Elektrocorticografische opname van hersenschorsgebieden gemanipuleerd met behulp van een Adeno-geassocieerd virus gericht op cofilin bij muizen

Dit protocol kan worden gebruikt om de rol van specifieke individuele moleculaire doelen in de regulering van elektrocorticografische activiteit tijdens verschillende Vigiline staten te identificeren. Een van de voordelen van het gebruik van adeno-geassocieerd virus is de mogelijkheid om precies gericht op een bepaald hersengebied en een specifiek celtype. Het protocol wordt gedemonstreerd door Julien Dufort-Gervais, een onderzoeksmedewerker van mijn team.

Na het bevestigen van een gebrek aan reactie op teenknijpreflex in een verdoofde muis van 12 weken oud, gebruikt u een haartrimmer om het haar van de achterkant van de oren naar de voorkant van het hoofd tussen de ogen te scheren. Voeg een royale druppel oogzalf toe aan elk oog om uitdroging te voorkomen en gebruik de oorstangen om het hoofd van de muis voorzichtig op een stereotaxisch apparaat te bevestigen. Trek de tong voorzichtig uit de mond om verstikking te voorkomen.

Bevestig de neus van de muis aan het apparaat en gebruik 70% ethanol om de blootgestelde huid op het hoofd te steriliseren. Houd de huid vast met een extra fijne Graefe-tang, gebruik een tissueschaar om de huid van de basis van de oren tot het niveau van de ogen te snijden en plaats twee chirurgische klemmen aan elke kant van de incisie om de huid te strekken en de schedel bloot te stellen. Vermijd hersen hechtingen, gebruik een schaar tip om het schedeloppervlak te krassen om het periosteum te verwijderen en om overlappende strepen in twee of meer richtingen te creëren.

Gebruik 70% ethanol om de botfragmenten te verwijderen en de schedel te desinfecteren. Met een eerder voorbereide canule bevestigd aan de stereotaxic arm, identificeer de locatie van de bregma en lambda en noteer de stereotaxic coördinaten van elk. Gebruik de stereotaxic arm en een pen om de positie van de canule op de schedel te markeren 1,5 millimeter zijdelings rechts naar de middellijn en 1,5 millimeter voor de bregma.

Prik met een boor van 0,7 millimeter voorzichtig de schedel op de gemarkeerde positie loodrecht op het schedeloppervlak en lijn af met de verticale as en was de schedel met een steriele katoenen punt gedrenkt in een 10% betadine povidonjodiumoplossing en trek vervolgens de zuiger van een spuit van 10 microliter in met één microliter om de canule te laden met een luchtbel van één microliter. Meng vervolgens het AAV-mengsel van belang met langzame pipetten en voeg 1,7 microliter van het mengsel toe aan een steriele petrischaal. Gebruik deze spuit om 1,5 microliter van de oplossing in de canule te laden en de positie van de luchtbel op de aangesloten PE50-buis te markeren.

Lijn de canule verticaal uit met het gat in de schedel, zodat de canule de bovenrand van het bot bereikt en de Z-coördinaat van het schedeloppervlak markeert. Laat de canule langzaam zakken totdat de punt 1,5 millimeter onder het schedeloppervlak bereikt en laag vijf van de motorische cortex en start de spuitpomp met een debiet van 0,025 microliter per minuut om gedurende 40 minuten één microliter AAV te leveren. Gebruik de luchtbel in de buis om de injectie te volgen en eventueel bij te stellen.

Wanneer het volledige virusvolume is afgeleverd, laat u de canule vijf minuten op zijn plaats om een voldoende diffusie te garanderen en terugstroming te voorkomen voordat u de stereotaxic-arm langzaam en voorzichtig optilt om de canule uit de cortex te verwijderen. Gebruik voor elektrodeimplantatie een rechte Kelly-tang om langzaam een elektrocorticografische elektrode met een rechte gouddraad in de verticale as van het gat waarin de AAV werd geïnjecteerd te schroeven, waardoor ten minste 2,5 millimeter schroef buiten de schedel achterblijft om de schade aan de dura en de hersenschors te minimaliseren. Gebruik een pen om de positie van de referentieelektrode te markeren 2,6 millimeter zijdelings rechts naar de middellijn en 0,7 millimeter posterior naar bregma en de positie van de achterste elektrocardiografische elektrode op 1,5 millimeter zijdelings rechts naar de middellijn en 1,5 millimeter voor op lambda en de posities van drie onderhoudsschroeven op de linkerhersenhelft zonder specifieke coördinaten, maar zo ver mogelijk van elkaar en van de elektrocorticografische elektroden.

Gebruik de boor om de schedel voorzichtig loodrecht op het schedeloppervlak te doorboren op de gemarkeerde posities van de andere elektroden en schroeven en was de doorboorde schedel met een 10% povidone jodiumoplossing. Blokkeer de gaten met kleine gerolde stukjes delicate taakveeg voordat u de schroeven installeert om bloedingen en verontreiniging te voorkomen en gebruik rechte Kelly-tangen om de schroeven in de boorgaten te steken onder dezelfde hoek als de gaten zijn doorboord. Plaats een paar kleine druppels tandcement in het midden van de ringachtige ruimte in de schroeven en gebruik extra fijne Graefe-tang om de huid boven de nekspieren op te tillen.

Houd met dumont nummer vijf tang het gebogen uiteinde van één elektromyografische elektrode vast en steek deze ongeveer één tot twee millimeter in de spieren. Plaats de gebogen zijde en het vouwpunt van de elektrode in het tandcement en plaats de tweede elektromyografische elektrode op dezelfde manier. Nadat u de ogen van het dier hebt bedekt, brengt u drie tot vijf minuten licht aan om het cement te stollen en gebruikt u extra tandcement om de basis van de elektrocorticografische elektroden en de ankerschroeven te bedekken om een kroonvormige contour te vormen.

Na het aanbrengen van nog drie tot vijf minuten licht, vult u het midden van de montage met acrylcement en verwijdert u de chirurgische klemmen. Gebruik een synthetische absorbeerbare monofilament hechtdraad om de huid aan de voor- en achterkant van de montage te sluiten, zodat de schedel niet wordt blootgesteld en gebruik gebogen tang om de connector boven de montage te houden om de gouden draden van de elektroden zorgvuldig uit te lijnen met de connectorpennen en soldeer vervolgens snel elke elektrode-extremiteit tot een enkele overeenkomstige connectorpen. Nadat u de muis uit het frame hebt verwijderd, bedekt u de lege ruimte tussen de connector en de kop met het acrylcement.

En plaats de muis na het wegen in een schone kooi met een deksel zonder mazen op een warmtekussen. Sluit de muizen twee weken na de operatie aan op opnamekabels en noteer ten minste een week later de elektrocorticografische en elektromyografische signalen gedurende 24 uur of langer. Een succesvolle infectie wordt bevestigd door HA-kleuring van de neuronen in de motorische cortex rond de injectieplaats, wat wijst op de aanwezigheid van cofiline S3D HA. Co-kleuring met de excitatory neuron marker CaMKII alpha duidt op heldere cofiline S3D HA en CaMKII alpha co-expressie onder hoge vergroting.

Log getransformeerde relatieve macht spectra voor wakkerheid, langzame golf slaap, en paradoxale slaap tonen staat-specifieke verschillen in spectrale activiteit onder cofiline inactivatie. De combinatie van elektrocorticografische opname en AAV-gemedieerde manipulatie van precieze moleculaire doelen is ook van toepassing op meerdere hersengebieden en op andere neurowetenschappelijke deelgebieden zoals onderzoek naar epilepsie of geheugen naast slaap.