Nasale poetsbemonstering en -verwerking met behulp van digitale hoge snelheid ciliaire videomicroscopie - aanpassing aan de COVID-19-pandemie

Het ontbreken van gepubliceerde formele operationele procedures en standaardisatie verhindert dat digitale hogesnelheidsvideomicroscopie wordt beschouwd als een bevestigende diagnostische test voor primaire ciliaire dyskinesie. Verder, om tijdens deze COVID-19-crisis een diagnostische dienst te blijven bieden, is het protocol voor ciliaire videomicroscopie aangepast om adequate besmettingsbeheersmaatregelen te omvatten. De functionele evaluatie van cilia met behulp van digitale hogesnelheidsvideomicroscopie is zeer gevoelig en specifiek voor de diagnose van primaire ciliaire dyskinesie.

In vergelijking met andere diagnostische tests voor primaire ciliaire dyskinesie is digitale hogesnelheidsvideomicroscopie relatief eenvoudig uit te voeren, goedkoop en kunnen de resultaten binnen een dag beschikbaar zijn. Digitale hogesnelheidsvideomicroscopie heeft een hogere gevoeligheid en specificiteit voor de diagnose van primaire ciliaire dyskinesie. Momenteel worden alleen elektronenmicroscopie en genetisch onderzoek erkend als bevestigende tests voor primaire ciliaire dyskinesie, maar deze tests zullen de diagnose van primaire ciliaire dyskinesie missen bij 15 tot 30%van de patiënten.

De demonstratie van de nasale borstelplichtprocedure zal worden gedaan door Lionel Benchimol, een KNO-resident uit mijn laboratorium. Voordat u het neusmonster verzamelt, laat de patiënt dan hun neus smijten. Nadat de neusholtes zijn vrijgemaakt, laat de patiënt liggen of zitten met het hoofd naar achteren gericht.

Schud de borstel in het aangevulde Medium 199 om het te bevochtigen, en plaats een endoscoop bij de ingang van de neus om de inferieure nasale turbinaat te visualiseren. Breng de cytologieborstel in de neus en beweeg de borstel achterwaarts en voorwaarts meerdere keren over het achterste deel van de inferieure nasale turbinaat voordat u hem terugtrekt. Plaats de borstel in een buis met M199.

Snijd de draad zodat deze volledig in de buis past en sluit onmiddellijk de buis. Plaats vervolgens het monster in een luchtdichte dubbele zak. Binnen negen uur na het verzamelen van het monster, open de monsterbuizen in een microbiologische veiligheidskast en gebruik Weil-Blakesley nasale tang om de borstel te agiteren om de verzamelde epitheliale strips los te maken.

Plak een dubbelzijdige spacer op een glazen plaatje en verwijder de bescherming van de spacer. Schud de buis voorzichtig om de cilia zich door de buis te laten verspreiden en gebruik een pipette om ongeveer 60 microliters van gecilieerd epitheel vanuit het midden van de buis in de spacer over te brengen. Plaats een rechthoekige dekglas van 22 bij 4 millimeter op de spacer om de kamer te sluiten en desinfecteer de plaat met 70%ethanol voordat u deze uit de microbiologische veiligheidskast verwijdert.

Na het verwisselen van handschoenen, plaats dit plaatje op de plaat van een verwarmde kast en sluit het deksel. Voeg olie toe aan het olie-immersie objectief en plaats de kast op het podium van een rechtopstaande of omgekeerde lichtmicroscoop. Schakel de kast en de lensverwarming in en pas de temperatuurinstellingen aan op de controllers van de kast en de lensverwarming.

Na vijf minuten, positioneer het objectief totdat het het dekglas raakt met de punt van de lens. Om de ademhalingsciliaire randen van het monster te visualiseren, open de camerasoftware en gebruik vervolgens het microscoopobjectief om de cellen in het monster handmatig te lokaliseren en om de cellen op de monitor te projecteren. Controleer of het beeld zichtbaar is op de monitor en pas de condensor en lensfocus indien nodig aan om de kwaliteit van het beeld te verbeteren.

Wanneer de stroken gecilieerd epitheel zijn gelokaliseerd, selecteer alleen intacte, ongestoord gecilieerd epitheliale randen die minimaal 50 micron lang zijn. Zorg ervoor dat u alleen normale randen of randen met kleine uitsteeksels gebruikt voor ciliaire functionele analyse en om gecilieerd randen met grote uitsteeksels en geïsoleerde gecilieerd cellen of enkele cellen zonder contact met zichzelf of een andere celtype uit te sluiten. Wanneer een goede rand is geselecteerd, gebruik een cameraframefrequentie van 500 frames per seconde om de slaande ciliarand gedurende ongeveer twee seconden op te nemen.

Nadat u minimaal zes goede randen in zijaanzicht hebt opgenomen, verwijdert u het plaatje van de verwarmde kast en plaatst u het plaatje, dekglas en spacer in een luchtdichte zak. Plaats vervolgens de handschoenen en het masker in de zak en plaats de zak in de juiste container voor gevaarlijk medisch afval. Om de ciliaire slagfrequentie te analyseren, opent u de opname in een geschikt videoanalysesoftwareprogramma en verdeelt u de gecilieerd randen in ongeveer vijf aangrenzende gebieden van ongeveer 10 micron.

Identificeer en visualiseer de cilia of groepen cilia met een verlaagde framesnelheid en maximaal twee ciliaire slagfrequentiemetingen per gebied om maximaal 10 ciliaire slagfrequentiemetingen per rand te verkrijgen. Noteer het aantal frames dat nodig is voor een groep cilia om vijf slagcycli te voltooien en gebruik de formule om de ciliaire slagfrequentie te berekenen. Om het percentage van elk afzonderlijk ciliair slagpatroon binnen een monster te bepalen, vergelijkt u voor elke cilium of groep cilia de precieze baan die de cilia tijdens een volledige slagcyclus volgen met het normale ciliaire slagpatroon dat wordt waargenomen op de analyse van digitale hogesnelheidsvideomicroscopie.

Attribueer een afzonderlijk ciliair slagpatroon, zoals normaal, stijf, onbeweeglijk, asynchrone of dyskinetische en circulaire, aan elk geanalyseerd cilium of groep cilia. Bereken vervolgens het percentage van elk afzonderlijk ciliair slagpatroon binnen elk monster. Het ciliaire slagpatroon dat aan het monster wordt toegeschreven, is het overheersende ciliaire slagpatroon dat wordt waargenomen.

Hier observeren we gedetailleerde resultaten van functionele ciliaire analyse van de nasale borstelplichtmonsters van 14 volwassen vrijwilligers. Uit deze 14 nasale borstelplichtmonsters werden 242 gecilieerd randen geregistreerd en 212 voldeden aan de gedefinieerde inclusiecriteria voor analyse. In totaal werden 807 metingen van de ciliaire slagfrequentie en ciliaire slagpatroon verkregen van de geanalyseerde cilia of groepen cilia.

De gemiddelde immobiliteitsindex waren vergelijkbaar met de eerder gerapporteerde waarden die werden waargenomen bij gezonde v