Synthese van pH-afhankelijke pyrazol, imidazol en isoindodondiyrrinonefluoroforen met behulp van een Claisen-Schmidt condensatiebenadering

De Condensatiereactie van Claisen-Schmidt is een eeuwenoude reactie, die voor het eerst gelijktijdig door Claisen en Schmidt werd gemeld in 1881. Het gaat om base-assisted enolate toevoeging van een keton of aldehyde, weergegeven in blauw, in een aromatische aldehyde, weergegeven in rood. Aanvankelijk resulteert de toevoeging van het enolaat in de vorming van een alcohol, zoals weergegeven in de haakjes.

Een daaropvolgende uitdroging produceert echter uiteindelijk een enone. Omdat het aro-aldehyde geen alfawaterstof bevat, kan het geen enolaat vormen. Als gevolg hiervan kunnen vaak zwakke basen, zoals hydroxide, worden gebruikt om het enolaat te genereren.

De Claisen-Schmidt condensatie is in de loop der jaren gebruikt om een aantal verbindingen te genereren. Het is echter uitgebreid gebruikt om zich aan te sluiten bij de aromatische ringsystemen van de chalconen en flavanonen, die in rood en blauw worden weergegeven. Het blauwe gedeelte geeft aan dat afgeleid van het enolaat en het rood van het aromatische gedeelte is.

De chalconen en flavanonen zijn de essentiële kern van een reeks biologisch actieve moleculen die een scala aan activiteiten bezitten, zoals antibacteriële, schimmelwerende, ontstekingsremmende en antitumor, afhankelijk van het substitutiepatroon. Een andere brede klasse moleculen gegenereerd uit de Claisen-Schmidt condensatiereactie zijn de methine-overbrugde verbindingen waarvan we voorbeelden geven in deze studie. Ons lab is geïnteresseerd in fluorescerende bestanddelen van het pigment bilirubine, dat van nature een afbraakproduct van heem produceert.

De synthese van bilirubine en veel van zijn bestanddelen draait om de condensatie van het Claisen-Schmidt-type, die kan worden gevisualiseerd in de structuren die worden weergegeven door het blauwe enolaat en de rode aromatische aldehydecomponenten. Meestal zijn directe bestanddelen van bilirubine, zoals dipyrrinonen, niet-fluorescerend. Als men echter de twee stikstofgroepen overbrugt met een methyleen- of carbonylgroep, worden de resulterende moleculen sterk fluorescerend, zoals in het geval van xanthoglows.

Normaal gesproken absorberen dipyrrinonen UV- of blauw licht, wat resulteert in een Z-naar-E-isomerisatieproces. Net als onoverbrugde dipyrrinonen absorberen de N in overbrugde dipyrrinonen ook UV- of blauw licht, maar verschillen in die zin dat ze in een opgewonden toestand ontspannen via fluorescentie. We hebben onlangs een reeks didistofderivaten ontdekt die eigenlijk fluoresceert zonder een covalente brug die de twee stikstofgroepen met elkaar verbindt.

In plaats daarvan lijkt een waterstofbinding het Z-naar-E-isomeerproces af te schrikken, wat leidt tot een fluorescentiemodus. Bovendien werd een onverwachte ontdekking gedaan dat deze moleculen in basismedia kunnen worden gedeprotoneerd, wat leidt tot roodgeshiftte absorptie-emissiespectra in de gedeprotoneerde toestanden. Bijgevolg kunnen deze moleculen waarde hebben als ratiometrische pH-sondes.

De fluorescerende dipyrrinonederivaten worden gebruikt, waardoor een lichte aanpassing in de traditionele Claisen-Schmidt condensatiereactie ontstaat. Dit protocol wijkt af van de traditionele Claisen-Schmidt condensatiereactie in die zin dat een vinylogous enolaat afgeleid van een pyrrolinon of isoindool de nucleofiele bron is. Het vinylogige enolaat voegt toe aan een pyrazol of imidazolaldehyde om een kleine bibliotheek van dipyrrinone-analogen te genereren.

De procedure die wordt gebruikt om deze bibliotheek te maken, wordt geïllustreerd in de video. Analoge stappen kunnen echter worden gebruikt om de traditionele Claisen-Schmidt-reactie uit te voeren. Hoewel de Claisen-Schmidt-reactie een veel gebruikte synthetische reactie is en nog steeds is, is dit de eerste videotelling van deze methode, waarvan we ons bewust zijn.

Om de synthese van een fluorescerend dipyrrinone-analoog via aldolcondensatie voor te bereiden, weeg je gelijke equivalenten van de gekozen nucleofiel en elektrofiel af. Voeg ze vervolgens toe aan een ronde bodemkolf van 25 milliliter met een magnetische roerstaaf. Meet vijf milliliter ethanol met behulp van een gegradueerde cilinder.

Voeg vervolgens de ethanol toe aan de ronde bodemkolf. Meet 2,4 milliliter eerder bereid 10 molair kaliumhydroxide met behulp van een gegradueerde cilinder. Voeg vervolgens het kaliumhydroxide toe aan de kolf.

Om de kolf op reflux te zetten, breng u voldoende vacuümvet aan op de gemalen glasverbinding van een reactiecondensator om te voorkomen dat de gemalen glasverbindingen in beslag worden nemen. Sluit de condensor aan op een koudwatertoevoer en bevestig vervolgens de ingevette verbinding van de condensor aan de ronde bodemkolf. Plaats de kolf vervolgens in een oliebad of op een aluminium verwarmingsblok dat een constante temperatuur kan handhaven via een thermisch koppel met een hete plaatroerder.

Verwarm tot refluxtemperatuur terwijl u de reactie laat roeren. Het reactiemengsel moet worden gecontroleerd door middel van dunnelaagchromatografie gedurende één, drie, zes, 12 en 24 uur om de reactiesnelheid te meten en te controleren op volledig verbruik van de uitgangsmaterialen. Laat de kolf afkoelen tot kamertemperatuur en verdampt vervolgens het ethanoloplosmiddel met behulp van een roterende verdamper.

Plaats de kolf in een ijsbad en laat de kolf gedurende vijf minuten op de temperatuur van het ijsbad afvallen. Neutraliseer eventueel overgebleven kaliumhydroxide in de kolf door in één portie 1,7 milliliter azijnzuur toe te voegen. Als kristalvorming optrad na neutralisatie, volg dan de vacuümfiltratiezuiveringsprocedure.

Als er geen kristalvorming werd waargenomen, volg dan de flitskolomchromatografiezuiveringsprocedure. Plaats een rond stuk filterpapier op de trechter en maak het papier licht nat met gedeioneerd water om het aan de trechter te hechten. Om de vacuümfiltratie van kristallen voor te bereiden, monteert u een Hirsch- of Buchner-trechter in een zijarmkolf met behulp van een gemonteerde rubberadapter.

Om verstopping van het filterpapier te voorkomen dat de filtratie kan belemmeren, hebben we een grotere Hirsch- of Buchner-trechter gebruikt dan typisch is voor vergelijkbare schaalfiltratieprocessen. Giet de inhoud van de ronde bodemkolf over het filterpapier en laat het mengsel filteren. Spoel de kristallen tijdens het filtratieproces af met 10 milliliter ijskoud gedeioneerd water.

Breng de kristallen na filtratie over in een ronde bodemkolf van 25 milliliter. Breng een lichte laag vacuümvet aan op een glasadapter met een hoog vermogen vacuümlijn en sluit de adapter vervolgens aan op de ronde bodemkolf. Bevestig de glazen verbinding met een Keck-clip.

Om het krachtige vacuüm voor te bereiden op het drogen van de kristallen van elk restoplosmiddel, koelt u de glasvacuümval voldoende af met een mengsel van droogijs en aceton. Sluit een vacuümleiding met hoog vermogen aan op de glasadapter die aan de ronde bodemkolf is bevestigd. Schakel de hoogvermogen vacuümpomp in en laat de kristallen minstens een uur drogen.

Zodra de kristallen voldoende onder vacuüm zijn gedroogd, schakelt u de vacuümpomp uit en laat u de vacuümafdichting los om de ronde bodemkolf te verwijderen. Weeg de gedroogde kristallen om de opbrengst van het reactiepercentage te rapporteren. Om zich voor te bereiden op zuivering via flitskolomchromatografie, voegt u het met zuur behandelde mengsel dat geen kristallen uit de syntheseprocedure vormt, toe aan een afscheidingstrechter.

Meet 10 milliliter dichloormethaan met behulp van een gegradueerde cilinder en gebruik dit om het met zuur behandelde mengsel in de separatory trechter te verdunnen. Sluit en schud de afscheidingstrechter voorzichtig terwijl u ervoor zorgt dat u regelmatig ontlucht. Hierna moeten twee afzonderlijke lagen zichtbaar zijn in de scheidingstrechter.

Haal de waterige laag eruit met nog eens vijf milliliter dichloormethaan. Voltooi deze stap nog twee keer. Combineer alle organische fracties en voeg voldoende watervrij natriumsulfaat toe om de organische fracties te drogen.

Breng de gedroogde organische fracties over in een ronde bodemkolf en verwijder het dichloormethaan met behulp van een roterende verdamper. Verdun het resterende residu met nog eens vijf milliliter dichloormethaan. Bereid een kolom voor met ongeveer 75 gram silicagel en gebruik deze om flitskolomchromatografie op het monster uit te voeren, met 10% methanol in dichloormethaan als eluent.

Verdamper het eluent uit de verzamelde fracties met behulp van een roterende verdamper. Bereid de hoogvermogenvacuümpomp en de glazen oplosmiddelvanger voor, zoals eerder beschreven in de vacuümfiltratiezuiveringsprocedure, en laat de verzamelde vaste stof ten minste één uur drogen onder hoog vacuüm. Zodra de kristallen voldoende onder vacuüm zijn gedroogd, weegt u de gedroogde kristallen om de opbrengst van het reactiepercentage te rapporteren.

Om de structuur van elk van de dipyrrinone-analogen in de bibliotheek te bevestigen, werden verschillende spectroscopische methoden in combinatie gebruikt, waaronder nucleaire magnetische resonantiespectroscopie, infraroodspectroscopie en massaspectrometrie met hoge resolutie. UV-Vis en fluorescerende spectroscopie werden gebruikt in de fotofysische karakterisering van de fluorescerende dipyrrinone-analogen. Met behulp van de Claisen-Schmidt condensatiereactie konden we een kleine bibliotheek van 10 verbindingen synthetiseren, waaronder die van een controleverbinding die geen intermoleculaire waterstofbindingen kan aangaan.

De opbrengsten voor dipyrrinone-analogen varieerden van ongeveer 40% tot bijna kwantitatief en worden onder elk molecuul vermeld. De verbindingen met de hoogste kwantumopbrengsten, zowel in de geprotoneerde als gedeprotoneerde vormen, zijn afgeleid van 2-formylimidazol en worden weergegeven in roze dozen. De controleverbinding, die niet fluoresceert, zit in een cyaan doos.

De dipyrrinone derivaten onder een standaard 365 nanometer lange golflengte lamp geeft de waargenomen fluorescentie. Men kan visueel de roodgeshiftte fluorescentie waarnemen die het gevolg is van deprotonatie. Door de kleur van de flacons gaan ze over van blauw naar cyaan van kleur.

Voor meer kwantitatieve gegevens over de fotofysische en andere fysische eigenschappen van de dipyrrinonederivaten, leiden we kijkers naar tabel twee in het geschreven gedeelte van het manuscript. Over het algemeen biedt de Claisen-Schmidt condensatiereactie toegang tot een reeks methine-gebonden bicyclische aromatische verbindingen. Er zijn echter enkele beperkingen.

De reactie is afhankelijk van het gebruik van zowel een enolizable nucleofiel als een niet-enolizable aldehyde elektrofiel, zoals een aro-aldehyde, om succesvolle condensatie te ondergaan. Als niet aan deze basisvereiste wordt voldaan, zullen pogingen om deze reactie uit te voeren waarschijnlijk leiden tot het onvermogen om de ringsystemen en/of de productie van concurrerende nevenproducten met elkaar te verbinden. Een andere overweging is dat basisvoorwaarden worden gebruikt voor het genereren van het enolaat nucleofiel dat onverenigbaarheden kan creëren met functionele groepen die vatbaar zijn voor reacties met hydroxide.

In dergelijke gevallen is het mogelijk om hydroxide te vervangen door stikstofhoudende basen of carbonaat dat is bereikt met DBU, triethylamine, piperidine, Hunig's base en natriumcarbonaat. We hebben er gewoon voor gekozen om kaliumhydroxide te gebruiken vanwege de beschikbaarheid en relatieve kosten. Ondanks deze beperkingen kan de in het protocol beschreven methode een middel zijn om aromatische ringen voor tal van systemen te koppelen door middel van een procedureel eenvoudige en kosteneffectieve reactie in één stap.

In het geval van dipyrrinone-analogen die we hebben gesynthetiseerd, heeft de Claisen-Schmidt-condensatie een van de meest toegankelijke routes naar pH-afhankelijke fluoroforen mogelijk gemaakt die tot nu toe zijn beschreven. Niettemin zullen toekomstige ontwerpen van dipyrrinone-analogen worden ontwikkeld volgens de beschreven procedure om fluorescerende verbindingen te genereren met een sterkere intermoleculaire waterstofbindingscapaciteit en lagere pKa-waarden. Verwacht dat deze verbeterde pH-afhankelijke sondes hogere kwantumopbrengsten zullen bezitten en tegelijkertijd de visualisatie van pH-fluctuaties mogelijk maken voor een breder scala aan intracellulaire gebeurtenissen.