Plantmonstervoorbereiding voor nucleoside/nucleotide-inhoudsmeting met een HPLC-MS/MS

Nucleosiden en nucleotiden zijn centrale metabolische componenten in alle levende organismen. Het metabolisme van hen is nodig voor de ontwikkeling van cellen. Deze aanpak biedt een krachtig instrument voor de kwantificering van deze metabolieten.

Deze methode maakt een snelle en nauwkeurige kwantificering van nucleosiden en nucleotiden in planten mogelijk. Volledige monstervoorbehandelingen en LC-MS/MS-analyses duren ongeveer twee dagen voor een set van 10 tot 20 monsters. Deze methode kan worden toegepast op alle planten en zelfs andere organismen.

De demonstranten van de procedure zijn Changhua Zhu, een universitair hoofddocent van het Chen Laboratorium. Om de planten te laten groeien, moet u ervoor zorgen dat Arabidopsis zaden gedurende 10 minuten worden gesteriliseerd in 70% ethanol en worden gezaaid op agarplaten met 1/2 sterkte Murashige en Skoog voedingsstoffen. Incubeer de platen in het donker bij vier graden Celsius gedurende 48 uur en breng ze vervolgens over naar een gecontroleerde groeikamer onder 16 uur licht bij 22 graden Celsius en acht uur donker bij 20 graden Celsius.

Oogst 100 milligram zaailingen van twee weken en vries ze in vloeibare stikstof voor metabolietextractie. Maal 100 milligram bevroren plantenweefsels met zeven tot acht stalen kralen in een voorgekoelde mengmolen gedurende vijf minuten met een frequentie van 60 Hertz. Bereid de extractieoplossing, die methanol, acetonitril en water bevat, voor in een verhouding van twee tot twee tegen één.

Resuspendeer de gehomogeniseerde materialen met één milliliter van de extractieoplossing. Centrifugeer de resulterende oplossing bij 12.000 XG gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius, breng vervolgens 0,5 milliliter van de suspensie over naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter en vries deze in vloeibare stikstof in. Verdampt het bevroren monster in een vriesdroger en resuspendeer het in 0,5 milliliter 5%acetonitril en 95% water.

Centrifugeer de resulterende oplossing bij 4.000 XG gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Plaats het supernatant in een flacon voor LC-MS/MS-meting. Bereid een ammoniumacetaatbuffer van 10 millimolar door 1,5 gram ammoniumacetaat op te lossen in twee liter dubbel gedeioneerd water.

Stel de pH in op 9,5 met 10% ammonium- en acetaatzuur. Bereid twee liter ultrapure 100% methanol voor nucleosidenmeting en bereid vervolgens twee liter ultrapure acetonitril voor op nucleotidenmeting. Injecteer 0,02 milliliter van de voorbehandelde metabolietextractie van elk eerder bereid monster in een HPLC-systeem met binaire pompen in combinatie met een drievoudige viervoudige massaspectrometer.

Om de standaard kalibratiecurven te genereren, bundelt u zes monsterextracties samen en vortext u het mengsel en voert u het vervolgens opnieuw naar zes extracties om elke achtergrond te verkrijgen. Voeg zes verschillende concentraties van elke standaard toe aan deze zes extracties en injecteer ze één voor één in het HPLC-systeem. Registreer de piekgebieden van elke norm in verschillende concentraties via de massaovergangen.

Dit protocol werd gebruikt om N1-methyladenosine, een bekende gemodificeerde nucleoside, te identificeren en te kwantificeren in twee weken oude Arabidopsis wild-type zaailingen. Het massaspectrometrieprofiel gaf aan dat de productionen die uit de N1-methyladenosinestandaard worden gegenereerd, een verhouding van 150 en 133 MZ hebben. En hetzelfde profiel werd waargenomen in de Colombia zero extractie.

Vanwege de hoge overvloed van het production van 150 MZ werd de massaovergang van 282,1 tot 150 geselecteerd voor de N1-methyladenosine-identificatie. De retentietijd van de doelpiek was 7,05 minuten. Hetzelfde als de retentietijd van N1-methyladenosine standaard.

Een concentratiereeks van N1-methyladenosinenormen werd toegevoegd aan zes monsterextracties. De standaardmonsters werden in de LC-MS/MS geïnjecteerd en de verhoogde piekgebieden van N1-methyladenosine werden uitgezet tegen de nominale concentraties van de normen. De zes gelijke achtergrondextracties zijn belangrijk voor het maken van een nauwkeurige en herhaalbare kalibratiecurve voor de kwantificering.

Onze methode kan worden toegepast om metabolische routes in planten te verkennen. Door de metabolietprofielen tussen mutanten van het wildtype en mutanten met verlies van functie te vergelijken, kan de metabolische flux worden getrokken.