Name: Isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca2+ transiënten en L-type calciumstroom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Leer de isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire cardiomyocyten via retrograde Langendorff-perfusie. Dit protocol maakt gelijktijdige meting van Ca²⁺-transiënten en L-type calciumstroom mogelijk voor onderzoek naar hartritmestoornissen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de German Research Foundation (DFG; Clinician Scientist Program In Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 aan P. Tomsits en D. Schüttler; VO1568/3-1, IRTG1816 en SFB1002 project A13 tot N. Voigt), German Research Foundation under Germany's Excellence Strategy (EXC 2067/1- 390729940 to N. Voigt), German Centre for Cardiovascular Research (DZHK; 81X2600255 to S. Clauss and N. Voigt; 81Z0600206 to S. Kääb), the Corona Foundation (S199/10079/2019 to S. Clauss), the ERA-NET on Cardiovascular Diseases (ERA-CVD; 01KL1910 to S. Clauss), de Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (naar S. Clauss) en de Else-Kröner-Fresenius Stichting (EKFS 2016_A20 naar N. Voigt). De financiers hadden geen rol in de voorbereiding van het manuscript.

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Nedersaksische Animal Review Board (LAVES, AZ-18/2900) en werden uitgevoerd in overeenstemming met alle institutionele, nationale en internationale richtlijnen voor dierenwelzijn.
1. Voorregelingen
<ol><li>Bereid 1 l 10x perfusiebuffer (tabel 1), 500 ml 1x perfusiebuffer (tabel 2), 50 ml verteringsbuffer (tabel 3), 10 ml stopbuffer (tabel 4), 1 l Tyrode-oplossing (tabel 5), 10 ml van elke calciumstapoplossing (Tyrode-oplossing met glucose en respectieve hoeveelheid calcium zoals aangegeven), 1 l 4-AP-oplossing (tabel 5), 100 ml pipetoplossing (tabel 6) en 5 ml pluronzuur volgens de verstrekte recepten. OPMERKING: Badoplossingen (Tyrode en 4-AP-oplossing) kunnen van tevoren worden bereid (zonder glucose) en worden bewaard bij +4 °C, glucose wordt toegevoegd op de experimentele dag. Pipetoplossing kan worden bewaard bij -20 °C, calciumindicator wordt toegevoegd op de experimentele dag en oplossing wordt vervolgens op ijs bewaard tot verder gebruik. 10x perfusiebuffer kan bij kamertemperatuur worden bewaard, 1x perfusiebuffer, digestiebuffer en stopbuffer moeten op experimentele dag vers worden bereid.</li>
	<li>Zet het waterbad en de rollenpomp aan.</li>
	<li>Voorvulling Langendorff apparaat met perfusiebuffer; Zorg ervoor dat het luchtvrij is.</li>
	<li>Bereid de aortacanule voor door deze onder de dissectiemicroscoop te fixeren, maak verbinding met een spuit van 1 ml gevuld met perfusiebuffer en heldere lucht door de canule te spoelen. OPMERKING: Het is van cruciaal belang om lucht in het perfusiesysteem te vermijden, omdat dit direct van invloed is op de coronaire perfusie en dus de effectiviteit van de spijsvertering. Indien nodig kan een bellenvanger aan de opstelling worden toegevoegd om veilig luchtinsluiting te voorkomen.</li>
	<li>Bereid petrischalen met voldoende perfusiebuffer voor orgaanverzameling en microscopie (buffer moet het hele orgaan stevig bedekken, een paar milliliter - afhankelijk van de gebruikte petrischaalgrootte - zou voldoende moeten zijn).</li>
	<li>Bereid 3 petrischalen met spijsverteringsbuffer voor weefseldissociatie en microscopie, buffer moet het orgaan bedekken voor dissectie onder de microscoop in de respectieve petrischaal, hoeveelheid is afhankelijk van de gebruikte petrischaalgrootte. Gebruik voor de dissociatie 3 ml voor ventrikelweefsel en 1,5 ml voor boezemweefsel.</li>
</ol>2. Orgaanoogst
<ol><li>Injecteer de muis met 0,1 ml heparine (1.000 E/ml) i.p. met behulp van een spuit van 1 ml met een canule van 27 G en wacht 5-10 min.</li>
	<li>Plaats de muis in een inductiekamer samen met een klein weefsel gedrenkt in ongeveer 500 μL isofluraan. Het dier mag niet in contact komen met het weefsel. Om dat te voorkomen, kan men een plastic biopsie-inbeddingscassette gebruiken om het weefsel te bedekken. Zodra het dier volledig is verdoofd, controleert u op teenknijpreflex en zodra het niet meer aanwezig is, euthanaseert u de muis snel door cervicale dislocatie.</li>
	<li>Plaats de muis op een platform op zijn rug (bijvoorbeeld op piepschuim bedekt met een papieren handdoek) en bevestig de poten met canules om hem op zijn plaats te houden.</li>
	<li>Verwijder vacht en huid die de borst en een deel van de buik bedekken met een duidelijke snee van jugulum naar symfyse en open de buik direct onder de xiphoid zonder de orgaanstructuur te verwonden met een schaar. Til het borstbeen op met een chirurgische tang en knip het diafragma met een schaar langs de rand van de ribben, knip vervolgens de ribben in de mediale oksellijn en verwijder de ribbenkast om het hart bloot te leggen.</li>
	<li>Verwijder het hartzakje voorzichtig met een stompe tang en verwijder snel het hart door het met een stompe tang van onderaf op te tillen en door de grote vaten met één enkele snede met een schaar te knippen.</li>
	<li>Breng het hart in de perfusiebuffer op kamertemperatuur en kannuleer de aorta met een stompe eindnaald zo snel mogelijk onder de microscoop. OPMERKING: Verwijder al het longweefsel en vetweefsel dat aan het orgaan is bevestigd zonder er te veel tijd aan te verliezen. Zorg er tijdens het cannuleren voor dat het uiteinde van de naald niet door de aortaklep loopt, omdat dit de resultaten zal schaden door te voorkomen dat buffers de kransslagaders binnendringen.</li>
	<li>Bind het hart met een stuk hechtzijde stevig vast aan de naald en maak de verbinding los van de spuit. OPMERKING: De hele procedure vanaf het verkrijgen van het hart (het moment waarop de grote bloedvaten worden doorgesneden) tot het hechten van de aorta aan de naald moet zo min mogelijk tijd in beslag nemen. Het wordt aanbevolen om niet langer dan 90-180 s te nemen vanaf het verwijderen van het hart tot het begin van de perfusie.</li>
</ol>3. Enzymatische spijsvertering
<ol><li>Sluit na aortacannulatie onmiddellijk het gecannuleerde hart aan op het Langendorff-apparaat, zodat er geen lucht in het systeem komt. OPMERKING: Het kan helpen om een hangende druppel perfusiebuffer aan de onderkant van het Langendorff-apparaat te hebben, evenals een druppel perfusiebuffer op de bovenkant van de naald om te voorkomen dat er lucht in het systeem komt.</li>
	<li>Perfuseer het hart met perfusiebuffer gedurende 1 min bij een temperatuur van precies 37 °C en een perfusiesnelheid van precies 4 ml/min. OPMERKING: Om een temperatuur van 37 °C aan de punt van de perfusienaald te hebben, moet de temperatuur van het waterbad iets hoger worden ingesteld op ongeveer 40 °C. Dit moet regelmatig worden getest door de temperatuur aan de perfusiepunt te meten.</li>
	<li>Schakel perfusie over naar verteringsbuffer en perfuseer gedurende precies 9 minuten bij een temperatuur van precies 37 °C en een perfusiesnelheid van precies 4 ml / min.</li>
	<li>Breng het verteerde hart over in een petrischaaltje met voldoende verteringsbuffer om het volledig bedekt te houden. Ontleed vervolgens voorzichtig de boezems en ventrikels onder de microscoop.</li>
	<li>Breng de boezems over in een petrischaaltje met 1,5 ml verteringsbuffer en de ventrikels in een andere petrischaal met 3 ml verteringsbuffer.</li>
	<li>Atriumdissectie<ol><li>Trek voorzichtig, maar zonder tijdverlies, de boezems uit elkaar in kleine stukjes met behulp van een stompe tang.</li>
		<li>Los het weefsel op door voorzichtig op en neer te pipetteren met behulp van een pipetpunt van 1.000 μL, die eerder is gesneden om de tipopening te verbreden.</li>
		<li>Breng de oplossing over in een centrifugebuis van 15 ml en voeg een equivalente hoeveelheid stopbuffer (1,5 ml) toe door voorzichtig aan de zijkant van de buis naar beneden te pipetten om de reactie te beëindigen.</li>
		<li>Laat alle 3 ml cel-/weefseloplossingen voorzichtig door een nylon gaas van 200 μm lopen om resterende grotere weefselstukken te verwijderen die niet volledig zijn verteerd. OPMERKING: Een succesvolle spijsvertering laat bijna geen vaste brokken achter.</li>
	</ol></li>
	<li>Ventriculaire dissectie<ol><li>Hak het ventriculaire weefsel snel in kleine stukjes met behulp van een dissectieschaar en pipet op en neer om op te lossen. Gebruik nog een pipetpunt van 1.000 μL voor het op en neer pipetteren, deze kan worden ingekort om de opening te verbreden.</li>
		<li>Breng cel/weefseloplossing over in een centrifugebuis van 15 ml en voeg een equivalente hoeveelheid stopbuffer (3 ml) toe door voorzichtig aan de zijkant van de buis te pipetten om de reactie te beëindigen.</li>
		<li>Laat voorzichtig alle 6 ml cel/weefsel-oplossing door een 200 μm nylon gaas lopen om grotere weefselstukken te verwijderen die niet volledig zijn verteerd. OPMERKING: Een succesvolle spijsvertering laat bijna geen vaste brokken achter.</li>
	</ol></li>
	<li>Laat beide buizen (atriale en ventriculaire celsuspensie) op de bank bij kamertemperatuur gedurende 6 minuten bezinken.</li>
	<li>Centrifugeer beide buizen van 15 ml op 5 x g gedurende 2 min.</li>
</ol>4. Herintroductie van calcium
OPMERKING: De volgende stappen zijn identiek voor zowel atriale als ventriculaire cellen (tenzij anders vermeld) en worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
<ol><li>Gooi het supernatant weg met een plastic Pasteurpipet en resuspensie pellet voorzichtig in 10 ml calciumvrije Tyrode-oplossing.</li>
	<li>Laat de cellen 8 minuten staan voor bezinking.</li>
	<li>Centrifugeer op 5 x g gedurende 1 min (alleen atriale cellen, sedimentatie is voldoende voor ventriculaire cellen).</li>
	<li>Gooi supernatant weg en resuspendeerde de pellet voorzichtig in 10 ml Tyrode-oplossing met een calciumconcentratie van 100 μM.</li>
	<li>Laat de cellen 8 minuten staan voor bezinking.</li>
	<li>Centrifugeer op 5 x g gedurende 1 min (alleen atriale cellen, sedimentatie is voldoende voor ventriculaire cellen).</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet voorzichtig in 10 ml Tyrode-oplossing met een calciumconcentratie van 400 μM.</li>
	<li>Laat de cellen 8 minuten staan voor bezinking.</li>
	<li>Centrifugeer op 5 x g gedurende 1 min (alleen atriale cellen, sedimentatie is voldoende voor ventriculaire cellen).</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en resuspensie de pellet voorzichtig in 1 ml (atrial) / 5 ml (ventrikel) Tyrode-oplossing met een calciumconcentratie van 1 mM.</li>
</ol>5. Laden van myocyten met fluorescerende calcium-indicator Fluo-3 AM
OPMERKING: Vanwege de lichtgevoeligheid van de fluorescerende calciumindicator moeten de volgende stappen worden uitgevoerd om beschermd te zijn tegen licht (bijvoorbeeld door buizen af te dekken met aluminiumfolie).
<ol><li>Bereid Fluo-3 AM stamoplossing door 44 μL 20% pluronic F-127 in watervrij DMSO toe te voegen aan 50 μg Fluo-3AM (kan worden bewaard bij -20 °C beschermd tegen licht).</li>
	<li>Voeg 10 μL Fluo-3 AM stockoplossing toe aan 1 ml celsuspensie en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.</li>
	<li>Centrifugeer op 5 x g gedurende 1 min.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg met behulp van een plastic Pasteurpipet en resuspensie van de pellet in een redelijke hoeveelheid badoplossing om een goede werkconcentratie te verkrijgen (1-5 ml badoplossing afhankelijk van de celdichtheid).</li>
	<li>Laat 30 minuten staan voor de-esterificatie voordat u begint met experimenten.</li>
</ol>6. Gelijktijdige patch-clamp en epifluorescente Ca2+-transiënte metingen zoals eerder beschreven16
OPMERKING: Patchklemmetingen zijn niet het onderwerp van dit artikel, de geïnteresseerde lezer kan worden verwezen naar belangrijke publicaties met diepgaande beschrijvingen van deze methode 17,18,19,20,21,22. Niettemin, voor een beter algemeen begrip, wordt een samenvatting gegeven van een protocol om L-type calciumstromen samen met de huidige geïnduceerde calciumtransiënten te meten.
<ol><li>Breng myocyten over in een celkamer en superfuse met badoplossing bij 37 °C.</li>
	<li>Blokkeer kaliumstromen door 4-aminopyridine en bariumchloride aan de badoplossing toe te voegen zoals aangegeven in tabel 5.</li>
	<li>Zorg ervoor dat borosilicaatmicro-elektroden een tipweerstand van 2-5 MΩ hebben, gevuld met pipetoplossing (tabel 6).</li>
	<li>Stel metingen in om gelijktijdige registratie van zowel elektrische signalen als epifluorescentie tegelijkertijd mogelijk te maken. De spanningsklemmodus wordt gebruikt om L-type Ca2+-stroom te meten met een protocol dat de cel op -80 mV houdt en een 600 ms ramp-pulse tot -40 mV om de snelle Na+-stroom te inactiveren, gevolgd door een 100 ms testpuls tot +10 mV bij 0,5 Hz (figuur 2).</li>
	<li>Gebruik excitatie bij 488 nm, uitgezonden licht bij <520 nm om te detecteren en om te zetten naar [Ca2+]I uitgaande van <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61964/61964equ01.jpg"> Waarbij kd = dissociatieconstante van Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3 fluorescentie; Fmax = Ca2+-verzadigde fluorescentie verkregen aan het einde van elk experiment19.</li>
</ol>

<ol><li>Camm, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+management+of+atrial+fibrillation%3A+the+Task+force+for+the+management+of+atrial+fibrillation+of+the+European+Society+of+Cardiology+%28ESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Europace%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC).</a> Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).</li>
<li>Chugh, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worldwide+epidemiology+of+atrial+fibrillation%3A+a+global+burden+of+disease+2010+study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a global burden of disease 2010 study.</a> Circulation. 129 (8), 837-847 (2014).</li>
<li>Tonchev, I., Luria, D., Orenstein, D., Lotan, C., Biton, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+whom+the+bell+tolls+%3A+Refining+risk+assessment+for+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cardiology+Reports%22%5BJournal%5D)">For whom the bell tolls : Refining risk assessment for sudden cardiac death.</a> Current Cardiology Reports. 21 (9), 106(2019).</li>
<li>Kirchhof, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2016+ESC+Guidelines+for+the+management+of+atrial+fibrillation+developed+in+collaboration+with+EACTS%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS.</a> European Heart Journal. 37 (38), 2893-2962 (2016).</li>
<li>Dobrev, D., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+antiarrhythmic+drugs+for+treatment+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">New antiarrhythmic drugs for treatment of atrial fibrillation.</a> Lancet. 375 (9721), 1212-1223 (2010).</li>
<li>Heijman, J., Voigt, N., Carlsson, L. G., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+safety+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cardiac safety assays.</a> Current opinion in pharmacology. 15, 16-21 (2014).</li>
<li>Schüttler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Animal models of atrial fibrillation.</a> Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).</li>
<li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+arrhythmia%3A+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li>
<li>Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+isolating+atrial+cells+from+large+mammals+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).</li>
<li>Jansen, H. J., Rose, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+atrial+myocytes+from+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of atrial myocytes from adult mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59588(2019).</li>
<li>Blackwood, E. A., Bilal, A. S., Azizi, K., Sarakki, A., Glembotski, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+isolation+and+culture+of+atrial+myocytes%2C+ventricular+myocytes%2C+and+non-myocytes+from+an+adult+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e61224(2020).</li>
<li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Report%22%5BJournal%5D)">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Report. 6 (9), 13688(2018).</li>
<li>Köhncke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Kv+channel+recordings+in+murine+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50145(2013).</li>
<li>Brandenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+tubule+junctions+activate+atrial+Ca%282%2B%29+release+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Axial tubule junctions activate atrial Ca(2+) release across species.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1227(2018).</li>
<li>Hofhuis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlin+links+excitation-contraction+coupling+to+structure+and+maintenance+of+the+cardiac+transverse-axial+tubule+system%5BTitle%5D)+AND+%22Europace%22%5BJournal%5D)">Dysferlin links excitation-contraction coupling to structure and maintenance of the cardiac transverse-axial tubule system.</a> Europace. 22 (7), 1119-1131 (2020).</li>
<li>Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+atrial+myocytes+for+simultaneous+measurements+of+Ca2%2B+transients+and+membrane+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents.</a> Journal of Visualized Experiment. (77), e50235(2013).</li>
<li>Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-clamp-based+methods+for+the+detection+of+constitutively+active+acetylcholine-gated+I%28K%2CACh%29+channels+in+the+diseased+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated I(K,ACh) channels in the diseased heart.</a> Methods in Enzymology. 484, 653-675 (2010).</li>
<li>Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proarrhythmic+atrial+calcium+cycling+in+the+diseased+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 1175-1191 (2012).</li>
<li>Trafford, A. W., Díaz, M. E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca+buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca+content+in+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 437 (3), 501-503 (1999).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+leak+and+increased+Na%2B-Ca2%2B+exchanger+function+underlie+delayed+afterdepolarizations+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).</li>
<li>Fakuade, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+atrial+cytosolic+calcium+handling+contributes+to+the+development+of+postoperative+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation.</a> Cardiovascular Research. , (2020).</li>
<li>Chen, W., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+inflammatory+and+fibrogenic+pathways+in+heart+failure+associated+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging.</a> Heart Failure Reviews. 15 (5), 415-422 (2010).</li>
<li>Plačkić, J., Kockskämper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes+for+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies.</a> Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).</li>
<li>Díaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+exogenous+calcium+buffers+on+the+systolic+calcium+transient+in+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1915-1925 (2001).</li>
<li>Zimmerman, A. N., Hülsmann, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+influence+of+calcium+ions+on+the+permeability+of+the+cell+membranes+of+the+isolated+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart.</a> Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).</li>
<li>Chen, X., O'Connell, T. D., Xiang, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((With+or+without+Langendorff%3A+A+new+method+for+adult+myocyte+isolation+to+be+tested+with+time%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">With or without Langendorff: A new method for adult myocyte isolation to be tested with time.</a> Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).</li>
<li>Kappadan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+optical+measurement+of+cardiac+restitution%2C+contraction%2C+and+fibrillation+dynamics+in+beating+vs.+blebbistatin-uncoupled+isolated+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 464(2020).</li>
<li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experiment+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experiment in Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li>
<li>Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+optical+action+potential+measurement+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiment%22%5BJournal%5D)">Single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Journal of Visual Experiment. , e61890(2020).</li>
</ol>

Dit artikel biedt een eenvoudige en functionele manier om hoogwaardige atriale en ventriculaire myocyten van dezelfde muis te verkrijgen voor patch-clamp studies met gelijktijdige calcium transiënte opnames. De kwaliteit van de verkregen gegevens is sterk afhankelijk van de kwaliteit van de celisolatie. Zoals hierboven vermeld, zijn veel methoden om muizencardiomyocyten te isoleren eerder beschreven 9,10,11,12.<sup cl...

Hartritmestoornissen komen vaak voor en zijn een van de huidige grote uitdagingen in de gezondheidszorg, omdat ze miljoenen mensen wereldwijd treffen. Aritmieën zijn geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit 1,2 en vormen de onderliggende oorzaak voor de meerderheid van plotselinge hartdoden3. Up-to-date behandelingsopties hebben de overleving van de patiënt verbeterd, maar zijn nog steeds voornamelijk symptomatische behandelingen in plaats van zich te richten op de onderliggende mechanismen. Deze behandelingen hebben dus een beperkte werkzaamheid en kunnen vaak ernstige bijwerkingen veroorzaken 4,5,6. Een verbetering van de huidige behandelingsopties vereist inzicht in de onderliggende pathofysiologie, waardoor de behoefte ontstaat aan geschikte modellen om te bestuderen. Kleine diermodellen - en met name muismodellen - spelen een cruciale rol in aritmieonderzoek omdat ze het mogelijk maken om belangrijke mechanismen van aritmogenese te bestuderen, bijvoorbeeld de genetische impact op cellulaire elektrofysiologie, ionkanaalfunctie of calciumbehandeling 7,8.
Voor dit doel zijn geïsoleerde atriale en ventriculaire cardiomyocyten van voldoende hoeveelheid en levensvatbaarheid vereist. Een breed spectrum van verschillende isolatiebenaderingen om atriale en ventriculaire myocyten te verkrijgen is eerder beschreven 9,10,11,12,13 en sommige groepen hebben gegevens gepresenteerd van gelijktijdige metingen van L-type stroom en calciumstroom geïnduceerde calciumtransiënten van atrium 14 of ventrikel 15 Muriene cardiomyocyten. Voor zover wij weten zijn er echter geen gegevens beschikbaar van zowel atriale als ventriculaire metingen van één dier. Onderzoekers richten zich op een breed scala aan onderwerpen, variërend van elektrofysiologie tot proteomica, functionele studies zoals celcontractiliteit of eiwitinteracties, mitochondriale functie of genetica - allemaal hebben ze behoefte aan geïsoleerde cardiomyocyten. Veel van de gepubliceerde protocollen zijn dus niet specifiek ontwikkeld voor patchklemstudies, wat leidt tot beperkte opbrengsten en onvoldoende celkwaliteit voor patchklemstudies. Gelijktijdige patchklem- en calciumtransiënte metingen van atriale en ventriculaire cellen geïsoleerd van één dier kunnen dus niet worden uitgevoerd met vastgestelde protocollen.
Isolatie van murine - vooral atriale - myocyten voor patchklemexperimenten blijft een uitdaging. Dit artikel biedt een eenvoudige en snelle methode voor de isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten via retrograde enzymgebaseerde Langendorff-perfusie, die vervolgens gelijktijdige metingen van zowel netvliesstroom als stroomgeïnduceerde calciumtransiënten van één dier mogelijk maakt. Dit artikel werkt een protocol uit voor de isolatie van atriale en ventriculaire myocyten afgeleid van wild type muizen en muizen met genetische mutaties. Dit protocol kan worden gebruikt voor zowel mannelijke als vrouwelijke muizen. De myocytenisolatie, afbeeldingen en representatieve resultaten die hieronder worden beschreven, werden verkregen van wilde type C57Bl / 6-muizen op de leeftijd van 6 (± 1) maanden. Niettemin is dit protocol met succes gebruikt voor muizen op verschillende leeftijden, variërend van 2 tot 24 maanden met verschillende genotypen. Figuur 1 toont de isolatieopstelling en een close-up van een gecannuleerd hart tijdens enzymperfusie.

<table><tbody><tr><td>2,3-Butanedione monoxime</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31550</td><td></td></tr><tr><td>27G canule</td><td>Servoprax</td><td>L10220</td><td></td></tr><tr><td>4-Aminopyridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A78403</td><td></td></tr><tr><td>Anhydrous DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Aorta canule</td><td>Radnoti</td><td>130163-20</td><td></td></tr><tr><td>BaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342920</td><td></td></tr><tr><td>blunt chirurgische pincet</td><td>Kent Scientific</td><td>INS650915-4</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Calf Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12133C</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Circulerend verwarmd waterbad</td><td>Julabo</td><td>ME</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II</td><td>Worthington</td><td>LS994177</td><td></td></tr><tr><td>dissectie schaar</td><td>Kent Scientific</td><td>INS600124</td><td></td></tr><tr><td>DL-aspartaat K+-zout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2025</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3</td><td>Invitrogen</td><td>F3715</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1242</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine 5&prime;-trifosfaat tris-zout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingsspiraal</td><td>Radnoti</td><td>158821</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Ratiopharm</td><td>25.000 IE/5ml</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td></td></tr><tr><td>inductiekamer</td><td>CWE incorporated</td><td>13-40020</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Cp-pharma</td><td>1214</td><td></td></tr><tr><td>Geïsoleerde hartkamer</td><td>Radnoti</td><td>130160</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>MgCl x 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 x 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 x 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Nylon gaas (200 &micro;m)</td><td>VWR-Germany</td><td>510-9527</td><td></td></tr><tr><td>pasteurpipet</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z331759</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Thermo Fisher</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic Zuur F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td></td></tr><tr><td>Rollerpomp</td><td>Ismatec</td><td>ISM597D</td><td></td></tr><tr><td>chirurgische pincet</td><td>Kent Scientific</td><td>INS650908-4</td><td></td></tr><tr><td>chirurgische schaar</td><td>Kent Scientific</td><td>INS700540</td><td></td></tr><tr><td>sutureerzijde</td><td>Fine Science Tools</td><td>NC9416241</td><td></td></tr><tr><td>spruit</td><td>Merck</td><td>Z683531-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Taurien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86330</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten voor gelijktijdige metingen van ca2+ transiënten en l-type calciumstroom

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Muismodellen spelen een cruciale rol in aritmieonderzoek en maken het mogelijk om belangrijke mechanismen van aritmogenese te bestuderen, waaronder een veranderde ionkanaalfunctie en calciumbehandeling. Voor dit doel zijn atriale of ventriculaire cardiomyocyten van hoge kwaliteit nodig om patch-clampmetingen uit te voeren of om calciumbehandelingsafwijkingen te onderzoeken. De beperkte opbrengst van hoogwaardige cardiomyocyten verkregen door de huidige isolatieprotocollen maakt beide metingen in dezelfde muis echter niet mogelijk. Dit artikel beschrijft een methode om hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten te isoleren via retrograde enzymgebaseerde Langendorff-perfusie, voor daaropvolgende gelijktijdige metingen van calciumtransiënten en L-type calciumstroom van één dier. Muizenharten worden verkregen en de aorta wordt snel gecannuleerd om bloed te verwijderen. Harten worden vervolgens in eerste instantie doordrenkt met een calciumvrije oplossing (37 °C) om het weefsel te dissociëren ter hoogte van geïntercaleerde schijven en daarna met een enzymoplossing die weinig calcium bevat om de extracellulaire matrix (37 °C) te verstoren. Het verteerde hart wordt vervolgens ontleed in boezems en ventrikels. Weefselmonsters worden in kleine stukjes gehakt en opgelost door voorzichtig op en neer te pipetteren. De enzymatische spijsvertering wordt gestopt en cellen worden stapsgewijs opnieuw geïntroduceerd in fysiologische calciumconcentraties. Na het laden met een fluorescerende Ca2+-indicator worden geïsoleerde cardiomyocyten voorbereid voor gelijktijdige meting van calciumstromen en transiënten. Daarnaast worden isolatie-valkuilen besproken en patch-clamp-protocollen en representatieve sporen van L-type calciumstromen met gelijktijdige calciumtransiënte metingen in atriale en ventriculaire murine myocyten geïsoleerd zoals hierboven beschreven.

De isolatieopbrengst wordt bepaald na herintroductie van calcium door 10 μL celsuspensie op een microscoopglaasje te pipetteren. Meer dan 100 levensvatbare, staafvormige, niet-contracterende cellen/10 μL voor atriale celisolatie en meer dan 1.000 levensvatbare, staafvormige, niet-contracterende cellen/10 μL voor ventriculaire celisolatie worden beschouwd als voldoende opbrengst en worden gewoonlijk verkregen met behulp van dit protocol. Atriale cellen verkregen met dit protocol toonden een verscheidenheid aan verschillen...

Muismodellen maken het mogelijk om belangrijke mechanismen van aritmogenese te bestuderen. Voor dit doel zijn cardiomyocyten van hoge kwaliteit nodig om patchklemmetingen uit te voeren. Hier wordt een methode beschreven om murine atriale en ventriculaire myocyten te isoleren via retrograde enzymgebaseerde Langendorff-perfusie, die gelijktijdige metingen van calciumtransiënten en L-type calciumstroom mogelijk maakt.

Isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca2+ transiënten en L-type calciumstroom

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Patch clamp en calcium-beeldvorming experimenten zijn arbeidsintensief, tijdrovend en uitdagend. Dit protocol biedt een handige methode om hoogwaardige muis-atrium- en ventrikelcardiomyocyten te isoleren, geschikt voor patch clamp-experimenten en gelijktijdig uitgevoerde calcium-beeldvorming. Het grote voordeel van dit protocol is dat we atrium- en ventrikelcardiomyocyten van hetzelfde dier kunnen verkrijgen.De isolatie van muis-atriumcardiomyocyten is bijzonder uitdagend en was een beperkende factor voor eerdere experimenten. Begin door de Langendorff-apparatuur vooraf te vullen met perfusiebuffer en zorg ervoor dat deze luchtvrij is. Bevestig een aortische canule onder de dissectiemicroscoop en verbind deze met een spuit van één milliliter gevuld met perfusiebuffer.Na het verwijderen van het hart uit de geëuthaniseerde muis, plaats het hart in perfusiebuffer op kamertemperatuur en canuleer de aorta met een stompe naald onder de microscoop zo snel mogelijk. Bind het hart stevig aan de naald met een stukje hechtzijde en ontkoppel de spuit. Na aortale canuleer zet, sluit het canuleerde hart onmiddellijk aan op de Langendorff-apparatuur, vermijd dat er lucht in het systeem binnenkomt.Perfundeer het hart gedurende één minuut met perfusiebuffer op precies 37 graden Celsius en een perfusiesnelheid van vier milliliter per minuut. Schakel over van perfusie naar spijsverteringsbuffer en perfundeer gedurende exact negen minuten op een temperatuur van 37 graden Celsius en een perfusiesnelheid van vier milliliter per minuut. Wanneer u klaar bent, brengt u het verteerde hart over in een petrischaal met voldoende spijsverteringsbuffer om het volledig te bedekken.Vervolgens dissecteer de atria en ventrikels voorzichtig onder de microscoop. Breng de atria over in een petrischaal met 1,5 milliliter spijsverteringsbuffer en de ventrikels in een andere petrischaal met drie milliliter spijsverteringsbuffer. Trek de atria voorzichtig maar snel uit elkaar in kleine stukjes met stompe pincetten.Los het weefsel op door voorzichtig op en neer te pipetten met een 1000-microliter pipettentip die eerder was gesneden om de tipopening te verwijden. Breng de oplossing over in een 15-milliliter centrifugeerbuis en voeg een gelijke hoeveelheid stopbuffer toe door voorzichtig op de zijkant van de buis te pipetten. Laat alle drie milliliter van de oplossing door een 200-micrometer nylon gaas gaan om de resterende grotere weefselstukken te verwijderen die niet volledig zijn verteerd.Om ventrikeldissectie uit te voeren, hak het ventrikelweefsel in kleine stukjes met dissectiescharen of pincetten en pipet op en neer met een andere 1000-microliter pipettentip om op te lossen. Breng de cel- en weefseloplossing over in een 15-milliliter centrifugeerbuis en voeg een gelijke hoeveelheid stopbuffer toe door het voorzichtig op de zijkant van de buis te pipetten om de reactie te beëindigen. Laat alle zes milliliter cel- en weefseloplossing door een 200-micrometer nylon gaas gaan om grotere stukken te verwijderen die niet volledig zijn verteerd.Laat zowel de atriale als ventrikelcelsuspensies zes minuten op de werktafel bij kamertemperatuur om te sedimenteren. Centrifugeer vervolgens de buizen gedurende twee minuten bij 5G. Gooi de supernatanten weg met een plastic Pasteurpipet en resuspendeer voorzichtig de celpellets in 10 milliliter calciumvrije Tyrode's oplossing.Laat de atriale en ventrikelcellen gedurende acht minuten sedimenteren. Centrifugeer de atriale cellen bij 5G gedurende één minuut. Gooi vervolgens de supernatanten van beide celmonsters weg en resuspendeer voorzichtig de pellets in 10 milliliter Tyrode's oplossing met 100 micromolar calcium.Laat de cellen nog acht minuten sedimenteren, en herhaal vervolgens de centrifugatie van atriale cellen. Gooi de supernatanten weg en resuspendeer voorzichtig de celpellets in 10 milliliter Tyrode's oplossing met 400 micromolar calcium. Herhaal dit proces nog een keer, en resuspendeer de cellen in Tyrode's oplossing met één millimolar calcium.Alle atriale cellen zijn klein met celafvoerwaarden variërend van ongeveer 35 tot 100 picofarad. Hier wordt een typische cel van het werkende atriummyocardium getoond. Ventriculaire myocyten zijn meer staafvormig en groter, met celafvoerwaarden variërend van 100 tot ongeveer 400 picofarad.Voorbeelden van L-type calciumstroommetingen met gelijktijdige cytosolische calciumtransienten van één atriummyocyt en één ventrikelmyocyt worden hier getoond. Voordat u deze techniek probeert, moet u de orgaanoogst oefenen. Het is van cruciaal belang dat de stap snel wordt uitgevoerd en alle weefselsneden op de juiste locaties worden gemaakt.Wanneer de orgaanoogst met reproduceerbare kwaliteit wordt uitgevoerd, neem wat tijd om canuleer te perfectioneren. Cellen die met dit protocol zijn geïsoleerd, zijn geschikt voor patch clamp-metingen. Bovendien kunnen ze worden geladen met fluorescerende kleurstoffen, wat een breed scala aan beeldvormingsexperimenten mogelijk maakt.

isolation-high-quality-murine-atrial-ventricular-myocytes-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Kv dysfunctie wordt geassocieerd met hartritmestoornissen. Om de moleculaire mechanismen die leiden tot dergelijke aritmieën we een systematische protocol gebruiken voor isolatie van atriale en ventriculaire hartspiercellen uit Kv kanaal bijkomende subunit knockout muizen. Geïsoleerde cardiomyocyten kan vervolgens direct worden gebruikt voor cellulaire elektrofysiologische studies, biochemische of immunofluorescentie (IF) testen.

Isolatie en Kv Channel Opnamen in Murine atriale en ventriculaire cardiomyocyten

Wij beschrijven de isolatie van menselijke atriale myocyten die kunnen worden gebruikt voor intracellulaire...

Isolatie van Human atriale Myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transients en Membraan Currents

Hier beschrijven we de isolatie van volwassen muis cardiomyoctyes met behulp van een Langendorff perfusie-systeem. De resulterende cellen Ca2 +-tolerante, elektrisch rustende en kan gekweekt en getransfecteerd met adeno-of lentivirussen om genexpressie te manipuleren. Hun functionaliteit kan ook worden geanalyseerd met behulp van het MMSYS systeem en patch clamp technieken.

Isolatie, Cultuur en functionele karakterisering van volwassen muis Cardiomyoctyes

Huidige kennis over de cellulaire basis van hartziektes vertrouwt vooral op studies op diermodellen. Hier beschrijven we en validatie van een nieuwe methode om enkele levensvatbare hartspiercellen te verkrijgen van kleine chirurgische monsters van menselijk ventriculair myocard. Menselijke hartspiercellen en kan worden gebruikt voor elektrofysiologische studies en drugstesten.

Isolatie en functionele karakterisering van Human ventriculaire cardiomyocyten van Fresh Chirurgische Samples

Dit protocol beschrijft de elektrofysiologische evaluatie van lymfkliertest atria met behulp van een optische mapping systeem met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, met inbegrip van dubbele opnamen van de membraan spanning en Ca2 + voorbijgaande onder geprogrammeerd stimulatie door middel van een speciale elektrode-katheter.

Elektrofysiologische beoordelingvan lymfkliertest Atria met hoge resolutie optische Mapping

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd, Langendorff gebaseerde procedure voor de isolatie van eencellige atriale cardiomyocytes van een rat model van metabole syndroom-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie Fractie. Een handmatige regulering van de intraluminale druk van cardiale Holten is geïmplementeerd om de opbrengst van functioneel intact myocytes geschikt voor excitatie-contractie-koppeling studies.

Isolatie van atriale Cardiomyocytes van een Rat Model van metabole syndroom-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie Fractie

Dit protocol wordt gebruikt om enkelvoudige atriale cardiomyocyten van het volwassen muis hart te isoleren met behulp van een Brok digestie benadering. Deze aanpak wordt gebruikt om te isoleren van rechts of links atriale myocyten die kunnen worden gebruikt voor het karakteriseren van Atrium myocyten elektrofysiologie in Patch-clamp studies.

Isolatie van atriale Myocyten van volwassen muizen

We presenteren de methodologie voor het isoleren van Murine myocyten en het verkrijgen van spannings-of calcium sporen tegelijk met sarcomere inkorten van sporen met fluorescentie fotometrie met gelijktijdige metingen van digitale cellen geometrie.

Optische beeldvorming van geïsoleerde Murine ventriculaire Myocyten

Een methode wordt beschreven voor de gelijktijdige isolatie van myocyten en niet-myocyten van zowel de atria als ventrikels van een enkel volwassen muizenhart. Dit protocol resulteert in consistente opbrengsten van zeer levensvatbare cardiale myocyten en niet-myocyten en beschrijft optimale celspecifieke kweekomstandigheden voor fenotyping en in vitro analyse.

Gelijktijdige isolatie en cultuur van atriale myocyten, ventriculaire myocyten en niet-myocyten uit een volwassen muizenhart

Dit protocol beschrijft modificaties van de Langendorff-methode, waaronder de diepte van aorta-cannulatie voor gelijktijdige isolatie van atriale en ventriculaire myocyten van volwassen muizen.

Modificaties van de Langendorff-methode voor gelijktijdige isolatie van atriale en ventriculaire myocyten van volwassen muizen

Leer de isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire cardiomyocyten via retrograde Langendorff-perfusie. Dit protocol maakt gelijktijdige meting van Ca²⁺-transiënten en L-type calciumstroom mogelijk voor onderzoek naar hartritmestoornissen.

Isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca2+ transiënten en L-type calciumstroom (Video) | JoVE Journal

Isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca²⁺ transiënten en L-type calciumstroom

Meer video's verkennen