Name: Terugkerende Escherichia coli urineweginfectie veroorzaakt door Gardnerella vaginalis blaasblootstelling bij muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Leer een muismodel voor terugkerende urineweginfecties veroorzaakt door Escherichia coli na blootstelling aan Gardnerella vaginalis. Deze methode onderzoekt bacteriële interacties in de blaas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Lynne Foster voor technische hulp bij infectie-experimenten, James Fitzpatrick van het Washington University Center for Celluar Imaging (WUCCI) voor toegang tot de SEM, Scott Hultgren voor de UTI89kanR UPEC-stam en David Hunstad voor het kritisch lezen van het manuscript.
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (Graduate Research Fellowship to VPO#DGE - 1143954), door het Center for Women's Infectious Disease Research aan de Washington University School of Medicine (Pilot Research Award to NMG), door de American Heart Association: #12POST12050583 (NMG) and #14POST20020011 (NMG), en door de National Institutes of Health, NIAID: R01 AI114635 (ALL) en NIDDK: R21 DK092586 (ALL), P50 DK064540-11 (SJH, project II PI:ALL) en K01 DK110225-01A1 (NMG). Sommige van de dierstudies werden uitgevoerd in een faciliteit die wordt ondersteund door NCRR-subsidie C06 RR015502. Het Washington University Center for Cellular Imaging (WUCCI; waar SEM werd uitgevoerd) en MSJ werden ondersteund door de Washington University School of Medicine, het Children's Discovery Institute van de Washington University en het St. Louis Children's Hospital (CDI-CORE-2015-505), de Foundation for Barnes-Jewish Hospital (3770) en het National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NS086741). De financiers hadden geen rol in studieontwerp, gegevensverzameling en -analyse, beslissing om te publiceren of voorbereiding van het manuscript.

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben met betrekking tot deze studie.

De eerste kritieke stap in dit model om muizen te identificeren die de UPEC-bacteriurie niet hebben opgeruimd tijdens de primaire UTI-fase. Deze muizen moeten uit het experiment worden verwijderd omdat ze anders de tarieven van UPEC-bacteriurie na blootstelling aan G. vaginalis zouden verstoren. Na de eerste UPEC-inenting moet wekelijks urine worden verzameld om de bacteriële klaring te controleren. Ongeveer 65-80% van de C57BL/6 muizen zal binnen 4 weken een UTI89kanR-infectie verwijderen. Andere inteeltmuisstammen hebben verschillende neigingen voor UPEC-klaring42,43 en reservoirvorming en zijn daarom mogelijk niet geschikt voor dit model. Het tweede kritieke punt is dat empirische studies hebben vastgesteld dat twee opeenvolgende inentingen van G. vaginalis (12 uur of 1 week uit elkaar) nodig zijn om een significante reservoiropkomst te veroorzaken boven de spontane opkomst op de achtergrond die optreedt bij controlemuizen die alleen aan PBS worden blootgesteld. Andere tijdsduur tussen de twee opeenvolgende blootstellingen is niet getest, maar zou vergelijkbare resultaten kunnen opleveren. Het is belangrijk op te merken dat een vermindering van upec-blaastiters alleen werd waargenomen in het model waarin G. vaginalis-blootstellingen 1 week na elkaarwerden gegeven 39. Hoewel meer dan twee blootstellingen kunnen worden toegediend, suggereert empirisch bewijs dat herhaalde katheterisatie alleen de opkomst verhoogt, wat de interpretatie van de resultaten kan verstoren of grotere aantallen dieren kan vereisen om verschillen tussen blootstellingsgroepen en controles te onderscheiden. Ten slotte heeft de in situ blaasfixatiemethode verschillende kritieke stappen. Enige vaardigheid is vereist om ervoor te zorgen dat het fixatiemiddel in de geklemde blazen blijft. Leeggelopen blazen zullen moeilijker in beeld te brengen zijn door SEM. Het is ook essentieel om zeer voorzichtig te zijn bij het inenten van het fixatief in de blaas, omdat het schrapen van het urotheel met de fixatief-bevattende katheter urotheliale exfoliatie kan induceren, onafhankelijk van wat wordt veroorzaakt door G. vaginalis. Alle concentraties die in de fixatieve cocktail worden genoemd, zijn eindconcentraties. Onjuiste verhoudingen hiervan kunnen leiden tot onvoldoende fixatie en zwelling of krimp van de cellen. Fixatieven moeten worden verwarmd tot fysiologische temperaturen om temperatuurschok in cellen en weefsels te voorkomen. Opwarming zorgt ook voor een lichte verbetering van de diffusiesnelheid van fixatieven door plasmamembranen. Hoewel osmiumkleuring vaak kan worden weggelaten voor monsters die zijn voorbereid voor SEM-analyse, is het een essentiële stap in dit protocol om lipiden te stabiliseren en scheuren van cellulaire membranen tijdens het drogen van kritieke punten te voorkomen.
Dit protocol kan worden aangepast om andere UPEC- en/of G. vaginalis-stammen te testen op hun vermogen om reservoirs te vormen en hun opkomst te activeren. Andere experimentele factoren kunnen ook worden toegevoegd, zoals blootstelling aan andere vaginale bacteriën (bijv. Lactobacillus crispatus PVAS100) of hitte-gedode G. vaginalis, die geen van beide pathologie aantonen in dit model39. Bij het selecteren van andere bacteriestammen om te testen, is het belangrijk om een consistente groei aan te tonen, zodat een standaard entafconcentratie in alle experimenten kan worden gebruikt. De groei van JCP8151BSmR is geoptimaliseerd in een anaerobe kamer. Deze stam kan waarschijnlijk worden gekweekt in een anaeroob GasPak-systeem, maar dit vereist optimalisatie om robuuste bacteriegroei te garanderen. Ten slotte is het mogelijk om de timing van bepaalde stappen in het model te wijzigen. Urine kan bijvoorbeeld worden verzameld op eerdere tijdstippen tijdens de UPEC-reservoirvormingsfase om CFU- of gastheerresponsen te controleren. Een nadelig effect van het verzamelen van urinemonsters op vroege tijdstippen (3, 6, 12 hpi) op de progressie van infectie of het opzetten van reservoirs is niet waargenomen in dit model. Er is gemeld dat upec-reservoirs optreden na twee JCP8151BSmR-doses van 12 uur of 1 week, maar andere tijdsintervallen zijn nog niet getest. Het kan ook mogelijk zijn om de totale tijdsduur voor het model te verkorten door de UPEC-reservoirvormingsfase te verminderen tot 2 weken (in plaats van 4 weken), omdat veel van de muizen tegen die tijd bacteriurie hebben. Eerdere studies die de opkomst van UPEC onderzochten na blootstelling aan de blaas aan chemische exfolianten gebruikten een 1 of 2 wk UPEC-reservoirvormingsfase17,18. Het verminderen van de tijd voor de klaring van UPEC-bacteriurie kan echter ten koste gaan van de eis dat meer dieren uit het experiment worden geruimd. Ten slotte kan SEM-analyse van de blaas op extra tijdstippen worden uitgevoerd om de duur van het effect van G. vaginalis op het urotheel te observeren.
Met betrekking tot het oplossen van problemen zijn er enkele belangrijke overwegingen specifiek met betrekking tot de SEM-analyse van de blaas. Afhankelijk van de gebruikte muisachtergrond en de hoeveelheid aanwezige ontsteking, zullen sommige blazen zich presenteren met zeer dunne wanden. Deze blazen hebben de neiging om meer te krullen tijdens het drogen van kritieke punten en kunnen resulteren in een cowrie-schaalachtige vorm. Als dit gebeurt, is de beste methode om de schaalvormige blaas in tweeën te snijden langs de gekrulde interface en vervolgens een tweede keer om het grootste deel van het overhangende weefsel te verwijderen. Snijden werkt het beste met een PTFE-gecoat dubbelrand scheermesje. Overtollig vet kan soms oplossen tijdens de osmiumkleuringsstappen. Dit kan resulteren in ongewenste onoplosbare vetdruppels die mogelijk niet afspoelen tijdens de spoel- en uitdrogingsstappen en die zich tijdens het daaropvolgende drogen op het blaasoppervlak kunnen nestelen. Deze druppels kunnen verschijnen als kleine bolletjes of schijfachtige structuren verspreid over het monster (figuur 4D). Dit kan worden verzacht door ervoor te zorgen dat er zoveel mogelijk vetweefsel uit de omgeving van de blaas wordt verwijderd. Platina kan worden vervangen door iridiumcoating, maar diktes moeten tot een minimum worden beperkt om het maskeren van fijne structurele details te verminderen. Het gebruik van een roterende fase tijdens het coaten wordt ten zeerste aanbevolen.
Een beperking van dit model is dat het een groot aantal muizen vereist. Slechts 65-80% van de C57BL/6-muizen zal hun UPEC-bacteriurie opruimen en geschikt zijn voor daaropvolgende G. vaginalis of PBS-inenting (zie figuur 2C). Om 10-12 muizen per groep te verkrijgen (G. vaginalis inenting vs. PBS), moeten ~ 30 muizen in eerste instantie worden geïnfecteerd met UPEC. Verder zijn er waarschijnlijk meerdere experimenten nodig om de biologische replicaties te bereiken die nodig zijn om statistische significantie te detecteren. Wanneer blootstellingen 1 week uit elkaar kregen, trad UPEC-opkomst op bij 14% van de muizen die werden blootgesteld aan PBS (figuur 3B). Het detecteren van een significante toename van UPEC-rUTI bij G. vaginalis blootgestelde muizen ten opzichte van PBS-controles (aangedreven door 0,8; alfa = 0,05 [eenzijdig]) vereist dus het testen van een cumulatief totaal van ten minste 40 muizen voor elke blootstellingsgroep. Een bijkomende overweging is dat deze experimenten duur en arbeidsintensief zijn. Muizen moeten wekelijks worden gecontroleerd op UPEC-klaring en het experimentele tijdsverloop is 4-5 week, afhankelijk van het feit of G. vaginalis tweemaal in een tijdsbestek van 12 uur of tweemaal 1 week uit elkaar wordt gegeven. SEM is arbeidsintensief en kan duur zijn, afhankelijk van de beschikbaarheid van microscoop en servicekosten. Het voorbereiden van de hele blaas op SEM biedt overvloedig materiaal voor analyse, maar het nadeel is dat het analyseren van elke blaas tijdrovend kan zijn. Het is dus waarschijnlijk dat slechts een beperkt aantal blazen kan worden geanalyseerd door SEM in vergelijking met de hogere dieraantallen die worden gebruikt voor urine- en weefseltiters. Bovendien vereist het verkrijgen van hoogwaardige afbeeldingen van de gebogen oppervlakken van de blaas "kopjes" vaardigheid vanwege schaduwen die het zicht kunnen belemmeren. Hoewel blaas SEM een nuttig hulpmiddel is voor het visualiseren van urotheliale exfoliatie, is deze methode grotendeels kwalitatief. Omdat het monster in een ronde vorm is gefixeerd en vanwege het gebruik van glutaaraldehyde in het fixatiemiddel, is screening op fluorescerend tot expressie brengende bacteriën via lichtmicroscopie niet mogelijk. Immunostaining en chemische kleurstoffen zijn onverenigbaar met dit proces vanwege het gebruik van glutaaraldehyde dat de meeste antigenen en osmium zal kruisen en dat antigeenplaatsen zal maskeren en het weefsel donkerder zal maken. Dat gezegd hebbende, is de SEM-techniek nuttig voor parameters die kwantitatief kunnen worden geëvalueerd zonder het gebruik van extra sondes, zoals celgrootte48,49.
Dit model biedt verschillende voordelen die verder gaan dan eerder beschreven methoden. Het maakt het onderzoek mogelijk van mechanismen van UPEC rUTI veroorzaakt door opkomst uit blaasreservoirs, in tegenstelling tot herintroductie in de blaas vanuit een externe bron. Andere modellen van rUTI als gevolg van opkomst uit blaasreservoirs gebruiken chemische middelen (protaminesulfaat of chitosan) om urotheliale exfoliatiete veroorzaken 17,18, wat geen triggers van rUTI bij vrouwen zou zijn. G. vaginalis is een veel voorkomende urogenitale bacterie die is gedetecteerd in urine die rechtstreeks uit de blaas wordt verzameld via katheterisatie of suprapubische aspiratie bij sommige vrouwen23,26. Dit feit, in combinatie met de bekende associatie tussen BV (waarbij G. vaginalis overgroeit in de vagina) en UTI, suggereert dat G. vaginalis een klinisch plausibele trigger van rUTI is. Ten slotte behoudt de in situ blaasfixatiemethode de ultrastructuur van de blaas en beperkt schade, zodat de blaaslagen niet van elkaar scheiden. Eerdere methoden voor het visualiseren van het urotheel hebben traditioneel de gebruiker aseptisch geoogst, bisect, stretch en pin de blaas op een dissectiebak voordat de uitgerekte blaas wordt ondergedompeld in fixatief48. Deze methode resulteert in een zeer plat monster, maar zorgt niet voor een gelijkmatige of natuurlijke uitrekking van het weefsel en kan resulteren in gebieden die over en onder uitgerekt zijn (wat resulteert in zeer gerimpeld weefsel) en kan blaaslaagscheiding veroorzaken. Bovendien kunnen deze fysieke manipulaties van de blaas om het weefsel uit te rekken en vast te pinnen schade veroorzaken, waaronder urotheliale exfoliatie. Een andere methode is om intacte blazen onder te dompelen in fixatief voordat ze in paraffine worden ingebed en dunne secties krijgen met een microtoom. Dunne secties zijn van onschatbare waarde voor immunohistochemische experimenten om bacteriën en gastheereiwitlokalisatie te onderzoeken, maar een dunne sectie maakt visualisatie van het urotheliale oppervlak niet mogelijk. Met deze SEM-methode kan het oppervlak van de gehele blaas in één keer worden onderzocht.
Zoals beschreven, omvatten toekomstige toepassingen van dit model het testen van andere UPEC-stammen om te bepalen of ze intracellulaire reservoirs vormen en het testen van andere G. vaginalis-stammen om te beoordelen of ze exfoliatie en UPEC-opkomst veroorzaken om rUTI te veroorzaken. Andere muizenstammen dan C57BL / 6-muizen kunnen ook worden getest, hoewel muizen met een hoge neiging tot het ontwikkelen van chronische cystitis (zoals muizen op de C3H-achtergrond) niet worden aanbevolen, omdat te veel muizen uit het experiment zouden moeten worden geruimd. Een bijkomend voordeel van C57BL/6 muizen is dat veel genetische knock-out stammen in de handel verkrijgbaar zijn. Dergelijke stammen bieden de mogelijkheid om de gastheerfactoren te onderzoeken die betrokken zijn bij de vorming en/of opkomst van reservoirs.

Urineweginfecties (UTI) leggen wereldwijd een aanzienlijke zorgbelasting op, die elk jaar de kwaliteit van leven van miljoenen mensen beïnvloedt, vooral vrouwen1. Uropathogene Escherichia coli (UPEC) zijn de meest voorkomende oorzaak van UTI1. Veel patiënten (ongeveer 20-30%) die UTI ontwikkelen, zullen binnen 6 maanden een recidiverende UTI (rUTI) ervaren, ondanks de door antibiotica gemedieerde klaring van de initiële infectie2. Helaas lijdt maar liefst 5% van de premenopauzale vrouwen elk jaar aan 3 of meer rUTI 3,4. Sequentiële episodes van rUTI kunnen worden veroorzaakt door persistentie van dezelfde UPEC-stam uit het indexgeval 5,6,7,8. Gegevens van menselijke monsters en muismodellen suggereren dat rUTI van dezelfde stam kan worden veroorzaakt door UPEC die zich in rustige reservoirs in de blaas bevindt. Bij mensen werd UPEC gedetecteerd in epitheelcellen en blaasbiopten van patiënten met UTI 9,10,11,12,13. Studies bij C57BL/6-muizen hebben aangetoond dat sommige stammen van UPEC rustige intracellulaire reservoirs in de blaas kunnen vestigen, zoals gedetecteerd door fluorescentiemicroscopie en door homogenisatie en kweek van blaasweefsel, die maandenlang worden gehandhaafd na oplossing van bacteriurie 14,15,16. Behandeling van de blaas met middelen die exfoliatie van het blaasepitheel (urotheel) induceren, bijvoorbeeld protaminesulfaat17 of chitosan18, veroorzaken de opkomst van UPEC uit reservoirs om rUTI te veroorzaken. Deze gegevens suggereren dat bij vrouwen die blaas-UPEC-reservoirs herbergen van een eerdere infectie, blaasblootstellingen die leiden tot urotheliale exfoliatie rUTI kunnen veroorzaken.
Er zijn steeds meer aanwijzingen dat de vaginale microbiota bijdraagt aan urineweginfectie19,20. Gardnerella vaginalis is een frequent lid van zowel de vaginale als de urinaire microbiota 21,22,23,24,25,26,27,28,29. In de vagina is de aanwezigheid van hoge niveaus van G. vaginalis geassocieerd met een microbiële dysbiose die bekend staat als bacteriële vaginose (BV), die ~ 30% van de vrouwentreft 30,31,32. Vrouwen met BV lopen een hoger risico op het ervaren van UTI in vergelijking met vrouwen met een vaginale gemeenschap gedomineerd door Lactobacillus 33,34,35,36,37. In muismodellen veroorzaakt G. vaginalis epitheliale exfoliatie zowel in de vagina38 als in de blaas39. Bij C57BL/6-muizen met UPEC-blaasreservoirs resulteren twee opeenvolgende blaasblootstellingen aan G. vaginalis - maar niet aan PBS - in het opnieuw opduiken van UPEC uit reservoirs om UPEC-rUTI te veroorzaken. De opkomst blijkt uit het verschijnen van UPEC-titers in urine van muizen die eerder UPEC-bacteriurie hadden opgelost en een daaropvolgende afname van UPEC-blaashomogenaattiters bij opoffering in vergelijking met PBS-blootgestelde controledieren39. Interessant is dat er geen blijvende kolonisatie door G. vaginalis in de blaas is. In de overgrote meerderheid van de gevallen zijn twee korte blootstellingen, elk met minder dan 12 (h) levensvatbare G. vaginalis in de urine, voldoende om urotheliale exfoliatie uit te lokken en rUTI te bevorderen.
Dit protocol beschrijft een muismodel van rUTI veroorzaakt door UPEC in intracellulaire blaasreservoirs, met behulp van G. vaginalis blaasinenting om het recidief te veroorzaken. De vooruitgang die met dit model wordt bereikt, is dat G. vaginalis een klinisch relevante biologische trigger van rUTI is in vergelijking met eerder gebruikte chemische agentia. Verder maakt de relatief kortstondige overleving van G. vaginalis in de urinewegen van de muis het mogelijk om de impact van voorbijgaande microbiële blootstellingen op het urotheel te onderzoeken, zoals zou kunnen optreden na seksuele activiteit. Naast het schetsen van het rUTI-model, beschrijft dit protocol ook methoden voor urinecytologie en in situ blaasfixatie en beeldvorming van het urotheel door scanning elektronenmicroscopie (SEM).
Dit protocol van G. vaginalis-geïnduceerde recidiverende UPEC UTI maakt gebruik van UPEC stam UTI89 met een kanamycineresistentiecassette (UTI89kanR)40. Niet alle geteste stammen van UPEC waren in staat om intracellulaire bacteriële gemeenschappen te vormen tijdens de acute infectiefase bij muizen41 en het is nog niet bekend of alle stammen van UPEC het vermogen hebben om latente intracellulaire reservoirs te vormen. Reservoirvorming moet worden bevestigd voorafgaand aan het gebruik van andere UPEC-stammen in het model. Dit protocol maakt gebruik van een spontaan streptomycine-resistent G. vaginalis isolaat, JCP8151BSmR38. Inductie van rUTI door JCP8151BSmR vereist twee opeenvolgende G. vaginalis-inentingen, gegeven 12 uur of 7 dagen (d) uit elkaar39. Of andere G. vaginalis-stammen al dan niet exfoliatie en/of UPEC-rUTI induceren, moet met dit model nog worden bepaald. Het is essentieel om UPEC- en G. vaginalis-stammen te gebruiken met bekende antibioticaresistentie (zoals kanamycine of spectinomycine voor UPEC en streptomycine voor G. vaginalis) omdat antibiotica aan agarplaten kunnen worden toegevoegd om de groei van endogene muismicrobiota te voorkomen die anders zouden kunnen interfereren met het opsommen van kolonievormende eenheden (CFU) om infectie te controleren. Dit is vooral belangrijk voor het kweken van urinemonsters, omdat muizenurine vaak andere bacteriën bevat die zonder antibiotica op kweekplaten kunnen overwoekeren. De oorsprong van deze endogene bacteriën in muizenurine is onbekend, maar weerspiegelt waarschijnlijk periurethrale en urogenitale bacteriën die worden opgepikt tijdens het verzamelen van urine.
G. vaginalis is een facultatieve anaerobe bacterie en daarom beschrijft dit protocol het kweken van G. vaginalis JCP8151BSmR in een anaerobe kamer. Als er geen anaerobe kamer beschikbaar is, kunnen andere methoden voor het handhaven van anaerobe groeiomstandigheden (zoals een GasPak-zakje in een luchtdichte container) worden gebruikt. Als alternatief zullen sommige stammen van G. vaginalis (waaronder JCP8151BSmR) groeien in een standaard weefselkweekincubator (5% CO2). Net zoals het gebruik van andere G. vaginalis-stammen dan JCP8151BSmR testen vereist om ervoor te zorgen dat de bacteriën zich in dit model op dezelfde manier gedragen, vereist het veranderen van groeiomstandigheden empirische bepaling van ideale duur voor kweek (op platen en in vloeistof) en optische dichtheid (OD) 600-equivalenten om de gewenste levensvatbare entconcentraties te bereiken. Bovendien is het niet bekend of groeistoornissen de pathobiologie van G. vaginalis beïnvloeden.
Ten slotte, bij het overwegen om dit model te gebruiken, moeten onderzoekers zich ervan bewust zijn dat het grotere aantallen dieren per groep kan vereisen dan typische UTI-muismodellen. Dit komt deels omdat inductie van rUTI vereist dat de muizen de UPEC-bacteriurie oplossen die wordt veroorzaakt door de initiële infectie van de blaas. Dus elke muis die bacteriurie niet wist te verwijderen (een fenotype dat meestal wijst op aanhoudende nierinfectie) is niet opgenomen in de rUTI-fase van het protocol. Het aantal muizen dat nodig is om deze studies aan te drijven, wordt ook beïnvloed door de snelheid van "spontane" UPEC-opkomst in de urine (gemiddeld 12-14%). Ten slotte hebben verschillende muizenstammen verschillende neigingen voor het ontwikkelen van chronische bacteriurie versus intracellulaire reservoirvorming42,43. Als in dit model andere muizenstammen dan C57BL/6 worden gebruikt, moet worden bevestigd dat de dieren rustige UPEC-intracellulaire reservoirs ontwikkelen.

<table><tbody><tr><td>30G x 1/2 naalden</td><td>BD</td><td>305106</td><td>voor katheters</td></tr><tr><td>5 1/2" rechte forceps hemostat</td><td>McKesson</td><td>487377</td><td>in situ blaasfixatie</td></tr><tr><td>ACE 600 Spuitcoater</td><td>Leica</td><td></td><td>SEM monsterverwerking</td></tr><tr><td>aluminium SEM-schijf</td><td>Ted Pella</td><td>16111</td><td>SEM monsterverwerking</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>EMS</td><td>12340</td><td>in situ blaasfixatie</td></tr><tr><td>geleidend koolstof plakband</td><td>Ted Pella</td><td>16084-1</td><td>SEM monsterverwerking</td></tr><tr><td>geleidend zilververf</td><td>Ted Pella</td><td>16034</td><td>SEM monsterverwerking</td></tr><tr><td>CPD 300 Kritische puntdroger</td><td>Leica</td><td></td><td>SEM monsterverwerking</td></tr><tr><td>Cytofunnel metalen clip</td><td>Simport</td><td>M964B</td><td>cytospun urinalyse</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>EMS</td><td>15050</td><td>SEM monsterverwerking</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>voor NYCIII G. vaginalis groeimedia</td></tr><tr><td>glutaaraldehyde</td><td>EMS</td><td>16320</td><td>in situ blaasfixatie</td></tr><tr><td>Hema 3 kleurkit</td><td>Fisher</td><td>23123869</td><td>cytospun urinalyse</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro</td><td>25-060-Cl</td><td>voor NYCIII G. vaginalis groeimedia</td></tr><tr><td>iridium</td><td>Ted Pella</td><td>91120</td><td>SEM monsterverwerking</td></tr><tr><td>isofluraan</td><td></td><td></td><td>muisanesthesie</td></tr><tr><td>kanamycine</td><td>Gibco</td><td>11815024</td><td>toevoegen aan UPEC LB selectieve platen (50 µg/mL)</td></tr><tr><td>Luria-Bertani agar</td><td>BD</td><td>DF0445174</td><td>UPEC groeiplaten</td></tr><tr><td>Luria-Bertani bouillon</td><td>BD</td><td>DF0446173</td><td>UPEC groeimedia</td></tr><tr><td>Merlin FE-SEM</td><td>Zeiss</td><td></td><td>scanning elektronenmicroscoop</td></tr><tr><td>Milli-Q Water Purifier</td><td>Millipore</td><td>IQ-7000</td><td>SEM monsterverwerking</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>voor NYCIII G. vaginalis groeimedia</td></tr><tr><td>Olympus Vanox AHBT3 microscoop</td><td>Olympus</td><td></td><td>cytospun urinalyse</td></tr><tr><td>osmiumtetroxide</td><td>EMS</td><td>19170</td><td>SEM monsterverwerking</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>in situ blaasfixatie</td></tr><tr><td>polyethyleen buis</td><td>Intramedic</td><td>427401</td><td>voor katheters</td></tr><tr><td>Proteose Peptone #3</td><td>Fisher</td><td>DF-122-17-4</td><td>voor NYCIII G. vaginalis groeimedia</td></tr><tr><td>PTFE gecoat dubbelzijdig scheermesje</td><td>EMS</td><td>72000</td><td>blaasjes snijden voor SEM</td></tr><tr><td>Shandon Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300002</td><td>cytospun urinalyse</td></tr><tr><td>Shandon cytofunnel filter</td><td>Simport</td><td>M965FWDV</td><td>cytospun urinalyse</td></tr><tr><td>Shandon dubbele cytofunnel</td><td>Simport</td><td>M964-1D</td><td>cytospun urinalyse</td></tr><tr><td>Shandon dubbele cytoslides (gecoat)</td><td>Thermo Scientific</td><td>5991055</td><td>cytospun urinalyse</td></tr><tr><td>natriumcacodylaat trihydraat</td><td>EMS</td><td>12310</td><td>in situ blaasfixatie</td></tr><tr><td>spectrofotometer</td><td>BioChrom</td><td>80-3000-45</td><td>meten van bacteriële OD600</td></tr><tr><td>streptomycine</td><td>Gibco</td><td>11860038</td><td>toevoegen aan G. vaginalis NYCIII selectieve platen (1 mg/mL)</td></tr><tr><td>tuberculine slip tip spuit</td><td>BD</td><td>309659</td><td>voor katheters</td></tr><tr><td>Gist Extract</td><td>Fisher</td><td>DF0127-17-9</td><td>voor NYCIII G. vaginalis groeimedia</td></tr></tbody></table>

terugkerende escherichia coli urineweginfectie veroorzaakt door gardnerella vaginalis blaasblootstelling bij muizen

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Terugkerende urineweginfecties (rUTI) veroorzaakt door uropathogene Escherichia coli (UPEC) komen vaak voor en zijn duur. Eerdere artikelen die modellen van urineweginfecties bij mannelijke en vrouwelijke muizen beschrijven, hebben de procedures voor bacteriële inenting en inventarisatie in urine en weefsels geïllustreerd. Tijdens een eerste blaasontsteking bij C57BL/6-muizen stelt UPEC latente reservoirs in blaasepitheelcellen vast die aanhouden na klaring van UPEC-bacteriurie. Dit model bouwt voort op deze studies om rUTI te onderzoeken die wordt veroorzaakt door de opkomst van UPEC vanuit latente blaasreservoirs. De urogenitale bacterie Gardnerella vaginalis wordt in dit model gebruikt als de trigger van rUTI omdat het vaak aanwezig is in de urogenitale kanalen van vrouwen, vooral in de context van vaginale dysbiose die is geassocieerd met UTI. Daarnaast wordt ook een methode voor in situ blaasfixatie gevolgd door scanning elektronenmicroscopie (SEM) analyse van blaasweefsel beschreven, met mogelijke toepassing op andere studies waarbij de blaas betrokken is.

Na inenting zijn UPEC-titers detecteerbaar in de urine (figuur 2B). Het niet plaatsen van urinemonsters op selectieve media die kanamycine bevatten, zal waarschijnlijk resulteren in overgroei van endogene muismicrobiota die de urine verontreinigen. Het niveau van UPEC-bacteriurie zal waarschijnlijk hoog zijn op dag 1 en kan in de eerste week toenemen voordat het op latere tijdstippen afneemt (figuur 2C). Ongeveer 65-80% van de muizen heeft geen detecteerbare UPEC in de urine met 28 dpi (figuur 2C, groene cirkel). Deze muizen kunnen worden gebruikt in de volgende stappen van het model. Muizen die bacterieur blijven (figuur 2C, rode ellips) moeten uit het experiment worden verwijderd.
Twee opeenvolgende blootstellingen aan G. vaginalis gegeven 12 uur (figuur 3A) of 1 week uit elkaar (figuur 3B) resulteren in het ontstaan van UPEC uit intracellulaire reservoirs om terugkerende bacteriurie te veroorzaken. Zowel het niveau van UPEC-bacteriurie (Mann-Whitney-test) als de fractie muizen met UPEC-rUTI (Fisher's exacte test) zijn significant hoger bij muizen die zijn blootgesteld aan G. vaginalis in vergelijking met de PBS-controlegroep. Urinecytologieanalyse detecteert PMN's in de urine van G. vaginalis-blootgestelde muizen die UPEC-opkomst vertoonden (figuur 3C). In het model met twee blootstellingen met een tussenpoos van 1 week zijn UPEC-titers in blaasweefsel lager bij G. vaginalis-blootgestelde muizen in vergelijking met PBS (figuur 3D), vermoedelijk als gevolg van het ontstaan van UPEC uit reservoirs en de daaropvolgende klaring.
Visualisatie van in situ-gefixeerd blaasweefsel door SEM onthult grote oppervlakkige paraplu-urotheelcellen die het blaasoppervlak bekleden bij controlemuizen die alleen aan PBS zijn blootgesteld (figuur 4A). Urotheliale exfoliatie wordt aangetoond door een verlies van oppervlakkige paraplucellen, waardoor kleinere onderliggende overgangsepitheelcellen worden onthuld bij muizen die zijn blootgesteld aan G. vaginalis (figuur 4B). Vroeg na de UPEC-inenting tijdens het aanleggen van intracellulaire reservoirs is UPEC zichtbaar op het urotheel en filamentvorming uit exfoliërende cellen (figuur 4C).

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig02.jpg"> Figuur 2. Monitoring van UPEC-titers in de urine tijdens fase 1 (reservoirvorming). (A) Schematische beplating van kolonievormende eenheden (CFU). (B) Representatief beeld van UPEC-titers in de urine op LB+kanamycine. Zwarte cirkels geven urinemonstervlekken aan die moeten worden geteld om CFU / ml te berekenen. (C) Tijdsverloop van UPEC-bacteriurie bij C57BL/6-muizen. Elke lijn vertegenwoordigt een individuele muis, die de UPEC-urinetiters in de loop van de tijd volgt. Stippellijn geeft de detectiegrens aan (1000 CFU/ml). Rode ellips duidt op vier muizen (van de 20) die de UPEC-bacteriurie niet konden oplossen en daarom niet zouden worden gebruikt voor het G. vaginalis-geïnduceerde rUTI-model. Omgekeerd duidt de groene cirkel op muizen die UPEC-bacteriurie oplosten en doorgingen naar volgende fasen. (D) Tabel met gegevens die zijn gebruikt om grafiek te genereren in paneel C. Gele, detecteerbare CFU; groen, geen KVE. (E) Randomisatie van muizen in blootstellingsgroepen op basis van het tijdstip waarop UPEC CFU niet langer in de urine werd gedetecteerd ("Dag opgelost"). De muisnummers in de linkerkolom van paneel D zijn dezelfde muisnummers als in paneel E. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig03.jpg"> Figuur 3. G. vaginalis veroorzaakt UPEC rUTI. UPEC-titers in de urine na twee opeenvolgende blootstellingen van urinewegen aan PBS (cirkels) of G. vaginalis (Gvag; vierkanten) gegeven 12 h (A) of 1 week (B) uit elkaar. Elk symbool vertegenwoordigt een individuele muis. De hoogste CFU/mL UPEC gedetecteerd van elke muis tussen 1-3 d na de tweede blootstelling worden uitgezet. Muizen zonder detecteerbare bacteriurie worden uitgezet op de detectiegrens (stippellijn). (C) Urinecytologie analyse met UPEC (pijlpunten) en polymorfonucleaire (PMN) cellen (pijlen). Schaalbalk = 20 μm. (D) UPEC-titers in blaasweefsel verzamelden 3 d na twee opeenvolgende blootstellingen aan urinewegen met een tussenpoos van 1 week. Elk symbool vertegenwoordigt een andere muis en nullen worden uitgezet op de detectiegrens (stippellijn). In A, B en D bevinden de vakken zich in het eerste en derde kwartiel met de mediaan gemarkeerd en snorharen van min tot max. Mann-Whitney U-tests * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig04.jpg"> Figuur 4. SEM-analyse van in situ gefixeerde blazen. Blazen werden verzameld van muizen 3 uur na twee blootstellingen (12 uur uit elkaar) aan PBS (A) of G. vaginalis (C). Stippellijnen illustreren een enkele urine-epitheelcel, die kleiner is in G. vaginalis-blootgestelde blazen omdat de grote oppervlakkige cellen zijn weg geëxfolieerd en het onderliggende overgangsepitheel onthullen. (B) Blaas verzameld 6 uur na de eerste inenting met UPEC, tijdens fase 1 van het model, met urotheliale exfoliatie en extracellulaire UPEC. (D) Voorbeeld van onoplosbare vetdruppels die op het blaasoppervlak aanwezig zijn. Schaalbalken zijn 20 μm in de hoofdafbeeldingen en 2 μm in de inzet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Een muismodel van uropathogene E. coli (UPEC) transurethrale inenting om latente intracellulaire blaasreservoirs en daaropvolgende blaasblootstelling aan G. vaginalis vast te stellen om terugkerende UPEC-UTI te induceren, wordt aangetoond. Ook aangetoond zijn de opsomming van bacteriën, urinecytologie en in situ blaasfixatie en -verwerking voor scanningelektronenmicroscopie.

Terugkerende Escherichia coli urineweginfectie veroorzaakt door Gardnerella vaginalis blaasblootstelling bij muizen

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Recidieverende urineweginfecties zijn een ernstige gezondheidsprobleem. Dit protocol zal ons helpen begrijpen hoe kortstondige blootstelling aan urogenitale bacteriën schade aan de blaas veroorzaakt en E.Coli-recidieverende UTI's veroorzaakt. Een voordeel van dit model is dat blaas exfoliatie en recidieverende UTI wordt geactiveerd door de urogenitale bacterie Gardnerella vaginalis, die vaak abundant is bij vrouwen die last hebben van recidieverende UTI.Begin door de G.vaginalis-stam van een min 80-graad Celsius vriesvoorraad in een anaërobe kamer te brengen. Strijk de bacteriën op een NYCIII-plaat zonder antibiotica. Incubeer de plaat 24 uur anaërobisch bij 37 graden Celsius.In de anaërobe kamer, inoculeer vijf milliliter anaërobe NYCIII-media met een ene microliter-lus vol cellen van de NYCIII-plaat en incubeer de cultuur statisch bij 37 Celsius onder anaërobe omstandigheden gedurende 18 uur. Voeg geen antibiotica toe aan het groeimedium. Bepaal de OD600 van de cultuur met behulp van een spectrofotometer.Centrifugeer het vervolgens bij 9.600 keer G gedurende één minuut en aspeer het media. Resuspendeer het bacteriële pellet in PBS tot de gewenste concentratie en verdun en plateer het inoculum serieel. Voeg 10 microliter urine toe aan 90 microliter PBS in een cytofunnel-cassette met een aangehecht filter.Plaats de cassettes in de cytocentrifuge met een dia en draai ze zes minuten bij 600 tot 800 keer G met hoge acceleratie. Nadat de dia's zijn verwijderd en een nacht mogen drogen, kleuren de dia's met een hematologie kleuringskit en analyseer ze met behulp van lichtmicroscopie op aanwezigheid van PMN's en epitheelcellen. Eenmaal tubuline slip-tip spuit met fixatief, bevestig een katheter aan het uiteinde, met de snijkant tegenover de spuitmarkeringen.Snijd het overtollige slangetje een tot twee millimeter van het uiteinde af, zorg ervoor dat de naaldpunt niet wordt blootgesteld. Schep de spuit om luchtbellen te verwijderen en druk de zuiger om lucht te verwijderen. Vul vervolgens de katheter met fixatief over een microcentrifugebuisje. Nadat de muis is verdoofd en geofferd, en de poten zijn vastgezet, open de bekkenholte van de muis met een pincet en een paar chirurgische schaar om de blaas bloot te leggen.Schuif voorzichtig het aangrenzende vet weg, maar laat de blaas op zijn plaats. Houd de spuit met de dominante hand met de naald naar beneden gericht. Doop de katheterpunt in steriel smeermiddel en positioneer de katheterpunt bij de urethrale opening, terwijl de spuithous op een hoek van 30 tot 45 graden over het lichaam van de muis wordt gehouden.Breng neerwaartse druk aan met een lichte draaiende beweging en voer de katheter voorzichtig in de urethra in. Terwijl de katheterpunt binnenkomt, draai de spuit naar de staart van de muis terwijl je de katheter verder in de urethra schuift tot de spuithous parallel is aan het werkoppervlak. De hele katheternaaldschacht moet de muis binnengaan, waarbij de katheterpunt zich binnen het lumen van de blaas bevindt. Lever langzaam 50 tot 80 microliter fixatief af, waardoor de blaas zich opblaast als een ballon.Houd de katheter op zijn plaats en til de spuit lichtjes op, waarbij de punt omhoog wordt gekanteld. Open met de andere hand een hemostaat en schuif een tand onder de katheternaald bij de kruising van de urethra. Sluit de hemostaat gedeeltelijk totdat deze net contact maakt met de naald.Schuif voorzichtig de katheternaald uit de blaas terwijl je tegelijkertijd de hemostaat volledig vastklemt en vergrendelt om verlies van het fixatief te voorkomen. Grijp de hemostaat zo dat deze parallel is aan het werkoppervlak met de blaas erop. Til voorzichtig op en snijd voorzichtig onder de hemostaat om de blaas te verwijderen met de hemostaten nog steeds bevestigd.Plaats de blaas en de bevestigde hemostaten in een Falcon-buisje met verwarmd fixatief. Zorg ervoor dat de blaas volledig in de vloeistof is ondergedompeld en niet tegen de wanden van de buis wordt gedrukt. Om de blaas te beeldvormen door middel van rasterelektronenmicroscopie, snijdt u deze sagittaal door met een schone, dubbelzijdige scheermes of scalpel en maakt u een tweede snede tangentieel aan de hemostaten om de blaas los te maken.Dit resulteert in twee half-blaasbekers. Als er nog vetkussentjes op het buitenoppervlak van de blaas aanwezig zijn, verwijder ze dan voorzichtig. Spoel de blaashelften drie keer in natrium cacodylaat buffer.Kleur het weefsel met 1% osmiumtetraoxide in 0,15-molaire cacodylaat buffer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Voer deze stap uit met het kleurvat in folie gewikkeld om een donkere omgeving te behouden. Na het kleuren, spoel de blaashelften drie keer in ultrapuur water.Als er osmiceerde olie op het wateroppervlak wordt gezien, aspeer of veeg het af om besmetting tijdens de droogstappen te voorkomen. Na het uitdrogen van het weefsel, snijdt u de blaashelften met een schone, dubbelzijdige scheermes in tweeën om in totaal vier stukken te maken. Na inoculatie zijn UPEC-titer detectabel in de urine.Het niveau van UPEC-bacteriurie is hoog op dag één en kan in de eerste week toenemen voordat het op latere tijdstippen daalt. Ongeveer 65 tot 80% van de muizen zal geen detecteerbare UPEC in de urine hebben na 28 dagen post-inoculatie. Deze muizen kunnen worden gebruikt in de volgende stappen van het model.Muizen die bacteriurie blijven vertonen, moeten uit het experiment worden verwijderd. Twee opeenvolgende G.vaginalis-blootstellingen, gegeven met een interval van 12 uur of een week, resulteren in de opkomst van UPEC uit intracellulaire reservoirs om recidieverende bacteriurie te veroorzaken. Urinecytologie-analyse kan worden gebruikt om polymorfonucleaire cellen in urine van G.Vaginalis-blootgestelde muizen met getoonde UPEC-opkomst te detecteren.In het model met twee blootstelling

recurrent-escherichia-coli-urinary-tract-infection-triggered

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze video zal aantonen methoden om transurethrally veroorzaken muis infecties van de urinewegen en kwantificeren van de omvang van de resulterende infecties.

Transurethrale Inductie van Mouse urineweginfectie

Source: O'Brien, V. P., et. al., Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the use of scanning electron microscopy to visualize bacterial colonization and host–pathogen interactions in the bladder epithelium of a pre-infected mouse model.

Preparation of Mouse Bladder Tissue for Visualization of Bacterial Infection

Source: O'Brien, V.P. et al. Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the preparation of a Gardnerella vaginalis inoculum for establishing a mouse model of recurrent urinary tract infection.

Preparation of Gardnerella vaginalis Inoculum to Model Recurrent Urinary Tract Infections in Mice

Source: Conover, M. S., et al., J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the procedure for assembling and implanting a transurethral catheter in a female mouse, followed by bacterial inoculation to establish catheter-associated urinary tract infection and investigate biofilm-mediated host-pathogen interactions.

Catheter-Associated Urinary Tract Infection in a Mouse Model

Source: Conover, M. S. et. al., Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the detection of intracellular bacterial communities (IBCs) in mouse bladder tissue infected with β-galactosidase-expressing Escherichia coli. Following tissue fixation, permeabilization, and staining with X-gal, IBCs appear as blue puncta under a dissecting microscope, confirming bacterial invasion during urinary tract infection.

Visualizing Intracellular Bacterial Communities in an Infected Mouse Bladder

In this video, we describe the technique for the intravesical administration of uropathogenic bacteria to generate a urinary tract infection model in mice. This model can be used to understand the spread of uropathogenic bacterial infection within the urinary system and the mechanisms that determine UTI susceptibility.

Generating Urinary Tract Infection Model: A Technique to Administer Uropathogenic Bacteria in Mouse to Develop Urinary Tract Infection Model

This video demonstrates the establishment of uropathogenic Escherichia coli infection in a female mouse bladder through transurethral catheter instillation. The injected bacteria successfully establish a urinary tract infection within the bladder, providing a valuable platform for studying healthcare-associated diseases related to the urinary tract.

Transurethral Catheterization and Bacterial Inoculation to Generate a Urinary Tract Infection Model in Male Mice

Establishment of a Urinary Tract Infection Model in Female Mice

De mogelijkheid om urineweginfecties (UTI) te modelleren is cruciaal om bacteriële pathogenese te begrijpen en de ontwikkeling van nieuwe therapeutische methoden te stimuleren. Het doel van dit werk is om muismodellen van experimentele UTI en katheter-geassocieerde UTI te demonstreren die bevindingen naspelen en voorspellen die bij mensen worden gezien.

Oprichting en karakterisering van UTI en Cauti in een muismodel

De gevestigde model van transuretrale catheterisatie van muizen kan de studie blaas aandoeningen, met inbegrip van infectie van de urinewegen, maar kan alleen worden uitgevoerd bij vrouwtjes. Een nieuw model van mannelijke transuretrale instillation, gepresenteerde, kan onderzoek op een gebied dat gekenmerkt door sterke klinische en epizoötiologische verschillen tussen de geslachten.

Urineweginfectie in een kleine diermodel: transuretrale catheterisatie van mannelijke en vrouwelijke muizen

Vroeggeboorte (bevalling &lt; 37 weken) is een urgent wereldwijd gezondheidsprobleem met suboptimale preventie- en behandelingsopties. We presenteren een muismodel van oplopende vaginale bacteriële infectie-geïnduceerde vroeggeboorte en schetsen hoe de resulterende neonatale morbiditeit en mortaliteit kunnen worden geanalyseerd.

Modellering van oplopende vaginale infectie, vroeggeboorte en neonatale morbiditeit bij muizen

Leer een muismodel voor terugkerende urineweginfecties veroorzaakt door Escherichia coli na blootstelling aan Gardnerella vaginalis. Deze methode onderzoekt bacteriële interacties in de blaas.

Terugkerende Escherichia coli urineweginfectie veroorzaakt door Gardnerella vaginalis blaasblootstelling bij muizen

Meer video's verkennen