Name: Embryo-injecties voor CRISPR-gemedieerde mutagenese in de mier Harpegnathos saltator (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Leer embryo-injecties voor CRISPR-gemedieerde mutagenese in Harpegnathos saltator om genfunctie in communicatie en sociaal gedrag te bestuderen. Deze methode genereert genetisch gemodificeerde mierenlijnen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken de laboratoria van Danny Reinberg en Claude Desplan aan de New York University en het laboratorium van Jürgen Liebig aan de Arizona State University voor hun steun aan mierengenetica. Hua Yan erkent de steun van de National Science Foundation I/UCRC, het Center for Arthropod Management Technologies onder Grant No. IIP-1821914 en door partners uit de industrie. Maya Saar werd ondersteund door het United States - Israel Binational Agricultural Research and Development Fund, Vaadia-BARD Postdoctoral Fellowship No. FI-595-19.

1. Regelmatig onderhoud van Harpegnathos saltator kolonies
<ol><li>Onderhoud wild-type kolonies van H. saltator in transparante plastic dozen in een mierenopfokruimte bij 22-25 ° C en een fotoperiode van 12 uur licht: 12 uur donker (12L: 12D) verlichtingsschema.<ol><li>Gebruik kleine dozen (9,5 x 9,5 cm2) om individuele arbeiders of kleine kolonies groot te brengen. Gebruik middelgrote dozen (19 x 13,5 cm2) of grote dozen (27 x 19 cm2) om grotere kolonies te fokken (figuur 1).</li>
		<li>Om nestkasten te maken, gebruik je gips om vloeren voor de dozen te maken. Terwijl de natte pleister in het medium en de grote dozen droogt, drukt u een schuimblok in het gips op een paar centimeter diep en een paar centimeter van de achterkant van de doos om een lager nestgebied aan te wijzen. Zodra de pleister is opgedroogd, bedekt u het aangewezen nestgebied met een vierkant stuk glas. OPMERKING: In kleine dozen is het niet nodig om een lager nestgebied aan te wijzen. Als mieren verzuimen om het aangewezen onderste nestgebied te gebruiken, kan het helpen om het glas te bedekken met een vierkant stuk rood cellofaan. Dit wekt de indruk van een donkere ondergrondse ruimte die lijkt op nesten die H. saltator in het wild gebruikt en kan hen aanmoedigen om hun broed naar het aangewezen gebied te verplaatsen.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer kolonies twee keer per week met levende krekels. OPMERKING: Kolonies moeten voldoende worden gevoed dat ze alle krekels consumeren voorafgaand aan hun volgende voeding. Voed alle geïsoleerde mieren en mutante mierenkolonies met krekels die 2-3 keer per week vooraf worden gestoken door werknemers van een reguliere kolonie.</li>
	<li>Breng regelmatig water aan op de gipsen nestkastvloer met behulp van een wasfles. OPMERKING: De pleister moet vochtig genoeg zijn om niet stoffig aan te raken, maar het moet droog genoeg zijn dat al het toegevoegde water door de pleister wordt opgenomen. Het is belangrijk dat de nesten niet overmatig worden bewaterd. Gemiddeld hebben nestkasten een kleine hoeveelheid water nodig die eenmaal per week wordt toegevoegd.</li>
	<li>Wanneer het voeren plaatsvindt, verwijder dan afval en dode individuen. Vries al het afval en dode mieren 's nachts in bij -30 °C voordat u deze materialen als gewoon afval weggooit.</li>
	<li>Voeg periodiek een snufje gedroogd zaagsel toe aan kolonies; dit helpt larven bij het verpoppen en helpt werksters de nestkast schoon te houden.</li>
</ol>2. Bereiding van micro-injectienaalden van kwartsglas
<ol><li>Gebruik een micropipettetrekker om glazen micro-injectienaalden te trekken.</li>
	<li>Selecteer het glas dat u wilt trekken. Zorg ervoor dat het gebruikte glas is opgeslagen in een stofvrije en schone omgeving. OPMERKING: Hier is dunwandig filamenteus kwartsglas met een buitendiameter van 1,0 mm, een binnendiameter van 0,5 mm en een lengte van 7,5 cm gebruikt om micro-injectienaalden te produceren. Bij het injecteren van een embryo met een zacht lichaam kunnen borosilicienaalden ook van toepassing zijn, maar borosilicienaalden kunnen niet doordringen in hard chorion.</li>
	<li>Stel de parameterinstellingen van de trekker in. Gebruik een proces in twee stappen om micro-injectienaalden te trekken voor H. saltator-embryo's : parameters voor de eerste stap omvatten warmte van 575, filament van 3, snelheid van 35, vertraging van 145 en een trekkracht van 75; parameters van de tweede stap omvatten warmte van 425, filament van 0, snelheid van 15, vertraging van 128 en een trekkracht van 200. Zorg er na de tweede stap voor dat de resulterende naald een 2 mm taps toelopende naald heeft en een punt van 0,5 μm (figuur 2). OPMERKING: Deze set parameters, samen met parameters voor andere naaldtypen, is te vinden in de bedieningshandleiding17. Handleidingen voor pipettrekkers bieden vaak aanbevolen parameters voor een verscheidenheid aan technieken. Er kan wat vallen en opstaan nodig zijn om te bepalen welke parameters de beste naalden genereren voor specifieke behoeften. Een korte taper is ideaal voor H. saltator injecties, omdat het het harde chorion van H. saltator embryo's kan binnendringen. Als het injecteren van een zacht embryo, zoals een embryo dat is gedechorioneerd (bijv. Drosophila), kan een langere taper rond 10 mm betere resultaten opleveren. Bedieningshandleidingen voor pipettrekkers bieden meestal specifieke parameters voor het trekken van naalden die geschikt zijn voor verschillende behoeften. Het is belangrijk dat handschoenen worden gedragen bij het hanteren van glazen filamenten en het trekken van naalden. Oliën uit blote handen kunnen op het glas worden overgebracht als er geen handschoenen worden gedragen.</li>
	<li>Zodra de parameters zijn ingesteld, gebruikt u een micropipettetrekker om naalden te trekken voor micro-injectie. Zorg ervoor dat naalden in een stofvrije en schone omgeving worden bewaard totdat ze worden gebruikt. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om vers getrokken micro-injectienaalden te gebruiken. Als voorgetrokken naalden worden gebruikt, moeten ze op de juiste manier in een doos worden bewaard om schade aan naaldpunten en mogelijke verontreiniging te voorkomen. Naalden die langdurige opslag hebben ondergaan, worden niet aanbevolen voor embryo-injecties.</li>
</ol>3. Bereiding van de micro-injector
<ol><li>Gebruik een microinjector om gewenste materialen in mierenembryo's te injecteren.</li>
	<li>Bereid het micro-injectiemengsel van Cas9-eiwitten en in vitro gesynthetiseerde small guide RNA's (sgRNA's)10. Houd het mengsel op ijs totdat het tijd is om een micro-injectienaald te laden. Bewaar het micro-injectiemengsel bij -80 °C wanneer het niet in gebruik is. OPMERKING: De concentraties variëren in verschillende soorten. Een hoge concentratie kan een hoge mortaliteit veroorzaken, terwijl een lage concentratie de efficiëntie kan verminderen. We gebruiken 0,2 μg/μL Cas9 eiwitten en 0,2 μg/μL sgRNA's voor H. saltator embryo injectie. Het ontwerp van onze sgRNA's volgde een eerder vastgesteld protocol18. Gensequenties werden verkregen uit DNA-databanken. De genoomsequentie van H. saltator werd eerder ook gemeld19,20.</li>
	<li>Pas de injectieparameters voor H. saltator-embryo's aan: een injectiedruk van 140 hectopascal (hPa), een constante druk van 70 hPa en een tijd van 0,4 seconden. Pas de constante druk zodanig aan dat het materiaal slechts in één richting stroomt. Pas de injectiedruk en -tijd alleen aan als er geen materiaal van de naald in het embryo stroomt. OPMERKING: Bij het injecteren van een ander type embryo is de primaire parameter die kan veranderen constante druk, die ervoor zorgt dat vloeistof uit het embryo niet terugvloeit in de naald. Het volume wordt niet geregeld in dit protocol. Het instellen van de parameters van de microinjector is voldoende voor het verkrijgen van consistente injecties.</li>
	<li>Laad een microinjectielaald met 2 μL van het mengsel met behulp van pipetpunten van de microlader. Doe dit langzaam om ervoor te zorgen dat er geen bubbels in het mengsel worden gevormd. OPMERKING: Als er bubbels ontstaan, kan het moeilijk zijn om consistente micro-injecties te behouden.</li>
	<li>Breek alleen de punt van de naald door langs de rand van de tape te breken, zodat een smalle taps toelopende band nog steeds wordt gehandhaafd. Zorg ervoor dat de naald net genoeg gebroken is dat de punt wordt geopend, maar niet zozeer dat de taper wordt afgebroken. OPMERKING: Belangrijk is dat als de opening van de naald te breed is na het breken, de gebruiker vloeistof uit de naald ziet lopen wanneer deze op de onder druk staande micro-injector wordt gemonteerd voordat de injectiedruk wordt uitgeoefend. Sommige micro-injectieprotocollen adviseren het breken van naalden door de punt met een schaar te knippen. Deze methode wordt niet geadviseerd, omdat een schaar ervoor kan zorgen dat de punt van de naald verbrijzelt. Het injecteren van embryo's met een verbrijzelde naald zal zeer schadelijk zijn.</li>
	<li>Monteer de naald op de micromanipulator</li>
</ol>4. Injectie van embryo's
<ol><li>Selecteer embryo's voor micro-injectie uit het syncytiestadium: de tijd tijdens de ontwikkeling waarin kernen zich delen zonder cytokinese. OPMERKING: Dit is het ideale moment tijdens de ontwikkeling voor genoombewerking door micro-injectie, zoals eerder ontdekt in Drosophila21. H. saltator-embryo's passeren het syncytiele stadium en bereiken cellularisatie rond 36 uur na eiafzetting10. Hogere efficiëntie wordt bereikt als jongere embryo's worden gebruikt voor injecties.</li>
	<li>Lijn embryo's op een stuk dubbelzijdige tape geplakt op een glazen microscoopglaasje. Zorg ervoor dat embryo's goed aan de tape zijn bevestigd om beweging tijdens de injectie te voorkomen. Leg de embryo's in een verticale oriëntatie, zodat de zijkant van het embryo zich aan de rand van de tape bevindt (figuur 3). Plaats de dia en de beklede embryo's op het stadium van de microscoop op een aangewezen micro-injectiewerkstation. OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat de embryo's zo zijn gerangschikt dat opeenvolgende injecties kunnen worden uitgevoerd door de dia op het podium te bewegen in plaats van de naaldpositie bij elke injectie aan te passen. Hierdoor kunnen opeenvolgende injecties efficiënter worden uitgevoerd.</li>
	<li>Lijn de naald uit met het eerste embryo dat met behulp van de micromanipulator wordt geïnjecteerd (figuur 4a).</li>
	<li>Prik de naald zijdelings in het eerste embryo langs de dorsale/ventrale as onder een microscoop.</li>
	<li>Injecteer het micro-injectiemengsel. Zoek naar een lichte beweging van het embryo, wat wijst op een toename van de interne druk als gevolg van de geïnjecteerde vloeistof. Let bovendien op de vorming van een kleine druppel met zichtbaar sporen van weefsel en/of lipide op het buitenmembraan van het embryo (figuur 4b). OPMERKING: Aanwezigheid van sporen van weefsel en / of lipide in de druppel geeft aan dat de naald met succes zowel chorion als vitellinemembraan van het embryo heeft doorboord. Als er geen sporen van deze materialen aanwezig zijn, is de injectie niet met succes uitgevoerd en moet deze worden herhaald. Na enkele seconden wordt de druppel opnieuw geabsorbeerd door het embryo en is deze niet meer zichtbaar.</li>
	<li>Verwijder de naald voorzichtig onmiddellijk uit het embryo en ga verder met de volgende door de positie van de microscoopglaasje aan te passen. Herhaal dit totdat alle embryo's zijn geïnjecteerd.</li>
	<li>Zodra alle embryo's op de dia met succes zijn geïnjecteerd, brengt u de dia gedurende 1 uur over naar een vochtige doos om de embryo's de tijd te geven om te herstellen van het injectieproces voordat ze uit de dia worden verwijderd.</li>
</ol>5. Opfokken van geïnjecteerde embryo's
<ol><li>Verwijder na 1 uur incubatie in een vochtige doos voorzichtig de geïnjecteerde embryo's van de tape met een vederlichte tang en breng ze over in een buis gevuld met een kleine hoeveelheid 70% ethanol. Keer de buis meerdere keren om om de embryo's naar de bodem van de buis te brengen. Herhaal de ethanolwas eenmaal, gevolgd door drie wasbeurten met geautoclaveerd water.</li>
	<li>Breng met behulp van een kleine en zachte kwast alle geïnjecteerde embryo's over op 1% agarplaten met 2% antibioticum-antimycotisch. Breng het antibioticum-antimycotisch aan nadat gegoten agarplaten zijn afgekoeld door over het oppervlak van de plaat te verspreiden met behulp van een celverspreider. Sluit de agarplaat af met parafilm om agar-uitdroging te voorkomen. OPMERKING: Probeer niet om geïnjecteerde embryo's na injecties terug te brengen naar een kolonie, omdat werknemers de meeste geïnjecteerde embryo's kunnen vernietigen. Overleving wordt daarom geoptimaliseerd door embryo's te laten ontwikkelen op agarplaten buiten een normale kolonieomgeving.</li>
	<li>Incubeer de agarplaten bij 25 °C gedurende ongeveer 4 weken. Controleer regelmatig op uitkomen.</li>
	<li>Zodra het eerste embryo is uitgebroed tot een larve, breng je alle embryo's en larven terug naar een nestkast met een paar jonge verpleegsters om voor de jongen te zorgen. Voer met krekels die vooraf zijn gestoken door een grotere kolonie van het wilde type, verwijder afvalproducten en voeg water toe volgens hetzelfde protocol dat in sectie 1 wordt besproken. OPMERKING: Kleine dozen (9,5 x 9,5 cm2) zijn ideaal voor dergelijke kolonies. H. saltator plant zich goed voort in gevangenschap. Daarom kunnen gemuteerde embryo's worden grootgebracht tot volwassenheid. Isolatie van gemuteerde volwassene(n) induceert de overgang naar de reproductieve gamergate-fase. Gecontroleerde kruisingen worden gebruikt om mutantenkolonies te vestigen met heterozygote of homozygote individuen (figuur 5).</li>
</ol>

<ol><li>Evans, J. D., Wheeler, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiles+during+honeybee+caste+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression profiles during honeybee caste determination.</a> Genome Biology. 2 (1), 1-6 (2000).</li>
<li>Keller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+the+genetics+of+social+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Adaptation and the genetics of social behaviour.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1533), 3209-3216 (2009).</li>
<li>Cahan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+genetic+differences+between+queens+and+workers+in+hybridizing+Pogonomyrmex+harvester+ants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Extreme genetic differences between queens and workers in hybridizing Pogonomyrmex harvester ants.</a> Proceedings. Biological Sciences. 269 (1503), 1871-1877 (2002).</li>
<li>Volny, V. P., Gordon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+for+queen-worker+dimorphism+in+a+social+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic basis for queen-worker dimorphism in a social insect.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6108-6111 (2002).</li>
<li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eusocial+insects+as+emerging+models+for+behavioural+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Eusocial insects as emerging models for behavioural epigenetics.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (10), 677-688 (2014).</li>
<li>Liebig, J., Hölldobler, B., Peeters, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+ant+workers+capable+of+colony+foundation%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Are ant workers capable of colony foundation.</a> Naturwissenschaften. 85 (3), 133-135 (1998).</li>
<li>Bonasio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+topics+in+epigenetics%3A+ants%2C+brains%2C+and+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1260 (1), 14-23 (2012).</li>
<li>Peeters, C., Liebig, J., Hölldobler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+reproduction+by+both+queens+and+workers+in+the+ponerine+ant+Harpegnathos+saltator%5BTitle%5D)+AND+%22Insectes+Sociaux%22%5BJournal%5D)">Sexual reproduction by both queens and workers in the ponerine ant Harpegnathos saltator.</a> Insectes Sociaux. 47 (4), 325-332 (2000).</li>
<li>Trible, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((orco+mutagenesis+causes+loss+of+antennal+lobe+glomeruli+and+impaired+social+behavior+in+ants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">orco mutagenesis causes loss of antennal lobe glomeruli and impaired social behavior in ants.</a> Cell. 170 (4), 727-735 (2017).</li>
<li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+orco+mutation+produces+aberrant+social+behavior+and+defective+neural+development+in+ants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants.</a> Cell. 170 (4), 736-747 (2017).</li>
<li>Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+knockout+mutants+by+CRISPR%2FCas9+in+the+European+honeybee%2C+Apis+mellifera+L%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Science%22%5BJournal%5D)">Production of knockout mutants by CRISPR/Cas9 in the European honeybee, Apis mellifera L.</a> Zoological Science. 33 (5), 505-512 (2016).</li>
<li>Kohno, H., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mKast+is+dispensable+for+normal+development+and+sexual+maturation+of+the+male+European+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).</li>
<li>Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+integration+and+expression+of+piggyBac-derived+cassettes+in+the+honeybee+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 9003-9008 (2014).</li>
<li>Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing+in+honeybee+%28Apis+mellifera%29+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-efficiency CRISPR/Cas9-mediated gene editing in honeybee (Apis mellifera) embryos.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).</li>
<li>Chiu, Y. K., Hsu, J. C., Chang, T., Huang, Y. C., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+mediated+by+CRISPR%2FCas9+in+the+red+imported+fire+ant%2C+Solenopsis+invicta%5BTitle%5D)+AND+%22Insectes+Sociaux%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis mediated by CRISPR/Cas9 in the red imported fire ant, Solenopsis invicta.</a> Insectes Sociaux. 67 (2), 317-326 (2020).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+and+transcriptomic+analysis+of+chemosensory+receptors+in+a+pair+of+divergent+ant+species+reveals+sex-specific+signatures+of+odor+coding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding.</a> PLoS Genetics. 8 (8), 1002930(2012).</li>
<li>Sutter, P-2000 Laser Based Micropipette Puller System Operation Manual. 2.2 edn. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSutter%2C++%22Sutter+Instrument+Company%22">Sutter Instrument Company</a>. , (2012).</li>
<li>Perry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+color+vision+in+butterflies%3A+molecular+logic+behind+three+way+stochastic+choices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expanded color vision in butterflies: molecular logic behind three way stochastic choices.</a> Nature. 535 (7611), 280-284 (2016).</li>
<li>Bonasio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+comparison+of+the+ants+Camponotus+floridanus+and+Harpegnathos+saltator%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genomic comparison of the ants Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator.</a> Science. 329 (5995), 1068-1071 (2010).</li>
<li>Shields, E. J., Sheng, L., Weiner, A. K., Garcia, B. A., Bonasio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-quality+genome+assemblies+reveal+long+non-coding+RNAs+expressed+in+ant+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">High-quality genome assemblies reveal long non-coding RNAs expressed in ant brains.</a> Cell Reports. 23 (10), 3078-3090 (2018).</li>
<li>Henderson, D. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHenderson%2C+DS+%22Drosophila+Cytogenetics+Protocols%22">Drosophila Cytogenetics Protocols</a>. , Humana Press. (2004).</li>
<li>Kern, R., Stobrawa, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKern%2C+R+%22Step-by-Step+Guide%3A+Microinjection+of+Adherent+Cells+with+the+Eppendorf+Injectman%C2%AE+4+and+Femtojet%C2%AE+4%22">Step-by-Step Guide: Microinjection of Adherent Cells with the Eppendorf Injectman® 4 and Femtojet® 4</a>. , (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De evolutie van eusocialiteit bij insecten, waaronder mieren, bijen, wespen en termieten, heeft geresulteerd in het verschijnen van nieuwe gedrags- en morfologische eigenschappen, waarvan er vele worden verondersteld te worden beïnvloed door een combinatie van omgevings- en genetische factoren 1,2,3,4. Helaas is de aantrekkelijkheid en bruikbaarheid van eusociale insecten als onderzoeksmodellen...

De evolutie van eusocialiteit bij insecten, namelijk die van de orden Hymenoptera en Blattodea (voorheen Isoptera), heeft geresulteerd in unieke en vaak geavanceerde gedragskenmerken die zich manifesteren op zowel individueel als kolonieniveau. Reproductieve arbeidsverdeling, een eigenschap die de meest geavanceerde groepen sociale insecten kenmerkt, omvat vaak kastensystemen die bestaan uit verschillende gedragsmatige en vaak morfologisch onderscheidende groepen. Een dergelijke gedrags- en morfologische diversiteit tussen kasten wordt niet alleen gecontroleerd door hun genetisch systeem, maar ook vaak door de omgeving 1,2,3,4, waardoor eusociale insecten aantrekkelijke onderwerpen zijn voor genetisch en epigenetisch onderzoek.
Het vermogen om het genetische systeem van eusociale insecten te manipuleren is een uitdaging gebleken, omdat veel soorten niet paren en zich voortplanten in laboratoriumomgevingen. De meeste eusociale insecten hebben ook zeer weinig reproductieve individuen in een kolonie, waardoor het aantal nakomelingen dat kan worden geproduceerd wordt beperkt en bijgevolg de steekproefgrootte voor genetische manipulatie wordt beperkt5. Bovendien hebben veel eusociale insecten lange generatietijden in vergelijking met insecten die vaak worden gebruikt voor genetische studies (zoals Drosophila), wat bijdraagt aan de moeilijkheid om genetische lijnen vast te stellen5. Sommige eusociale soorten kunnen echter een groot deel van de reproductief actieve individuen in een kolonie genereren, wat de uitdagingen verlicht en mogelijkheden biedt om mutante of transgene lijnen vast te stellen.
In het geval van de ponerinemierensoort, Harpegnathos saltator, kunnen alle vrouwelijke werksters reproductief actief worden na de dood van een koningin of sociaal isolement. Deze arbeiders worden "gamergates" genoemd en kunnen worden gebruikt om nieuwe kolonies te genereren6. Bovendien kan er meer dan één gamergate aanwezig zijn in een kolonie, waardoor de productie van nakomelingenmet 5,7,8 toeneemt. Tot nu toe zijn mutante en/of transgene lijnen ontwikkeld in de Europese honingbij, Apis mellifera, en in de mierensoort, H. saltator, Ooceraea biroi en Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . Genetische analyses bij sociale bijen en mieren hebben de weg vrijgemaakt voor een beter begrip van eusocialiteit, waardoor een scala aan mogelijkheden wordt geboden om genen en hun effecten op eusociale insectengedrag en kastespecifieke fysiologie te bestuderen.
Hier bieden we een protocol voor genetische modificatie via het CRISPR/Cas9-systeem in H. saltator. Specifiek werd deze techniek gebruikt om een kiembaanmutatie te genereren in orco, het gen dat codeert voor de obligate co-receptor van alle odorantreceptoren (OK's)10. OR-genen zijn opmerkelijk uitgebreid in hymenopteriaanse eusociale insecten16, en orco speelt een essentiële rol in de reuk van insecten; bij afwezigheid ervan monteren of functioneren OK's niet normaal. Mutaties van het orco-gen verstoren daarom de reuksensatie, neurale ontwikkeling en geassocieerd sociaal gedrag 9,10.
In dit protocol worden Cas9-eiwitten en kleine gids-RNA's (sgRNA's) in mierenembryo's geïntroduceerd met behulp van micro-injectie met als doel mutagenese van een doelgen te induceren. Hier zullen we de micro-injectieprocedure in detail beschrijven, samen met aanwijzingen met betrekking tot de verzorging van kolonies en geïnjecteerde embryo's. Deze methoden zijn geschikt voor het induceren van mutagenese in een verscheidenheid aan verschillende genen in H. saltatormieren en kunnen worden toegepast op een breder spectrum van hymenopteraninsecten.

<table><tbody><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td><td>ThermoFisher</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 protein met NLS, hoge concentratie</td><td>PNA Bio</td><td>CP02</td><td></td></tr><tr><td>Cellofaanrol 20 inch X 5 voet</td><td>Hypogloss Products</td><td>B00254CNJA</td><td>Het product heeft veel kleurvariaties. Koop het in rood voor gebruik bij het maken van mierennesten.</td></tr><tr><td>Eclipse Ci-S rechtopstaand microscoop&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Ci-S</td><td></td></tr><tr><td>Lichtgewicht pincet, smalle punt</td><td>BioQuip</td><td>4748</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet ll micro-injector</td><td>Eppendorf</td><td>920010504</td><td>Dit product wordt niet langer verkocht of ondersteund door Eppendorf. Een vergelijkbare micro-injector kan in plaats daarvan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Microloader pipettenpunten</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>NCBI-database</td><td>National Center for Biotechnology Information</td><td>Gene ID: 105183395&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>P-2000 micropipettrekker</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-2000/G</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof dozen (19 X 13,5 cm2)</td><td>Pioneer Plastics</td><td>079C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof dozen (27 X 19 cm2)</td><td>Pioneer Plastics</td><td>195C</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof dozen (9,5 X 9,5 cm2)</td><td>Pioneer Plastics</td><td>028C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kwartsglas zonder gloeidraad</td><td>Sutter Instruments</td><td>Q100-50-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Vannas schaar, 8,5 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>Winsor &amp; Newton Cotman Water Colour Series 111 Synthetisch penseel met korte steel - Rond #000</td><td>Winsor and Newton</td><td>5301030</td><td></td></tr></tbody></table>

embryo-injecties voor crispr-gemedieerde mutagenese in de mier harpegnathos saltator

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

De unieke eigenschappen van eusociale insecten, zoals sociaal gedrag en reproductieve arbeidsverdeling, worden gecontroleerd door hun genetische systeem. Om aan te pakken hoe genen sociale eigenschappen reguleren, hebben we gemuteerde mieren ontwikkeld via toediening van CRISPR-complex in jonge embryo's tijdens hun syncytiele stadium. Hier bieden we een protocol van CRISPR-gemedieerde mutagenese in Harpegnathos saltator, een ponerinemierensoort die opvallende fenotypische plasticiteit vertoont. H. saltatormieren worden gemakkelijk gekweekt in een laboratoriumomgeving. Embryo's worden verzameld voor micro-injectie met Cas9-eiwitten en in vitro gesynthetiseerde kleine gids RNA's (sgRNA's) met behulp van zelfgemaakte kwartsnaalden. Embryo's na injectie worden buiten de kolonie grootgebracht. Na het ontstaan van de eerste larve worden alle embryo's en larven met enkele verpleegsters naar een nestkast getransporteerd voor verdere ontwikkeling. Dit protocol is geschikt voor het induceren van mutagenese voor analyse van kastespecifieke fysiologie en sociaal gedrag bij mieren, maar kan ook worden toegepast op een breder spectrum van hymenopteranen en andere insecten.

Met behulp van het hier verstrekte protocol werd genoombewerking in Harpegnathos saltator-embryo's met succes uitgevoerd. Deze resultaten werden gevalideerd via polymerasekettingreactie en pGEM-klonen van DNA geëxtraheerd uit geïnjecteerde embryo's gevolgd door DNA-sequencing. De efficiëntie van somatische mutagenese met behulp van dit protocol bereikte ongeveer 40%. F1-mutante mannetjes werden gepaard met wilde vrouwtjes om heterozygote F2-vrouwtjes te produceren die, als ze nie...

Veel kenmerken van insectenesocialiteit zijn afhankelijk van communicatie binnen de kolonie en arbeidsverdeling. Genetische manipulatie van belangrijke regulerende genen in mierenembryo's via micro-injectie en CRISPR-gemedieerde mutagenese geeft inzicht in de aard van altruïstisch gedrag bij eusociale insecten.

Embryo-injecties voor CRISPR-gemedieerde mutagenese in de mier Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

Dit protocol stelt ons in staat om genetisch gemodificeerde mieren te genereren om de functie van genen in communicatie en gedrag in een sociale omgeving te begrijpen. Het manipuleren van het genetische systeem van eusociale insecten is een uitdaging, omdat veel soorten niet paren en zich voortplanten in laboratoriumomgevingen. De opvallende fenotypeplasticiteit in de hypernasale celvloer van de mier stelt ons in staat om CRISPR-gemedieerde mutantlijnen vast te stellen.Kayli Sieber, een afgestudeerde student van een laboratorium, demonstreert de procedure. Onderhoud wild-type kolonies van H.saltator in transparante plastic dozen in een mierenopfokruimte bij 22 tot 25 graden Celsius en een 12 uur licht, 12 uur donker verlichtingsschema. Gebruik kleine dozen om individuele arbeiders of kleine kolonies op te voeden en middelgrote of grote dozen om grotere kolonies te fokken.Om nestkastjes te maken, gebruik je gips om de vloeren te maken. Terwijl de natte pleister in het medium en de grote dozen droogt, drukt u een schuimblok in het gips op een paar centimeter diep en een paar centimeter van de achterkant van de doos om een lager nestgebied aan te wijzen. Zodra de pleister is opgedroogd, bedekt u het aangewezen nestgebied met een vierkant stuk glas.Voer kolonies twee keer per week met levende krekels en breng regelmatig water aan op de plastic nestkastvloer met behulp van een wasfles. Wanneer het voeren plaatsvindt, verwijder dan afval en dode individuen. Vries al het afval en dode mieren 's nachts in bij min 30 graden Celsius voordat u deze materialen als gewoon afval weggooit.Voeg periodiek een snufje gedroogd zaagsel toe aan de kolonies om larven te helpen terwijl ze verpopping ondergaan en om werknemers te helpen de nestkast schoon te houden. Gebruik een micropipettrekker om glazen micro-injectienaalden te trekken. Zorg ervoor dat het gebruikte glas is opgeslagen in een stofvrije en schone omgeving.Gebruik een proces in twee stappen om micro-injectienaalden te trekken. Voor de eerste stap stelt u de warmte in op 575, filament op 3, snelheid op 35, vertraging op 145 en de trek op 75. Voor de tweede stap stelt u de warmte in op 425, filament op 0, snelheid op 15, vertraging op 128 en de trekkracht op 200.Zorg ervoor dat de resulterende naald een 2 millimeter taps toelopende en een punt van 0,5 micrometer heeft. Nadat u aan de naalden hebt getrokken, bewaart u ze in een stofvrije en schone omgeving tot gebruik. Bereid het micro-injectiemengsel van caseïne-eiwitten en in-vitro gesynthetiseerde kleine gids-RNA's voor.Houd het mengsel op ijs totdat het tijd is om een micro-injectienaald te laden. Wanneer het niet in gebruik is, bewaar het micro-injectiemengsel dan bij min 80 graden Celsius. Stel de injectieparameters in op een injectiedruk van 140 hectopascal, een constante druk van 70 hectopascal en een tijd van 0,4 seconden.Pas de constante druk zodanig aan dat het materiaal slechts in één richting stroomt en pas de injectiedruk en -tijd alleen aan als er geen materiaal van de naald in het embryo stroomt. Laad een micro-injectienaald met twee microliter van het mengsel met behulp van pipetpunten van de microlader. Doe dit langzaam om ervoor te zorgen dat er geen bubbels in het mengsel worden gevormd.Breek alleen de punt van de naald langs de rand van de tape, zodat een smalle taps toelopende band nog steeds wordt gehandhaafd. Zorg ervoor dat de naald net genoeg gebroken is dat de punt wordt geopend, maar niet zozeer dat de taper wordt afgebroken. Monteer vervolgens de naald op de micromanipulator.Selecteer embryo's voor micro-injectie uit het syncytieel stadium, dat is wanneer kernen zich delen zonder cytokinese. Bekleed de embryo's op een plaat dubbelzijdige tape die op een glazen microscoopglaasje is geplakt en zorg ervoor dat ze goed aan de tape zijn bevestigd om beweging tijdens injectie te voorkomen. Leg de embryo's in een verticale oriëntatie, zodat de zijkant van elk embryo zich aan de rand van de tape bevindt.Plaats de dia en de beklede embryo's op het stadium van de microscoop op een aangewezen micro-injectiewerkstation. Lijn de naald uit met het eerste embryo dat met behulp van de micromanipulator wordt geïnjecteerd en prik het eerste embryo lateraal langs de dorsale of ventrale as onder een microscoop. Injecteer het micro-injectiemengsel en zoek naar een lichte beweging van het embryo, wat wijst op een toename van de interne druk als gevolg van de geïnjecteerde vloeistof.Let bovendien op de vorming van een kleine druppel met zichtbare sporen van weefsel of lipide op het buitenmembraan van het embryo. Verwijder voorzichtig de naald van het embryo en ga naar het volgende embryo door de positie van de microscoopglaasje aan te passen. Herhaal dit totdat alle embryo's zijn geïnjecteerd.Zodra alle embryo's op de glijbaan met succes zijn geïnjecteerd, brengt u de dia gedurende een uur over naar een vochtige doos om de embryo's de tijd te geven om te herstellen voordat ze van de dia worden verwijderd. Was na de incubatie de dia met ethanol, verwijder voorzichtig de geïnjecteerde embryo's van de tape met een vederlichte tang en breng ze over in een buis gevuld met een kleine hoeveelheid 70% ethanol. Keer de buis meerdere keren om.Breng met behulp van een kleine en zachte kwast alle geïnjecteerde embryo's over op 1% agarplaten met 2% antibiotisch antimycotisch. Incubeer de platen bij 25 graden Celsius gedurende ongeveer vier weken en controleer regelmatig op uitkomen. Zodra het eerste embryo is uitgebroed tot een larve, breng je alle embryo's en larven terug naar een nestkast met een paar jonge verpleegsters om voor de jongen te zorgen.Onderhoud de kolonie volgens de eerder gedemonstreerde methoden. Dit protocol werd gebruikt om met succes genoombewerking uit te voeren in Harpegnathos saltator embryo's. De resultaten werden gevalideerd via PCR en pGEM-klonen van DNA geëxtraheerd uit geïnjecteerde embryo's, gevolgd door DNA-sequencing.Efficiëntie van somatische mutagenese met behulp van dit protocol bereikte ongeveer 40% F1-mutante mannetjes werden gepaard met wilde type vrouwtjes om heterozygote F2-vrouwtjes te produceren die, als ze niet gepaard gingen, F3-mannetjes produceerden. Gemuteerde F3-mannetjes werden gepaard met heterozygote vrouwtjes om F4 homozygote mutante vrouwtjes te produceren. Als gevolg van succesvolle mutagenese werden ongebruikelijke gedragingen waargenomen die correleerden met het verlies van het doelgen.Het verlies van Orco wordt geassocieerd met een verlies van feromoondetectie, onvermogen om prooien te detecteren, verminderde vruchtbaarheid en zwerven uit de kolonie. Bij het uitvoeren van dit protocol moet embryoschade tijdens injectie worden geminimaliseerd. Dit kan worden gedaan door ervoor te zorgen dat de naaldpunt niet te breed wordt geopend en door de naald langzaam te bewegen tijdens het injecteren.Vergelijkbare technieken kunnen worden gebruikt om transgene mieren te genereren en te onderhouden, die meer geavanceerde hulpmiddelen bieden voor het onderzoeken van neuronale activiteit en gedrag. CRISPR-gemedieerde neurogenese is gebruikt in andere eusociale insectensoorten, zoals honingbijen, klonal raider mieren en vuurmieren. Genetische modificaties zullen de functionele studies naar ontwikkeling, fysiologie en sociaal gedrag bij eusociale insecten vergemakkelijken.

embryo-injections-for-crispr-mediated-mutagenesis-ant-harpegnathos

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Microinjection van Nasonia vitripennis embryo's is een essentiële methode voor het genereren van de wijzigingen van het erfelijk genoom. Hier beschreven is een gedetailleerde procedure voor microinjection en transplanteren van Nasonia vitripennis embryo's, die toekomstige genoom manipulatie in dit organisme aanzienlijk zal vergemakkelijken.

Embryo Microinjection en transplantatie techniek voor Nasonia vitripennis genoom manipulatie

Hier presenteren we een protocol om Cricket eieren te injecteren, een techniek die als basismethode dient in vele experimenten in de cricket, inclusief, maar niet beperkt tot, RNA-interferentie en genomische manipulatie.

Het injecteren van gryllus krekel eieren

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de productie en de achterste CRISPR/Cas9 genoom Knockout elektrische vissen. Gedetailleerd beschreven zijn de vereiste moleculaire biologie-, fok-en veeteelt vereisten voor zowel een gymnotitievorm als een mormyrid, en injectietechnieken om Cas9-geïnduceerde Indel F0 -larven te produceren.

Uitschakeling van de vonk: CRISPR/Cas9 genoom bewerken in zwak elektrische vis

Dit protocol beschrijft micro-injectieprocedures voor Culex quinquefasciatus embryo's die zijn geoptimaliseerd om te werken met CRISPR/Cas9 genbewerkingstools. Deze techniek kan efficiënt site-specifieke, erfelijke, kiembaanmutaties genereren die kunnen worden gebruikt voor het bouwen van genetische technologieën in deze onderbelichte ziektevector.

Embryo micro-injection technieken voor efficiënte site-specifieke mutagenese in Culex quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 wordt steeds vaker gebruikt om genfunctie in niet-modelorganismen te karakteriseren. Dit protocol beschrijft hoe knock-out lijnen van Culex pipienste genereren, van het bereiden van injectiemengsels tot het verkrijgen en injecteren van muggenembryo's, evenals hoe geïnjecteerde muggen en hun nakomelingen op te wekken, te kruisen en te screenen op gewenste mutaties.

Embryo's van Culex-muggen voorbereiden en injecteren om null-mutaties te genereren met CRISPR/Cas9

We bieden een gedetailleerd protocol voor het fokken, micro-injectie van eieren en voor een efficiënte paring van de firebrat Thermobia domestica om mutante stammen te genereren en te onderhouden na genoombewerking.

Ei micro-injectie en efficiënte paring voor genoombewerking in de Firebrat Thermobia domestica

Dit protocol beschrijft de stappen van CRISPR/Cas9 gerichte mutagenese bij zandvliegen: embryoverzameling, injectie, insectenopfok en identificatie, evenals selectie van mutaties van belang.

Zandvlieg (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection voor CRISPR/Cas9 Mutagenese

Hier wordt een protocol gepresenteerd van Helicoverpa armigera (Hübner) embryo micro-injectie en knock-out mutant identificatie gemaakt door CRISPR / Cas9 genoombewerking. Gemuteerde insecten maken verder onderzoek naar genfunctie en interactie tussen verschillende genen in vivo mogelijk.

Embryo Microinjectie en Knockout Mutant Identificatie van CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Hierin staan protocollen voor het verzamelen en micro-injecteren van precellulaire maïsplanthopperembryo's met als doel hun genoom te wijzigen via CRISPR/Cas9-gebaseerde genoombewerking of voor de toevoeging van gemarkeerde transponeerbare elementen door kiembaantransformatie.

Micro-injectie van Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryo's voor CRISPR/Cas9 Genome Editing

Dit artikel demonstreert CRISPR-Cas9-gemedieerde genoomengineering in Steinernema hermaphroditum, een entomopathogene (EPN: insect-parasitaire) nematode en een opkomend genetisch model. De beschreven technologie is nuttig voor het creëren van mutanten, waardoor genfuncties in de nematodebiologie kunnen worden opgehelderd die relevant zijn voor mutualistische en parasitaire symbiose.

CRISPR-Cas9-gebaseerde mutagenese in de entomopathogene nematode Steinernema hermaphroditum en het onderhoud van mutante lijnen

Deze studie ontwikkelde een workflow voor het genereren en onderhouden van stabiele mutantlijnen voor de zoetwaterappelslak, Pomacea canaliculata. De protocollen omvatten het verzamelen van zygoten, hun micro-injectie met de CRISPR/Cas9-systeemcomponenten om genoombewerking te induceren, ex ovo-kweek van embryo's en genotypering na gecontroleerde kruisingen.

De gouden appelslak Pomacea canaliculata: Van zygoten tot stabiele mutantlijnen

Leer embryo-injecties voor CRISPR-gemedieerde mutagenese in Harpegnathos saltator om genfunctie in communicatie en sociaal gedrag te bestuderen. Deze methode genereert genetisch gemodificeerde mierenlijnen.

Embryo-injecties voor CRISPR-gemedieerde mutagenese in de mier Harpegnathos saltator

Meer video's verkennen