met behulp van een pipet in de canule ingebracht en de muis mag de isotoop spontaan inademen in de longen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig02v2.jpg"> Figuur 2: SPECT/CT beelden van een MCC scan. A) Een SPECT-afbeelding die is gelokaliseerd met een CT-image. B) Een CT-afbeelding met een zichtbare fantoombuis die werd gebruikt voor colokalisatie. C) Een masker van de luchtweg afgeleid door binariseren van de CT-afbeelding en het uitvoeren van een z-stack som projectie. D) Het CT-masker is samen met de SPECT-afbeelding gelokaliseerd. Rond de rechterlong is een ROI voor analyse getrokken. E) Een masker van de luchtwegen op 6 uur. F) Een CT en SPECT co-gelokaliseerd beeld van de luchtwegen op 6 uur met een ROI voor analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig03.jpg"> Figuur 3: Klaringsmetingen van dezelfde muizen over meerdere scans. A) Voor 8 muizen zonder veranderingen in experimentele omstandigheden werden twee individuele herhalingsklaring gemeten. Een gekoppelde t-test toonde aan dat er geen significant verschil was tussen de herhalingsscans met een p-waarde van 0,9904. B) Voor twee muizen zonder veranderingen in experimentele omstandigheden werden drie individuele herhalingsklaringen gemeten. Een eenrichtings-ANOVA toonde aan dat er een significante overeenkomst was tussen de herhalingsscans met een p-waarde van 0,0041. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig04.jpg"> Figuur 4: Co-gelokaliseerde SPECT/CT beelden van de 0 en 6 uur luchtweg in 2 muizen met ROC's getekend op 0 en 6 uur met de juiste long. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende figuur 1: Een video van de stembanden verlicht door een glasvezeldraad met het effect van ademhaling gevisualiseerd. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929supfig01.jpg" target="_blank">Klik hier om dit cijfer te downloaden.</a>
Aanvullende bestanden. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/Supplemental_Files.zip" target="_blank">Klik hier om deze bestanden te downloaden.</a>

In deze publicatie beschrijven we protocollen voor het beoordelen van luchtwegslijmvliesklaring (MCC) bij muizen in vivo met behulp van dual-modality radionuclide imaging. Dit protocol is ontworpen voor een single photon emission computed tomography (SPECT) en computed tomography (CT) acquisitieprotocol met behulp van muis whole body (MWB) collimators in een dubbel SPECT/CT systeem.

In vivo Evaluatie van mucociliaire klaring bij muizen

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a ...

Ons protocol maakt nauwkeurige meting van mucociliaire klaring in een diermodel mogelijk met behulp van radionucliden die worden gevolgd via dubbelmodaliteits SPECT en CT-beeldvorming om luchtwegklaring nauwkeurig te lokaliseren en meten. Deze techniek is een reproduceerbare methode voor het meten van MCC die kan worden toegepast op verschillende dier- en ziektemodellen vanwege het gebruik van dubbele SPECT/CT. Na bevestiging van een gebrek aan reactie op de peesreflex, bevestigt u de standaard met een neuskoker om de anesthesie te behouden en suspendeert u de geanesthetiseerde muis aan de voorste snijtanden op een intubatiestandaard in een hoek van 45 graden.Verbind een uiteinde van een 50 micron glasvezeldraad met een lichtbron en draai een canule met een diameter van 20 gauge over de draad. Gebruik stompe pincetten om de tong naar buiten te trekken en verlicht de geleidedraad om de stembanden te visualiseren. Leid de geleidedraad door de stembanden zodat de draad net voorbij de stembanden rust in de bovenste luchtpijp en schuif de canule van één inch vooruit langs de draad totdat deze diep genoeg is dat de hub tegen de snijtanden van het dier aanligt.Verwijder de draad terwijl de canule op zijn plaats blijft en gebruik een vinger om de canule kort af te sluiten om te controleren op veranderingen in de ademhaling. Voeg vervolgens 10 microliter vers bereid 0,2 millicurie 99m technetium-zwavelcolloïd toe aan de canule en laat de muis gedurende een periode van één tot twee minuten spontaan het radionuclide in de longen inhaleren. Voor SPECT/CT-beeldvorming gebruikt u, na verwijdering van de canule, tape om de muis op een 25 millimeter palet met een neuskoker te bevestigen en tapeert u een 200 microliter PCR-buisje met 0,05 millicurie radioactief fantoom onder de onderbuik van de muis onder de longen.Plaats de muis in het SPECT/CT-systeem. Selecteer de beeldvormingsworkflow en klik op Instellen. Stel de positie van de detectoren op de muis in en voer de beeldvormingsworkflow uit.Na voltooiing van de workflow, zet de muis in een nieuwe kooi met monitoring en onbeperkte toegang tot voedsel en water en een stralingsveiligheidssticker gedurende zes uur tussen de scans. Voer na de beeldvorming de histogrammen van de SPECT-beelden uit met behulp van de fabrieksstandaardinstellingen voor 99m technetium-zwavelcolloïd en gebruik een MAP3D-algoritme en puntverspreidingsfunctie reconstructie om 3D-stapelbeelden te reconstrueren. Reconstrueer de CT-beelden met behulp van het Feldkamp-algoritme en een Shepp-Logan-filter en open de CT- en SPECT-beelden in FIJI.Gebruik het hersnijgereedschap om coronale weergavebeelden te genereren vanuit de standaard axiale beelden en voer een z-stack-somprojectie uit op het SPECT-beeld om de tellingsgegevens van elke plak toe te voegen. Genereer een enkele afbeelding voor gemakkelijke analyse. En gebruik de Phantom Eppendorf-buis als referentie, herschik en coregistreer de CT- en SPECT-beelden.Gebruik automatische drempelwaarden om de CT-afbeelding te binariseren, draai de stack om en voer een z-stack-somprojectie uit om een contour van de longen voor analyse te genereren. Draai de CT- en SPECT-beelden en gebruik de kanaaltools om ze samen te voegen tot één afbeelding. Trek vervolgens een gebied van belang rond de rechterlong om de mucociliaire klaring te bepalen.Na beeldverwerving en verwerking kunnen de CT- en SPECT-beelden worden geco-lokaliseerd met behulp van de fantoombuis als herkenningspunt. Maskers van de longen kunnen worden gegenereerd uit de CT-afbeelding en worden gebruikt om gebieden van belang rond de long te tekenen voor hun analyse op verschillende tijdstippen. In deze analyse werden in totaal acht muizen twee keer op verschillende dagen onder identieke experimentele omstandigheden gescand om de reproduceerbaarheid van het protocol te testen.Gepaarde T-test-analyse toonde geen significant verschil tussen de herhalingsscans. Een extra twee muizen werden ook drie keer op verschillende dagen onder identieke experimentele omstandigheden gescand. Eenrichtings-ANOVA-analyse toonde significante overeenstemming tussen de herhalingsscans.Hier kunnen representatieve afbeeldingen van twee van de gescande muizen worden waargenomen. Het is essentieel om de luchtweg te kunnen visualiseren. En om te verifiëren dat intubatie succesvol is, verwijder indien nodig de canule en reintubeer om foute slokdarmintubatie te voorkomen.Dit protocol kan worden toegepast op ziektemodellen om de effecten van verschillende geneesmiddelen op luchtwegklaring te beoordelen en om te helpen bij de ontwikkeling van nieuwe medicamenteuze behandelingen.

in-vivo-evaluation-of-mucociliary-clearance-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Herhaalde metingen van knaagdieren respiratoire fysiologie en bemonstering van de luchtwegen ontstekingscellen wenselijk zijn, maar over het algemeen niet haalbaar. Hier beschrijven we een herhaalbare methode voor het mondeling intuberen muizen dat herhaalde metingen van de luchtwegen hyperreactiviteit en de bemonstering van de luchtwegen ontstekingscellen vergunningen.

Een reversibele, niet-invasieve methode voor Airway Resistance Metingen en bronchoalveolaire lavage Fluid Sampling in Muizen

Bron: Zhang, J., et al. P. Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production. J. Vis. Exp. (2014)Deze video demonstreert de intranasale toediening van het murine herpesvirus bij muizen om een longspecifieke immuunrespons op te wekken. Longweefsel wordt vervolgens verwerkt om cytokinenbevattende supernatanten te verkrijgen voor de daaropvolgende beoordeling van de immuunresponsen van de gastheer.

Intranasale infectie met het murine herpesvirus bij muizen om immuunresponsen van de gastheer te beoordelen

Het huidige protocol bevat een gedetailleerde stap-voor-stap beschrijving van de vereiste om metingen van de ademhalingswegen mechanica, alsmede de beoordeling van de luchtwegen voor geïnhaleerde methacholine in muizen met behulp van de geforceerde oscillatie techniek (flexiVent voeren procedures; SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canada).

Evaluatie van Respiratory System Mechanics in Muizen met behulp van de Gedwongen Oscillatie techniek

De endotheliale glycocalyx / endotheliale oppervlaktelaag is ideaal bestudeerd met behulp van intravitale microscopie. Intravitale microscopie is technisch uitdagend in een bewegend orgaan zoals de longen. We zien hoe gelijktijdige helderveld en fluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om endotheeloppervlak laagdikte schatten in een vrij...

In vivo meting van de muis Pulmonary Endothelial oppervlaktelaag

Een eenvoudige en betrouwbare techniek voor het visualiseren en kwantificeren luchtwegen trilharen beweeglijkheid en trilharen gegenereerde stroom met behulp van de muis luchtpijp wordt beschreven. Deze techniek kan worden aangepast om te bepalen hoe een groot aantal factoren beïnvloeden cilia motiliteit, zoals farmacologische agentia, genetische factoren, omgevingsfactoren blootstelling en / of mechanische factoren zoals slijm belasting.

Ex vivo methode voor High Resolution Imaging van Cilia Motility in Knaagdieren luchtwegepithelen

De gastheer immuunrespons op pathogene infectie een strak gereguleerd proces. Met behulp van een lipopolysaccharide long exposure model in muizen, is het mogelijk om hoge resolutie evaluaties van de complexe mechanismen van pathogenese voeren.

Het gebruik van Oropharyngeal Intratracheaal PAMP Administratie en bronchoalveolaire lavage om de immuunrespons van de gastheer in Muizen Evalueer

Terwijl in vitro studie van gastheer-pathogeen interacties de karakterisering van specifieke immuunresponsen mogelijk maakt, zijn in vivo modellen vereist om de effecten van complexe responsen te observeren. Door gebruik van Candida albicans blootstelling gevolgd door Pseudomonas aeruginosa-gemedieerde longinfectie, hebben we een muismodel gevestigd van microbiële interacties betrokken bij de pathogeniteit van ventilateur-geassocieerde pneumonie.

Bestuderen van microbiële gemeenschappen<em&gt; In Vivo</em&gt;: Een model van de Host-gemedieerde interactie tussen<em&gt; Candida albicans</em&gt; En<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In het Airways

Het doel van dit artikel is bedoeld als een gedetailleerde beschrijving van de aanbevolen procedures voor het evalueren van de ademhalingsfunctie in bewuste muizen door dubbele-kamer plethysmography.

Beoordeling van de ademhalingsfunctie in bewuste muizen door Double-kamer Plethysmography

Wij rapporteren hier gemeenschappelijke methoden voor het analyseren van de fagocytische functie van lymfkliertest alveolaire macrofagen en bacteriële klaring van de Long. Deze methoden bestuderen in vitro fagocytose van fluoresceïne isothiocyanaat kralen en in vivo fagocytose van Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. Ook beschrijven we een methode voor het ontruimen van P. aeruginosa bij muizen.

Alveolaire macrofaag fagocytose en bacteriën mijnen in muizen

Hier beschrijven we de meting van hoest met behulp van een niet-invasief en real-time plethysmografie van het hele lichaam (WBP) -systeem en de normatieve procedures voor het oogsten van weefselmonsters van muizen en introduceren we enkele methoden om luchtwegontsteking te beoordelen.

Methoden voor het detecteren van hoest en luchtwegontsteking bij muizen

Leer mucociliaire klaring meten in muizen via SPECT/CT-beeldvorming met radionucliden. Deze reproduceerbare methode ondersteunt onderzoek naar luchtwegfunctie en geneesmiddelontwikkeling.

In vivo Evaluatie van mucociliaire klaring bij muizen

Meer video's verkennen