Name: In vitro time-lapse live-cell imaging om celmigratie naar het orgaan van Corti te verkennen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Verken celmigratie naar het orgaan van Corti met confocale microscopie en real-time imaging. Deze methode volgt MSC-migratie naar cochleaire explanten en optimaliseert stamcelhoming-efficiëntie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door onderzoeksbeurzen (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) van de National Research Foundation (NRF) of Korea en Hallym University Research Fund.

Alle onderzoeksprotocollen met ICR-muizen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Yonsei University aan het Wonju College of Medicine. Experimenten werden uitgevoerd volgens de Ethische Code van de World Medical Association. In dit protocol werden zwangere ICR-muizen gehouden in een 12/12 uur licht/ donker cyclus met vrije toegang tot voedsel en water.
1. Cochleae dissectie
<ol><li>Steriliseer de laminaire stroom weefselkweekkap door het ultraviolette licht gedurende ~ 30 minuten aan te zetten en besproei alle oppervlakken met 70% ethanol voor gebruik. Laat de oppervlakken drogen.</li>
	<li>Plaats dissectie-instrumenten gedurende 10 minuten in 70% ethanol en droog ze voor gebruik.</li>
	<li>Gebruik een operatiemes om postnatale muizen van 3-4 dagen oud te onthoofden (Figuur 2A).</li>
	<li>Plaats de schedel onder een stereomicroscoop in de laminaire stromingskap en week het weefsel in 70% ethanol.</li>
	<li>Week het weefsel snel in weefseldissectieoplossing (1x Hank's Balanced Salt Solution, 1 mM HEPES) om de ethanol te verwijderen.</li>
	<li>Snijd de middellijn van de schedel door met een chirurgisch mes (figuur 2B,C).</li>
	<li>Stel de schedel bloot door de huid voorin de huid naar beneden te trekken en de uitwendige gehoorgang van het oor door te snijden (figuur 2D).</li>
	<li>Snijd van de voorste naar het achterste deel van de schedel over de ooglijn (Figuur 2E).</li>
	<li>Open de schedel en verwijder de voorhersenen, het cerebellum en de hersenstam met een stompe tang (Figuur 2F,G).</li>
	<li>Scheid met behulp van micro-tang het slakkenhuis van het temporale bot (figuur 2H).</li>
	<li>Breng het slakkenhuis over in een petrischaaltje met weefseldissectieoplossing.</li>
	<li>Ontleed voorzichtig alle cochleaire roeicapsules, waarbij alleen het interne cochleaire zachte weefsel overblijft(figuur 2I,J).</li>
	<li>Houd de modiolus van het slakkenhuis met de tang en het cochleair kanaal vast met een ander paar tangen en scheid de twee weefsels langzaam (Figuur 2K).</li>
	<li>Verwijder de stria vascularis en het tectoriale membraan door ze voorzichtig af te pellen(figuur 2L,M).</li>
	<li>Plaats een gesteriliseerde plastic afdeklip in een nieuwe weefseldissectieoplossing en plaats het orgaan van Corti vervolgens op een afdeklip met een diameter van 9 mm, zorg ervoor dat het basilaire membraan naar beneden gericht is (Figuur 2N-P).</li>
	<li>Immobiliseer het weefsel door het membraan van de Reissner en het resterende modiolusweefsel met een tang op de afdeklip te drukken (afbeelding 2N-P).</li>
	<li>Breng de afdeklip met het ingebedde weefsel over naar het midden van een confocale schaal met een diameter van 35 mm.</li>
	<li>Plaats de glazen klooncilinder op de schaal, met de cochleaire explant in het midden van de schaal, en voeg 100 μL explantcultuurmedium (DMEM/F12, 10% foetale runderserum (FBS), 1% N2-supplement, ampicilline (10 μg/ml))10 in de cilinder toe(figuur 2Q).</li>
	<li>Plaat 5 × 103 cellen van muis beenmerg-afgeleide groene fluorescerende eiwit (GFP)-gelabeld MCC's in 2 ml cultuurmedium (45% DMEM + 45% DMEM/F12, 10% FBS, 1% N2 supplement, 10 μg/ml ampicilline) buiten de glazen cilinder (Figuur 2R).<ol>
<li>Wanneer de MSC's 80-90% samenvloeien, doorloop ze dan door ze los te maken met trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Breng de confocale schaal voorzichtig over in een bevochtigde incubator en incubeer 's nachts bij 37 °C in een CO2-atmosfeer van 5%.</li>
	<li>Aspireer alle medium binnen en buiten de cilinder en verwijder vervolgens de glazen cilinder uit de confocale schotel.</li>
	<li>Voeg 2 ml vers kweekmedium toe aan de confocale schaal en incubeer de weefselkweekschaal in een bevochtigde incubator totdat deze klaar is voor analyse.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig2v2.jpg"> Figuur 2. Dissectie van een muizenslakkenhuis en cocultuur van het orgaan van Corti en MSC's. (A) Onthoofding van de muis, (B) en(C) midline sagittale dissectie van het hoofd, (D) en (E) coronale dissectie van de hersenen, (F) en (G) verwijdering van de hersenen en temporale bot, (H) het slakkenhuis, (I) verwijdering van de benige cochleaire wand, (J) isolatie van het slakkenhuis, (K) scheiding van het cochleair kanaal van de modiolus, (L) scheiding van stria vascularis (SV) en spiraalligment (SL) van het orgaan van Corti, (M) verwijdering van het tectoriale membraan, (N-P) fixatie van het slakkenhuis op een plastic afdekslip, (Q) plaats van de deksels oranje (F, G, P) en gele schaalbalk (H,I) = 1 mm; groene schaalbalk (J-O) = 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig2v2large.jpg" target="_blank">te bekijken.</a>
2. Time-lapse beeldvorming
<ol><li>Gebruik voor de hier gepresenteerde experimenten een confocale microscopiesysteem met een stage top incubatorsysteem.</li>
	<li>Zet de confocale microscoop, het fluorescerende licht en de computer aan.</li>
	<li>Stel de omstandigheden van de stage-top incubator op het podium van de confocale microscoop in op 37 °C en 5% CO2-atmosfeer.</li>
	<li>Plaats de monsterschaal op het schotelbevestigingsvat, dek af met het deksel van de schotelbevestiging en sluit de kamer met het deksel van de bovenste kachel.</li>
	<li>Pas de zoom en focus aan om het orgaan van Corti en MSC's in het gezichtsveld te lokaliseren.</li>
	<li>Open de beeldverwerkingssoftware. Selecteer onder de zoekoptie een 20x Plan-Apochromat-objectief (numeriek diafragma 0,8) en een 0,5x bijsnijdgebied.</li>
	<li>Klik onder Acquisitieop slimme instellingen en selecteer EGFP.</li>
	<li>Open het kanaaltabblad onder Acquisitieen stel het laservermogen in op 0,2%, het pinhole op 44 μm, de master gain op 750 Ven de digitale gain op 1,0.</li>
	<li>Klik op ESID onder imaging setupen stel de ESID gain in op 4 en de digitale gain op 7.5.</li>
	<li>Klik op Tegels en stake om 210 tegels te produceren.</li>
	<li>Open de focusstrategie en selecteer de scherpstelmodus.</li>
	<li>Stel onder tijdreeksde duur in op 24 uur en het interval op 10 min.</li>
	<li>Stel onder Acquisitiede framegrootte in op 512 x 512 pixels, scansnelheid op 8, de richting naar bidirectioneel, de gemiddelde op 4xen de bits per pixel op 16.</li>
	<li>Klik op experiment starten om het experiment te starten.</li>
</ol>3. Wijziging van afbeeldingsbestanden
<ol><li>Klik tijdens de verwerkingop stikselsen stel de minimale overlay in op 5% en de maximale verschuiving op 10%.</li>
	<li>Klik op filmexport, stel ongecomprimeerdin en stel de snelheid in op 7,5.</li>
</ol>4. Immunostaining
<ol><li>Aspireer het medium voorzichtig en was het monster tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Bevestig het monster met 4% formaline in PBS gedurende 15 minuten en was het monster 3 keer met PBS gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Permeabiliseer het monster in 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten en was 3 keer met PBS gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Voeg 250 μL phalloidine-iFluor 647 reagens (1:1000 verdunning in PBS) toe en incubeer het monster gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op de shaker.</li>
	<li>Was het monster 3 keer met PBS gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Breng de afdeklip over op de glazen glijbaan en voeg 2 druppels montageoplossing toe.</li>
	<li>Plaats voorzichtig een afdeklip op de glijbaan.</li>
	<li>Sluit de hoezenlip af met heldere nagellak en bewaar bij 4 °C in het donker totdat cellen worden waargenomen.</li>
	<li>Beeld de dia af met een confocale microscoop met een geschikt filter bij excitatie/emissie (Ex/Em)=650/665 nm voor falloïdine en bij Ex/Em=488/507 nm voor EGFP.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+hearing+loss+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngologic+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Global hearing loss prevention.</a> Otolaryngologic Clinics of North America. 51 (3), 575-592 (2018).</li>
<li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+mesenchymal+stem+cells%3A+their+phenotype%2C+differentiation+capacity%2C+immunological+features%2C+and+potential+for+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+migration+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell migration and tissue repair.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li>
<li>Uder, C., Brückner, S., Winkler, S., Tautenhahn, H. M., Christ, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+MSC+from+selected+species%3A+Features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Mammalian MSC from selected species: Features and applications.</a> Cytometry A. 93 (1), 32-49 (2018).</li>
<li>Rojewski, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+a+standardized+manufacturing+protocol+for+mesenchymal+stromal+cells%3A+A+systematic+comparison+of+validation+and+manufacturing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Translation of a standardized manufacturing protocol for mesenchymal stromal cells: A systematic comparison of validation and manufacturing data.</a> Cytotherapy. 21 (4), 468-482 (2019).</li>
<li>Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cell+homing%3A+Mechanisms+and+strategies+for+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement.</a> iScience. 15, 421-438 (2019).</li>
<li>Ahn, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+enhance+efficacy+of+SPION-labeled+stem+cell+homing+by+magnetic+attraction%3A+a+systemic+review+with+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Strategies to enhance efficacy of SPION-labeled stem cell homing by magnetic attraction: a systemic review with meta-analysis.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 4849-4866 (2019).</li>
<li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+on+the+run%3A+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).</li>
<li>Sykova, E., Jendelova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+stem+cells+in+brain+and+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of stem cells in brain and spinal cord injury.</a> Progress in Brain Research. 161, 367-383 (2007).</li>
<li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55704(2017).</li>
<li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration%2C+invasion%2C+and+adhesion+assays%3A+From+cell+imaging+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107(2019).</li>
<li>Rask-Andersen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cochlea%3A+anatomical+characteristics+and+their+relevance+for+cochlear+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Human cochlea: anatomical characteristics and their relevance for cochlear implantation.</a> The Anatomical Record. 295 (11), 1791-1811 (2012).</li>
<li>Kamiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+transplantation+accelerates+hearing+recovery+through+the+repair+of+injured+cochlear+fibrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes.</a> The American Journal of Pathology. 171 (1), 214-226 (2007).</li>
<li>Lee, H. S., Kim, W. J., Gong, J. S., Park, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+safety+and+efficacy+of+autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+in+sensorineural+hearing+loss+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Audiology+and+Otology%22%5BJournal%5D)">Clinical safety and efficacy of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in sensorineural hearing loss patients.</a> Journal of Audiology and Otology. 22 (2), 105-109 (2018).</li>
<li>Vanden Berg-Foels, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+tissue+regeneration%3A+chemoattractants+for+endogenous+stem+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">In situ tissue regeneration: chemoattractants for endogenous stem cell recruitment.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (1), 28-39 (2014).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), e1685(2010).</li>
<li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170(2019).</li>
<li>Oshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+hair+cell-like+cells+from+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 141 (4), 704-716 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Transplantatie van MSC's naar beschadigde locaties om de regeneratie van beschadigde cellen te bevorderen is uitgebreid bestudeerd en het therapeutische effect is duidelijk. De transplantatie en daaropvolgende differentiatie van MSC's zijn gemeld om het gehoor te herstellen bij ratten met gehoorverlies veroorzaakt door 3-nitropropioninezuur13. Hoewel Lee c.s. MSC's trans-veneus op mensen toepasten, bereikten zij geen significante verbetering in het gehoor14. Tot voor kort w...

Gehoorverlies kan aangeboren optreden of kan geleidelijk worden veroorzaakt door verschillende factoren, waaronder veroudering, medicijnen en lawaai. Gehoorverlies is vaak moeilijk te behandelen omdat het zeer uitdagend is om een verminderde functie te herstellen zodra de haarcellen die verantwoordelijk zijn voor het gehoor zijn beschadigd1. Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie hebben naar schatting 461 miljoen mensen wereldwijd gehoorverlies, wat verantwoordelijk is voor 6,1% van de wereldbevolking. Van degenen met gehoorverlies is 93% volwassen en 7% kinderen.
Er is geprobeerd gehoorverlies te behandelen; met name een regeneratiebenadering met behulp van MSC's is een veelbelovende behandeling gebleken. Wanneer weefsel beschadigd is, worden MSC's van nature vrijgegeven in de bloedsomloop en migreren ze naar de plaats van verwondingen waar ze verschillende moleculen afscheiden om een micromilieu te vormen dat regeneratiebevordert 2. Daarom is het belangrijk om een methode te ontwikkelen om beschadigde weefsels te behandelen door de migratie van extern geïmplanteerde MSC's om organen te targeten en hun daaropvolgende afscheiding van moleculen die krachtige immuunregulatie, angiogenese en anti-apoptose veroorzaken om het herstel van beschadigde celfunctie3,4,5te verbeteren .
Het homing-proces waarbij MSC's migreren naar beschadigde weefsels kan het belangrijkste obstakel zijn om te overwinnen. MSC 's hebben een systemisch homingmechanisme met opeenvolgende stappen van tethering/rolling, activering, arrestatie, transmigratie/diapedese en migratie6,7,8. Momenteel worden er inspanningen geleverd om manieren te vinden om deze stappen te verbeteren. Verschillende strategieën, waaronder genetische modificatie, celoppervlaktechniek, in vitro priming en magnetische geleiding, zijn getest6,7. Daarnaast zijn verschillende pogingen gedaan om de bescherming en regeneratie van auditieve haarcellen te bevorderen door MSC's naar de plaats van beschadigd slakkenhuis te brengen. Het volgen van MSC's in vivo is echter tijdrovend en arbeidsintensief en vereist zeer gespecialiseerde vaardigheden9.
Om dit probleem op te lossen, werd een methode ontwikkeld om de homing van MSC's in het slakkenhuis te observeren door middel van time-lapse confocale microscopie die de migratie van cellen gedurende meerdere uren fotografeert (Figuur 1). Het werd ontwikkeld in het begin van de 20e eeuw en is onlangs uitgegroeid tot een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van migratie van specifieke cellen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig01.jpg" style="font-size: 14px;"> Figuur 1: Grafische samenvatting. (A) Nadat het ontlede orgaan van Corti met behulp van een tang op een plastic afdeklip is gehecht, wordt de afdeklip op een confocale microscopische schaal met glazen bodem van 35 mm geplaatst en (B) de glazen cilinder is geplaatst. (C) Na het vullen van de binnenkant van de glazen cilinder met medium, (D) GFP-gelabelde MSC's met medium worden zorgvuldig toegevoegd buiten de cilinder. (E) Na incubatie 's nachts, (F) wordt de glazen cilinder verwijderd en worden beelden gemaakt met een confocale microscoop. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; MSC's = mesenchymale stamcellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>10X PBS Buffer</td><td>GenDEPOT</td><td>P2100-104</td><td></td></tr><tr><td>4% Formalin</td><td>T&amp;I</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>sigma&nbsp;</td><td>A5354-10ml</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>sigma&nbsp;</td><td>A4503-100G</td><td></td></tr><tr><td>confocal dish</td><td>SPL</td><td>200350</td><td></td></tr><tr><td>confocal microscope&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>coverslip</td><td>SPL</td><td>20009</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Fluorsheild with DAPI</td><td>sigma&nbsp;</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>Dumont</td><td>0508-L5-P0</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 647 Reagent</td><td>abcam</td><td>ab176759</td><td></td></tr><tr><td>Stage Top Incubator</td><td>TOKAI HIT</td><td>WELSX</td><td></td></tr><tr><td>Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP</td><td>cyagen</td><td>MUBMX-01101</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>sigma&nbsp;</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro time-lapse live-cell imaging om celmigratie naar het orgaan van corti te verkennen

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

Om de effecten van mesenchymale stamcellen (MSC's) op celregeneratie en -behandeling te bestuderen, volgt deze methode MSC-migratie en morfologische veranderingen na co-cultuur met cochleair epitheel. Het orgaan van Corti werd geïmmobiliseerd op een plastic deklip door een deel van het membraan van de Reissner te drukken dat tijdens de dissectie werd gegenereerd. MSC's die door een glazen cilinder werden opgesloten, migreerden naar cochleair epitheel toen de cilinder werd verwijderd. Hun overheersende lokalisatie werd waargenomen in de modiolus van het orgaan van Corti, uitgelijnd in een richting die vergelijkbaar is met die van de zenuwvezels. Sommige MSC's werden echter gelokaliseerd in het limbusgebied en vertoonden een horizontaal langwerpige vorm. Bovendien werd de migratie naar het haarcelgebied verhoogd en veranderde de morfologie van de MSC's in verschillende vormen na de behandeling met kanamycine. Concluderend geven de resultaten van deze studie aan dat de cocultuur van MSC's met cochleair epitheel nuttig zal zijn voor de ontwikkeling van therapieën via celtransplantatie en voor studies naar celregeneratie die verschillende aandoeningen en factoren kunnen onderzoeken.

In vitro migratie van MSC's in driedimensionale modus is beoordeeld door een Transwell-systeem of door de traditionele wondgenezingsmethode om migratie in tweedimensionale (2D) modus11te observeren . Het orgaan van Corti is een complexe structuur die bestaat uit verschillende cellen zoals Boettcher-cellen, Claudius-cellen, Deiters-cellen, pilaarcellen, Hensen-cellen, buitenste haarcellen, binnenste haarcellen, zenuwvezels, basilair membraan en reticulaire lamina<su...

In deze studie presenteren we een real-time beeldvormingsmethode met confocale microscopie om cellen te observeren die naar beschadigd weefsel bewegen door ex vivo incubatie met het cochleaire epitheel dat het orgaan van Corti bevat.

In vitro time-lapse live-cell imaging om celmigratie naar het orgaan van Corti te verkennen

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Bestaande in vitro-methoden om migratie van MSC's te onderzoeken, omvatten Transwell- of wondgenezingsprotocollen. De hier beschreven methode kan worden gebruikt om de migratie van MSC's naar explant in realtime te volgen. In termen van explantcultuur is het voordeel van deze methode vergeleken met andere dat het een vermindering van tijd en kosten bereikt, evenals een vereenvoudiging van experimentele stappen.Deze techniek kan worden gebruikt om stamcel-homing naar het doel in realtime te observeren, wat leidt tot de ontwikkeling van modellen met geoptimaliseerde homing-efficiëntie. Het verwijderen van het tectoriale membraan is moeilijk voor onervaren onderzoekers. Afhankelijk van de ontwikkelingsfase, is het belangrijk om het juiste moment te begrijpen om het tectoriale membraan te verwijderen voor het succes van dit protocol.De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Jeong-Eun Park en Dr. Su Hoon Lee, onderzoeksprofessoren van mijn lab. Begin met het steriliseren van de weefselkweekhood met laminaire stroming door de ultraviolette lamp ongeveer 30 minuten aan te zetten. Spuit alle oppervlakken met 70% ethanol voor gebruik en laat ze drogen.Plaats de dissectie-instrumenten in 70% ethanol gedurende 10 minuten en droog ze vervolgens voor gebruik. Nadat een muis van drie tot vier dagen oud is onthoofd, week het hoofd in 70% ethanol en plaats het onder een seriële microscoop in de hood met laminaire stroming. Week het weefsel snel in weefseldissecteringsoplossing om het ethanol te verwijderen.Snijd de middenlijn van de schedel met het chirurgische mes, stel de schedel bloot door de huid naar voren te trekken en de externe gehoorgang van het oor door te snijden. Snijd van het voorste naar het achterste deel van de schedel over de ooglijn, open vervolgens de schedel en verwijder de voorhersenen, het cerebellum en de hersenstam met stompe pincetten. Gebruik micropincetten om de cochlea van het tijdelijke bot te scheiden en breng deze over in een petrischaal met weefseldissecteringsoplossing.Dissecteer voorzichtig alle cochleaire otische capsule en laat alleen het interne cochleaire zachte weefsel achter. Houd de modiolus van de cochlea vast met pincetten en het cochleaire kanaal met een ander paar pincetten, scheid vervolgens langzaam de twee weefsels. Verwijder de stria vascularis en het tectoriale membraan door ze voorzichtig weg te pellen.Plaats een gesteriliseerde plastic dekglas in nieuwe weefseldissecteringsoplossing en plaats het orgaan van Corti op het dekglas en zorg ervoor dat de basilaire membraan naar beneden wijst. Immobiliseer het weefsel door de Reissner-membraan en het resterende modiolusweefsel met pincetten op het dekglas te drukken. Breng het dekglas met het ingebedde weefsel naar het midden van een confocale schaal van 35 millimeter.Plaats de glazen kloningscilinder op de schaal met het cochleaire explant in het midden van de schaal en voeg 100 microliter explantkweekmedium toe aan de cilinder. Plaats 5.000 beenmerg-afgeleide GFP-getagde mesenchymale stamcellen of MSC's in twee milliliter kweekmedium buiten de glazen cilinder en zet de schaal in de incubator. Nadat de cellen zijn gekweekt zoals beschreven in het tekstmanuscript, zuig al het medium binnen en buiten de cilinder af en verwijder de glazen cilinder uit de confocale schaal.Voeg twee milliliter vers kweekmedium toe aan de schaal. Plaats deze in een bevochtigde incubator totdat het klaar is voor analyse. Gebruik een confocale microscoop met een incubatorhoofd met trappen.Zet de confocale microscoop, fluorescentielicht en computer aan. Stel de omstandigheden van de incubatorhoofd in op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide-atmosfeer. Plaats de monsterschaal op de schaalbevestigingsvat, bedek deze met het schaalbevestigingsdeksel en sluit de kamer met het bovenste verwarmingsdeksel.Stel de zoom en focus in om het orgaan van Corti en MSC's in het gezichtsveld te lokaliseren. Open de software voor beeldverwerking. Selecteer onder de locatie-optie een 20X plan-apochromat-objectief of numerieke apertuur 0,8 en een 0,5X-opnamegebied.Onder verwerving, klik op slimme setup en selecteer EGFP. Open het kanaaltabblad onder verwerving en stel de laservermogen in op 0,2%, de pinhole op 44 micrometer, de masterversterking op 750 volt en de digitale versterking op 1,0. Klik op ESID onder beeldopname-instellingen en stel de ESID-versterking in op vier en de digitale versterking op 7,5.Klik op tegels en stapel om 210 tegels te produceren. Open focusstrategie en selecteer de focusmodus. Onder tijdreeksen stelt u de duur in op 24 uur en het interval op 10 minuten.Onder verwerving stelt u de framegrootte in op 512 bij 512 pixels, scannelheid op acht, de richting op tweerichtings, het gemiddelde op 4X en de bits per pixel op 16. Klik op experiment starten om het experiment te beginnen. De tweedimensionale pad van mesenchymale stamcellen of MSC's werd gevolgd in een wondgenezingsmethode door een glazen cilinder te gebruiken als een barrière tussen de MSC's en het orgaan van Corti.Toen het orgaan van Corti werd gekweekt, groeiden fibroblasten zeer snel naar buiten van de buitenste haarcellen in de buitenste laag. De meeste GFP-gelabelde MSC's werden door snel groeiende fibroblasten naar buiten geduwd. Desondanks drong een deel van de fibroblastenlaag binnen en migreerde met succes naar het orgaan van Corti.De resultaten van 72 uur incubatie toonden aan dat MSC's naar het orgaan van Corti migreerden en voornamelijk gelokaliseerd waren in de modiolus en het gebied met de cochleaire zenuwvezels gescheiden van de modiolus. De morfologie van de MSC's werd veranderd in een radiale vorm, vergelijkbaar met die van zenuwvezels. De cellen werden getransformeerd in een lineaire vorm langs de limbuslijn, in plaats van het haarcelgebied.De MSC's waren in staat om te migreren en te groeien in het verzamelingsgebied van zenuwvezels door de verschillende cell

in-vitro-time-lapse-live-cell-imaging-to-explore-cell-migration

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Dit protocol beschrijft een organotypische slice assay geoptimaliseerd voor de postnatale hersenen en hoge-resolutie time-lapse beeldvorming van neuroblast migratie in de rostrale migratie stroom.

Een organotypische Slice Assay voor High-Resolution Time-Lapse Imaging van neuronale migratie in de postnatale Brain

Cellulaire processen zoals celmigratie van oudsher bestudeerd op twee-dimensionale, stijve kunststof oppervlakken. Dit rapport beschrijft een techniek voor het direct visualiseren eiwit lokalisatie en het analyseren van eiwitten dynamiek in cellen migreren in een meer fysiologisch relevante, drie-dimensionale matrix.

Live-cell imaging van het migreren van cellen die fluorescent-gemerkte eiwitten in een drie-dimensionale Matrix

We beschrijven een protocol voor real-time videoimaging van neuronale migratie in de muis voorhersenen. De migratie van viraal gemerkte of geënte neuronale precursors opgenomen in acute levende plakjes met breedveld fluorescerende beeldvorming met een relatief snelle verwerving interval de verschillende fasen van celmigratie, zoals de duur van de stationaire en migratiefasen en de snelheid van bestuderen migratie.

Time-lapse imaging van neuroblast migratie in Acute Schijfjes van de volwassen muis voorhersenen

Source: Wiegreffe, C., et. al.,  Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017) This video demonstrates time-lapse confocal microscopy to observe cortical neuron radial migration from the subventricular zone to the cortical plate via radial glial scaffolds in transduced mouse embryonic brain slices.

Time-Lapse Imaging of Cortical Neuron Radial Migration in Transduced Mouse Embryonic Brain Slices

Neuroblast migratie is een fundamentele gebeurtenis in postnatale neurogenese. We beschrijven een protocol voor efficiëntie-etikettering van neuroblasts door in vivo postnatale elektroporatie en de daaropvolgende visualisatie van hun migratie met behulp van time-lapse imaging van acute hersenen plakjes. Wij beschikken over een beschrijving van de kwantitatieve analyse van neuroblast dynamiek door video-tracking.

In vivo Postnatale Elektroporatie en time-lapse imaging van neuroblast Migratie in Muis Acute Brain Slices

Live beeldvorming van de embryonale zoogdieren slakkenhuis is uitdagend omdat de ontwikkelingsprocessen bij de hand werken op een tijdelijke helling van meer dan tien dagen. Hier presenteren we een methode voor het kweken en dan het afbeelden embryonale cochleair explant weefsel afkomstig van een fluorescerende reporter muis over vijf dagen.

Langdurige Time Lapse Imaging van Muis Cochlear Explantaten

Door celtransplantatie, cytoskelettenlabeling en verlies/winst van functiebenaderingen te combineren, beschrijft dit protocol hoe de migrererende zebravis prospectieve prechordale plaat kan worden gebruikt om de functie van een kandidaatgen in in vivo celmigratie te analyseren.

analyseren<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migratie behulp Cell Transplantaties en Time-lapse Imaging in zebravis embryo&#39;s

Dit protocol geeft instructies voor directe observatie van radiaal migrerende corticale neuronen. Bij utero- elektroporatie, organotypische snijcultuur en tijdverlopen confocal beeldvorming worden gecombineerd om de effecten van overexpressie of downregulatie van genen die geïnteresseerd zijn in migrerende neuronen direct en dynamisch te bestuderen en hun differentiatie tijdens de ontwikkeling te analyseren.

Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie

Hier bieden we een goedkope en betrouwbare methode voor het genereren van electroporated brein organotypic segment culturen van muis embryo's geschikt voor confocale microscopie en live-imaging technieken.

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren

We beschrijven de methoden voor het labelen van fluorescerende tangentieel migreren cellen door electroporation, en voor time-lapse beeldvorming van de beweging van de gelabelde cel in een flat-mount cultuur om te visualiseren migreren cel gedrag in de ontwikkelingslanden chick optic tectum .

Visualisatie van tangentiële cel migratie in de ontwikkelingslanden Chick Optic Tectum

Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors ontstaan neuronen en gliacellen in de ventriculaire zone die het ventrikel bekleedt en migreren ze naar het hersenoppervlak. Bij dit proces zijn veel genen betrokken. Dit protocol introduceert de techniek voor de time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen.

Time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen in embryonale hersenplakjes van muizen

Verken celmigratie naar het orgaan van Corti met confocale microscopie en real-time imaging. Deze methode volgt MSC-migratie naar cochleaire explanten en optimaliseert stamcelhoming-efficiëntie.

In vitro time-lapse live-cell imaging om celmigratie naar het orgaan van Corti te verkennen

Meer video's verkennen