Name: Plantmonstervoorbereiding voor nucleoside/nucleotide-inhoudsmeting met een HPLC-MS/MS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Leer een nauwkeurige HPLC-MS/MS-methode voor kwantificering van nucleosiden en nucleotiden in planten. Deze aanpak biedt snelle, reproduceerbare resultaten voor metabolietanalyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd financieel ondersteund door de Fundamental Research Funds for the Central Universities (KJQN202060), de National Natural Science Foundation of China (31900907), de Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190528), het International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (CRP/CHN20-04_EC) tot M.C., en de Fundamental Research Funds for the Central Universities (LGZD202004).

1 De groei van de installatie en materialeninzameling
<ol><li>Zorg ervoor dat Arabidopsis zaden gedurende 10 minuten worden gesteriliseerd in 70% ethanol en worden gezaaid op de agarplaten, die werden bereid met murashige- en Skoog-voedingsstoffen van halve sterkte.</li>
	<li>Incubeer de platen met Arabidopsis-zaden gedurende 48 uur onder donker bij 4 °C en breng ze vervolgens over in een gecontroleerde groeikamer onder 16 uur licht van 55 μmol m-2 s-1 bij 22 °C en 8 uur donker bij 20 °C.</li>
	<li>Oogst 100 mg zaailingen van 2 weken (vers gewicht) en vries in vloeibare stikstof voor metabolietextractie. LET OP: Onderzoekers moeten op de juiste manier handschoenen, een beschermende bril en een laboratoriumjas dragen om besmetting van menselijk weefsel tijdens het verzamelen van materialen te voorkomen.</li>
</ol>2 Nucleosiden/Nucleotiden extractie
<ol><li>Gemalen 100 mg bevroren plantenweefsels met 7-8 stalen kralen in een voorverkoude mengmolen gedurende 5 minuten met een frequentie van 60 Hz.</li>
	<li>Bereid de extractieoplossing, die methanol, acetonitril en water bevat in een verhouding van 2:2:1.</li>
	<li>Resuspendeer de gehomogeniseerde materialen (inclusief de meeste metabolieten maar geen eiwitten) met 1 ml extractieoplossing.</li>
	<li>Centrifugeer de resulterende oplossing bij 12.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C.</li>
	<li>Breng 0,5 ml van de suspensie over naar een nieuwe buis van 1,5 ml en vries de vloeibare stikstof in.</li>
	<li>Verdampt het bevroren monster in een vrieskleurstof en resuspend in 0,1 ml 5% acetonitril en 95% water.</li>
	<li>Centrifugeer de resulterende oplossing (0,1 ml) bij 40.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Plaats het supernatant in een flacon voor LC-MS/MS-meting.</li>
</ol>3 LC-MS/MS meting
<ol><li>Bereid een ammoniumacetaatbuffer van 10 mM door 1,1 g ammoniumacetaat op te lossen in 2 L dubbel gedeioneerd water (mobiele fase A). Stel de pH in op 9,5 bij 10% ammonium- en acetaatzuur.</li>
	<li>Bereid 2 L ultrapure 100% methanol (mobiele fase B1) voor op nucleosidenmeting. Bereid ook 2 L ultrapure 100% acetonitril (mobiele fase B2) voor voor nucleotidenmeting.</li>
	<li>Injecteer 0,02 ml voorbehandelde metabolietenextractie van elk monster uit stap 2.7 in een HPLC-systeem met binaire pompen (LC) in combinatie met een drievoudige viervoudige massaspectrometer (MS). LET OP: HPLC-systeem maakt gebruik van een C18-kolom (50 x 4,6 mm, deeltjesgrootte 5 μm; werken bij 25 °C) buffering met mobiele fase A en B1 (Figuur 1A) voor de nucleosidenscheiding en gebruikt een poreuze grafitische koolstofkolom (PGC) (50 x 4,6 mm, deeltjesgrootte 5 μm; werken bij25°C) met mobiele fase A en B2. Elk monster werd drie keer geïnjecteerd voor de technische replicatie.</li>
	<li>Programmeer de methode zoals weergegeven in tabel 1 voor de kolom C18 en de methode zoals weergegeven in tabel 2 voor de pgc-kolom. Stel een debiet in van 0,65 ml min-1. OPMERKING: De massaovergangen (tabel 3) werden gecontroleerd door massaspectrometer. De massaspectrumanalyseomstandigheden van acht nucleosiden en vijf nucleotiden die canonieke en gewijzigde nucleotiden bevatten , zijn opgenomen in tabel 3.</li>
	<li>Noteer de piekgebieden van elke doelverbinding (figuur 1).</li>
</ol>4 Generatie van de standaard kalibratiecurven
<ol><li>Pool zes monsterextracties samen, die werden geproduceerd volgens de beschrijving in sectie 2, en vortex het. Voer het vervolgens opnieuw naar zes extracties (hetzelfde volume) om elke achtergrond te krijgen.</li>
	<li>Voeg zes verschillende concentraties van elke norm toe aan deze zes extracties en injecteer ze één voor één na stap 3.3.</li>
	<li>Registreer de piekgebieden van elke norm in verschillende concentraties via de massaovergangen zoals beschreven in stap 3.4 en 3.5.</li>
	<li>Zet het piekgebied af tegen de nominale concentratie van elke norm om een zespuntscurve te genereren. OPMERKING: De piekgebieden van nucleosiden/nucleotiden die in stap 3.5 zijn geregistreerd, moeten binnen het bereik van de standaardkalibratiecurven vallen.</li>
	<li>Bereken de vergelijking van een rechte lijn voor elke standaardverbinding: Y = aX + b</li>
</ol>5 Kwantificering van metabolieten
<ol><li>Bereken de inhoud van de metabolieten met behulp van het piekgebied dat is geregistreerd in stap 3.5 en de vergelijking uit stap 4.5.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -P., Großhans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+link+between+deoxyribonucleotide+metabolites+and+embryonic+cell-cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control.</a> Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).</li>
<li>Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrimidine+and+purine+biosynthesis+and+degradation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).</li>
<li>Witte, C. -P., Herde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+metabolism+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide metabolism in plants.</a> Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).</li>
<li>Chen, M., Herde, M., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+the+nine+cytidine+deaminase-like+genes+in+Arabidopsis%2C+eight+are+pseudogenes+and+only+one+is+required+to+maintain+pyrimidine+homeostasis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo.</a> Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((m6A+RNA+degradation+products+are+catabolized+by+an+evolutionarily+conserved+N6-methyl-AMP+deaminase+in+plant+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells.</a> The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).</li>
<li>Chen, M., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinase+and+a+glycosylase+catabolize+pseudouridine+in+the+peroxisome+to+prevent+toxic+pseudouridine+monophosphate+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation.</a> The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).</li>
<li>Dahncke, K., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+purine+nucleoside+catabolism+employs+a+guanosine+deaminase+required+for+the+generation+of+xanthosine+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 25 (10), (2013).</li>
<li>Jung, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uridine-ribohydrolase+is+a+key+regulator+in+the+uridine+degradation+pathway+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).</li>
<li>Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+nucleoside+hydrolases+involved+in+intracellular+and+extracellular+degradation+of+purines%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines.</a> Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).</li>
<li>Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+thaliana+nucleosidase+mutants+provide+new+insights+into+nucleoside+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation.</a> New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).</li>
<li>Zrenner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+analysis+of+the+pyrimidine+catabolic+pathway+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis.</a> New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).</li>
<li>Hauck, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uric+acid+accumulation+in+an+Arabidopsis+urate+oxidase+mutant+impairs+seedling+establishment+by+blocking+peroxisome+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance.</a> The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).</li>
<li>Qu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+nucleosides%2C+nucleobases%2C+and+amino+acids+in+different+parts+of+Angelicae+Sinensis+Radix+by+ultra+high+performance+liquid+chromatography+coupled+to+triple+quadrupole+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry.</a> Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).</li>
<li>Zong, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+simultaneous+determination+of+13+nucleosides+and+nucleobases+in+Cordyceps+sinensis+by+UHPLC-ESI-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS.</a> Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).</li>
<li>Moravcová, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+nucleobases%2C+nucleosides%2C+and+nucleotides+using+two+zwitterionic+silica-based+monolithic+capillary+columns+coupled+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).</li>
<li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+ultra-high+performance+liquid+chromatography+coupled+with+triple+quadrupole+mass+spectrometry+for+determination+of+nucleotides%2C+nucleosides+and+nucleobases+in+Ziziphus+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants.</a> Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).</li>
<li>Seifar, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+free+nucleotides+in+complex+biological+samples+using+ion+pair+reversed+phase+liquid+chromatography+isotope+dilution+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).</li>
<li>Baccolini, C., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP+and+GMP+catabolism+in+Arabidopsis+converge+on+xanthosine%2C+which+is+degraded+by+a+nucleoside+hydrolase+heterocomplex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex.</a> The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling te onthullen.

Organismen bevatten verschillende nucleosiden/nucleotiden, waaronder canonieke en afwijkende. De oorsprong en metabolische eindpunten ervan, vooral gemodificeerde nucleosiden, zijn echter nog steeds onduidelijk. Bovendien moet het huidige begrip van de functie en homeostase van het metabolisme van nucleosiden/nucleotiden nog worden onderzocht en uitgebreid. Om ze te onderzoeken, moet een nauwkeurige en gouden standaardmethode voor de identificatie en kwantificering van deze metabolieten worden gebruikt. Hier beschreven w...

Nucleosiden/Nucleotiden zijn centrale metabolische componenten in alle levende organismen, die de voorlopers zijn van nucleïnezuren en veel co-enzymen, zoals nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), en belangrijk bij de synthese van macromoleculen zoals fosfolipiden, glycolipiden en polysachariden. Structureel bevat nucleoside een nucleobase, die een adenine, guanine, uracil, cytosine of thymine kan zijn, en een suikeremoiety, die een ribose of een deoxyribose1,2kan zijn . Nucleotiden hebben maximaal drie fosfaatgroepen die zich binden aan de 5-koolstofpositie van de suikermoiety van de nucleosiden3. Het metabolisme van nucleotiden in planten is essentieel voor zaadkieming en bladgroei4,5,6. Om hun fysiologische rol in de ontwikkeling van planten beter te begrijpen, moeten de methoden voor de absolute kwantificering van verschillende nucleosiden/nucleotiden in vivo worden vastgesteld.
Een van de meest gebruikte benaderingen voor het meten van nucleosiden/nucleotiden maakt gebruik van een hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) in combinatie met een ultraviolet-zichtbare (UV-VIS) detector4,7,8,9,10,11. In 2013 kwantificeerden Dahncke en Witte met behulp van HPLC verschillende soorten nucleosiden in Arabidopsis thaliana7. Ze identificeerden een verhoogd guanosinegehalte in een T-DNA insertie mutant gericht op het guanosine deaminase gen in vergelijking met de wilde plant. Een andere pyrimidine nucleoside, cytidine, werd ook kwantitatief gedetecteerd in planten die deze methode gebruikten, wat resulteerde in de identificatie van een bonafide cytidine-deaminasegen4. Op basis van de UV-detector kan deze methode echter niet gemakkelijk de nucleosiden onderscheiden die vergelijkbare spectrums en retentietijden hebben, bijvoorbeeld guanosine of xanthosine. De detectielimiet van de HPLC-methode is relatief hoog en wordt daarom vaak gebruikt voor het meten van een hoog gehalte aan nucleosiden in vivo, zoals cytidine, uridine en guanosine.
Daarnaast kan gaschromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (GC-MS) ook worden gebruikt bij nucleosidemeting. Profiteer ervan, Hauck et. al. met succes uridine en urinezuur, een downstream metaboliet van nucleoside katabole route, in de zaden van A. thaliana12. GC wordt echter normaal gesproken gebruikt om vluchtige stoffen te scheiden, maar is niet geschikt voor de thermisch labiele stoffen. Daarom is een vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (LC-MS/MS) waarschijnlijk een meer geschikte en nauwkeurige analysetechniek voor de in vivo identificatie, scheiding en kwantificering van de nucleosiden/nucleotiden13,14. Verschillende eerdere studies meldden dat een HILIC-kolom kan worden gebruikt voor nucleosiden en nucleotidenscheiding15,16 en isotopisch gelabelde interne normen werden gebruikt voor de samengestelde kwantificering17. Beide componenten zijn echter relatief duur, vooral de commerciële normen met isotooplabel. Hier rapporteren we een economisch toepasbare LC-MS/MS-benadering voor nucleosiden/nucleotidenmeting. Deze methode is al met succes gebruikt voor de kwantificering van diverse nucleosiden/nucleotiden, waaronder ATP, N6-methyl-AMP, AMP, GMP, uridine, cytidine en pseudouridine1,5,6,18, in planten en Drosophila. Bovendien kan de methode die we hier rapporteren ook in andere organismen worden gebruikt.

<table><tbody><tr><td>acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1000291000</td><td></td></tr><tr><td>adenosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9251-1G</td><td></td></tr><tr><td>ammonium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73594-100G-F</td><td></td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01930-5G</td><td></td></tr><tr><td>CMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1006-500MG</td><td></td></tr><tr><td>cytidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C122106-1G</td><td></td></tr><tr><td>GMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8377-500MG</td><td></td></tr><tr><td>guanosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6752-1G</td><td></td></tr><tr><td>Hypercarb column</td><td>Thermo Fisher Scientific GmbH</td><td>35005-054630</td><td></td></tr><tr><td>IMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57510-5G</td><td></td></tr><tr><td>inosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4125-1G</td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>N1-methyladenosine</td><td>Carbosynth</td><td>NM03697</td><td></td></tr><tr><td>O6-methylguanosine</td><td>Carbosynth</td><td>NM02922</td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Medium</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0255.005</td><td></td></tr><tr><td>Polaris 5 C18A column</td><td>Agilent Technologies</td><td>A2000050X046</td><td></td></tr><tr><td>pseudouridine</td><td>Carbosynth</td><td>NP11297</td><td></td></tr><tr><td>UMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6375-1G</td><td></td></tr><tr><td>uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

plantmonstervoorbereiding voor nucleoside/nucleotide-inhoudsmeting met een hplc-ms/ms

Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

Nucleosiden/nucleotiden zijn bouwstenen van nucleïnezuren, delen van cosubstraten en co-enzymen, celsignaleringsmoleculen en energiedragers, die betrokken zijn bij veel celactiviteiten. Hier beschrijven we een snelle en betrouwbare methode voor de absolute kwalificatie van nucleoside/nucleotidegehalte in planten. Kortom, 100 mg gehomogeniseerd plantaardig materiaal werd geëxtraheerd met 1 ml extractiebuffer (methanol, acetonitril en water in een verhouding van 2:2:1). Later werd het monster vijf keer geconcentreerd in een vriesdroger en vervolgens geïnjecteerd in een HPLC-MS/MS. Nucleotiden werden gescheiden op een poreuze grafitische koolstofkolom (PGC) en nucleosiden werden gescheiden op een C18-kolom. De massaovergangen van elke nucleoside en nucleotide werden gecontroleerd door massaspectrometrie. De inhoud van de nucleosiden en nucleotiden werd gekwantificeerd aan de hand van hun externe normen (ESTD's). Met deze methode kunnen onderzoekers daarom nucleosiden/nucleotiden in verschillende planten eenvoudig kwantificeren.

Hier tonen we de identificatie en kwantificering van N1-methyladenosine, een bekende gemodificeerde nucleoside, in 2 weken oude Arabidopsis wild type (Col-0) zaailingen als voorbeeld. Massaspectrometrieprofiel geeft aan dat de productionen die worden gegenereerd uit de N1-methyladenosinestandaard 150 m/z en 133 m/z (figuur 2A) zijn, en hetzelfde profiel wordt ook waargenomen bij Col-0-extractie (figuur 2B</s...

Een nauwkeurige en reproduceerbare methode voor in vivo nucleosiden/nucleotiden kwantificering in planten wordt hier beschreven. Deze methode maakt gebruik van een HPLC-MS/MS.

Plantmonstervoorbereiding voor nucleoside/nucleotide-inhoudsmeting met een HPLC-MS/MS

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which ...

Nucleosiden en nucleotiden zijn centrale metabolische componenten in alle levende organismen. Het metabolisme van hen is nodig voor de ontwikkeling van cellen. Deze aanpak biedt een krachtig instrument voor de kwantificering van deze metabolieten.Deze methode maakt een snelle en nauwkeurige kwantificering van nucleosiden en nucleotiden in planten mogelijk. Volledige monstervoorbehandelingen en LC-MS/MS-analyses duren ongeveer twee dagen voor een set van 10 tot 20 monsters. Deze methode kan worden toegepast op alle planten en zelfs andere organismen.De demonstranten van de procedure zijn Changhua Zhu, een universitair hoofddocent van het Chen Laboratorium. Om de planten te laten groeien, moet u ervoor zorgen dat Arabidopsis zaden gedurende 10 minuten worden gesteriliseerd in 70% ethanol en worden gezaaid op agarplaten met 1/2 sterkte Murashige en Skoog voedingsstoffen. Incubeer de platen in het donker bij vier graden Celsius gedurende 48 uur en breng ze vervolgens over naar een gecontroleerde groeikamer onder 16 uur licht bij 22 graden Celsius en acht uur donker bij 20 graden Celsius.Oogst 100 milligram zaailingen van twee weken en vries ze in vloeibare stikstof voor metabolietextractie. Maal 100 milligram bevroren plantenweefsels met zeven tot acht stalen kralen in een voorgekoelde mengmolen gedurende vijf minuten met een frequentie van 60 Hertz. Bereid de extractieoplossing, die methanol, acetonitril en water bevat, voor in een verhouding van twee tot twee tegen één.Resuspendeer de gehomogeniseerde materialen met één milliliter van de extractieoplossing. Centrifugeer de resulterende oplossing bij 12.000 XG gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius, breng vervolgens 0,5 milliliter van de suspensie over naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter en vries deze in vloeibare stikstof in. Verdampt het bevroren monster in een vriesdroger en resuspendeer het in 0,5 milliliter 5%acetonitril en 95% water.Centrifugeer de resulterende oplossing bij 4.000 XG gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Plaats het supernatant in een flacon voor LC-MS/MS-meting. Bereid een ammoniumacetaatbuffer van 10 millimolar door 1,5 gram ammoniumacetaat op te lossen in twee liter dubbel gedeioneerd water.Stel de pH in op 9,5 met 10% ammonium- en acetaatzuur. Bereid twee liter ultrapure 100% methanol voor nucleosidenmeting en bereid vervolgens twee liter ultrapure acetonitril voor op nucleotidenmeting. Injecteer 0,02 milliliter van de voorbehandelde metabolietextractie van elk eerder bereid monster in een HPLC-systeem met binaire pompen in combinatie met een drievoudige viervoudige massaspectrometer.Om de standaard kalibratiecurven te genereren, bundelt u zes monsterextracties samen en vortext u het mengsel en voert u het vervolgens opnieuw naar zes extracties om elke achtergrond te verkrijgen. Voeg zes verschillende concentraties van elke standaard toe aan deze zes extracties en injecteer ze één voor één in het HPLC-systeem. Registreer de piekgebieden van elke norm in verschillende concentraties via de massaovergangen.Dit protocol werd gebruikt om N1-methyladenosine, een bekende gemodificeerde nucleoside, te identificeren en te kwantificeren in twee weken oude Arabidopsis wild-type zaailingen. Het massaspectrometrieprofiel gaf aan dat de productionen die uit de N1-methyladenosinestandaard worden gegenereerd, een verhouding van 150 en 133 MZ hebben. En hetzelfde profiel werd waargenomen in de Colombia zero extractie.Vanwege de hoge overvloed van het production van 150 MZ werd de massaovergang van 282,1 tot 150 geselecteerd voor de N1-methyladenosine-identificatie. De retentietijd van de doelpiek was 7,05 minuten. Hetzelfde als de retentietijd van N1-methyladenosine standaard.Een concentratiereeks van N1-methyladenosinenormen werd toegevoegd aan zes monsterextracties. De standaardmonsters werden in de LC-MS/MS geïnjecteerd en de verhoogde piekgebieden van N1-methyladenosine werden uitgezet tegen de nominale concentraties van de normen. De zes gelijke achtergrondextracties zijn belangrijk voor het maken van een nauwkeurige en herhaalbare kalibratiecurve voor de kwantificering.Onze methode kan worden toegepast om metabolische routes in planten te verkennen. Door de metabolietprofielen tussen mutanten van het wildtype en mutanten met verlies van functie te vergelijken, kan de metabolische flux worden getrokken.

plant-sample-preparation-for-nucleosidenucleotide-content-measurement

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Radicaal gebaseerde biomimetische chemie werd toegepast op opbouw libraries nodig biomarkerontwikkeling.

Free Radicals in Chemical Biology: van chemische gedrag tot Biomarker Development

De hierin beschreven protocol heeft tot doel uit te leggen en verkorten de vele obstakels in de weg van de ingewikkelde route die leidt tot gewijzigde nucleosidetrifosfaten. Bijgevolg Dit protocol maakt zowel de synthese van deze geactiveerde bouwstenen en hun beschikbaarheid voor praktische toepassingen.

Nucleosidetrifosfaten - Van Synthese tot biochemische karakterisering

Plantaardige biomassa biedt een hernieuwbare grondstof voor meerdere producten, waaronder brandstof, diervoeders, levensmiddelen en een verscheidenheid aan materialen. In deze paper onderzoeken we de eigenschappen van de boom tabak (Nicotiana glauca) en populier als geschikte bronnen voor een bioraffinage pijplijn.

Transcript en Metabolite Profiling voor de Evaluatie van de Boom en Poplar Tabak als grondstof voor de bio-gebaseerde industrie

Het hier beschreven protocol vertegenwoordigt een eenvoudige en reproduceerbare methode die gebruik maakt van omgekeerde fase hoge-prestatievloeistofchromatografie (RP-HPLC) om het purine metabolisme te meten op cellen van chronische lymfatische leukemie (CLL) die onder verschillende omstandigheden zijn gekweekt.

-HPLC gebaseerde test voor Monitor extracellulaire Nucleotide / Nucleoside Metabolism in Human Chronische Lymfatische Leukemie Cellen

We beschrijven een protocol te identificeren van RNA-bindende proteÃ¯nen en kaart van de regio's hun RNA-bindende in levende cellen met behulp van UV-gemedieerde photocrosslinking en massaspectrometrie.

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Wij beschreven twee chemische-gebaseerde protocollen voor het kweken van muis embryonale stamcellen in detail. Deze nieuwe methode maakt gebruik van synergetische mechanismen ter bevordering van Tet-gemedieerde oxidatie (door vitamine C) en onderdrukken van DOVO synthese van 5-methylcytosine (door PD0325901) om DNA hypomethylation en pluripotent van muis embryonale stamcellen te onderhouden.

Een alternatieve cultuur methode om Genomic Hypomethylation van muis embryonale stamcellen met MEK-remmer PD0325901 en vitamine C

Hier presenteren we een protocol voor een efficiënte Macrostap zuivering van de actieve niet-gelabelde mens tien-elf translocatie-2 (TET2) 5-methylcytosine-dioxygenase met behulp van ionenwisselingschromatografie- en haar kwantitatieve analyse met behulp van een vloeibare chromatografie-tandem-massa spectrometrie (LC-MS/MS)-gebaseerde aanpak.

Efficiënte reiniging en LC-MS/MS-based Assay ontwikkeling voor tien-elf translocatie-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

We beschrijven hier methoden voor gevoelige en accurate kwantificering van de laesies 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1, n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1, n6-dAdo) en 1,n2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. De methoden werden toegepast op de beoordeling van de effecten van de omgevings fijn stof (PM2,5) in weefsels (Long, lever en nier) van blootgestelde A/J muizen.

Kwantificering van drie DNA-laesies door massaspectrometrie en beoordeling van de niveaus in weefsels van muizen die worden blootgesteld aan omgevings fijne deeltjes

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor een LC-MS-gebaseerde sequencingmethode die kan worden gebruikt als een directe methode om kort RNA (&lt;35 nt per run) te sequencen zonder een cDNA-tussenproduct, en als een algemene methode om verschillende nucleotidemodificaties te sequencen in een enkele studie met precisie op één base.

2D-HELS MS Seq: Een algemene LC-MS-gebaseerde methode voor directe en de novo sequencing van RNA-mengsels met verschillende nucleotidemodificaties

In dit protocol presenteren we een geoptimaliseerde workflow, die een efficiënte en snelle monstervoorbereiding van veel monsters combineert. Daarnaast bieden we een stapsgewijze handleiding om analytische variaties te verminderen voor high-throughput evaluatie van metabole GWAS-studies.

Grootschalige multi-omics Genome-wide Association Studies (Mo-GWAS): richtlijnen voor monstervoorbereiding en normalisatie

Post-transcriptionele modificaties van RNA vertegenwoordigen een onderbelichte laag van translatieregulatie die onlangs is gekoppeld aan de plasticiteit van het centrale zenuwstelsel. Hier wordt de monstervoorbereiding en vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometriebenadering beschreven voor gelijktijdige karakterisering van talrijke RNA-modificaties in afzonderlijke neuronen.

Karakterisering van RNA-modificaties in enkele neuronen met behulp van massaspectrometrie

Leer een nauwkeurige HPLC-MS/MS-methode voor kwantificering van nucleosiden en nucleotiden in planten. Deze aanpak biedt snelle, reproduceerbare resultaten voor metabolietanalyse.

Plantmonstervoorbereiding voor nucleoside/nucleotide-inhoudsmeting met een HPLC-MS/MS

Meer video's verkennen