Name: Een 3D Tail Explant-cultuur om gewervelde segmentatie bij zebravissen te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Leer een 3D staart-explantcultuurmethode voor het bestuderen van gewervelde segmentatie bij zebravisembryo's. Dit protocol maakt live-beeldvorming en manipulatie van morfogenen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken de AECOM Zebrafish Core Facility en Cincinnati Children's Veterinary Services voor visonderhoud, de Cincinnati Children's Imaging Core voor technische bijstand, Didar Saparov voor hulp bij videoproductie en Hannah Seawall voor het bewerken van het manuscript. Onderzoek dat in deze publicatie werd gerapporteerd, werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder awardnummer R35GM140805 to E.M.Ö. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van de National Institutes of Health.

Dit protocol omvat het gebruik van levende gewervelde embryo's jonger dan 1 dag na de bevruchting. Alle dierproeven werden uitgevoerd onder de ethische richtlijnen van cincinnati Children's Hospital Medical Center; dierprotocollen zijn herzien en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol # 2017-0048).
1. Embryo's verzamelen
<ol><li>Stel paren zebravissen op in kruisingstanks de avond voor de dag van de embryoverzameling. Gebruik barrières tussen paringsparen voor een nauwkeurige ensceneringscontrole van de embryoontwikkeling.</li>
	<li>Hef barrières op vóór de gewenste paaitijd en verzamel eieren binnen 15 minuten in een petrischaal van 100 mm.<ol>
<li>Reinig vuil van de Petrischaal. Als meer dan 50 embryo's uit één koppeling worden verzameld, splitst u de koppeling dienovereenkomstig in meerdere Petrischalen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer embryo's in vissysteemwater bij 28 °C tot ze 50% epiboly stadium bereiken (5 uur na de bevruchting). Een gestandaardiseerd embryogroeimedium zoals E3 kan ook worden gebruikt in plaats van het aquariumsysteemwater tot stap 3.2.<ol>
<li>Verwijder onbevruchte eieren onder een stereoscoop en verplaats de embryo's 's nachts naar een incubator van 23,5 °C (O/N). Embryo's moeten de ochtend na de ophaaldag om 8-10 somietenstadium zijn.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Gereedschapsvoorbereiding
<ol><li>Steriliseer het mes van de microchirurgie, naaldpunten (gebruikt voor dissectie van het weefsel) en glazen Pasteur pipet door 100% ethanol (EtOH) en brandbeglazing te weken.</li>
	<li>Gebruik twee lagen transparante tape (~ 100-120 μm dikte) op 25 mm x 75 mm microscoopglaasjes. Snijd vierkante putten van ~ 18 mm x 18 mm in het midden van de tapebekleding van elke dia met een scalpel.<ol>
<li>Veeg de voorbereide schuifkamers af met 70% EtOH. Deze putten bevatten ~40 μL medium.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Monstervoorbereiding
<ol><li>Dechorionaatembryo's met behulp van de punt van twee naaldspuiten onder een stereoscoop. Breng embryo's over in een aparte petrischaal met water van het vissysteem om af te spoelen.</li>
	<li>Breng embryo's met een 6 cm petrischaal met dissectiemedium (Leibovitz-15 celkweekmedium met L-Glutamine zonder fenolrood, 0,8 mM CaCl2 en 1× antimycotische oplossing voor antibiotica over in een steriel glas met vuurglazuur( OPMERKING: Blijf een gesteriliseerde glazen pipet gebruiken voor alle overdrachten na deze stap.<ol>
<li>Gebruik een glazen petrischaal voor het uitplanten om polystyreenschilfers tijdens dissectie te voorkomen.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaats 50 μL weefselgroeimedium (dissectiemedium en 10% FBS) in de diakamer.</li>
	<li>Stabiliseer een embryo voor dissectie onder de stereoscoop met een naaldpunt op het snijpunt van het dooierweefsel in de buurt van de achterwervel.</li>
	<li>Om het embryonale weefsel stabiel te houden met een naald, gebruikt u het microchirurgische mes met het mes op 45° om het weefsel voorste naar de achterwervel uit elkaar te snijden en de dooier van het embryonale weefsel te pellen, beginnend bij de voorste en bewegend naar de staartknop (figuur 1A). OPMERKING: Zorg ervoor dat u het huidweefsel niet verliest tijdens het reinigen van de dooier. De huid zou gemakkelijk afschilferen als flankerend enkellaags elastisch weefsel rond het embryo tijdens de dissectie, dus het is gemakkelijk te herkennen.</li>
	<li>Zodra de dooier volledig uit het embryonale lichaam is verwijderd, snijdt u het flankerende huidweefsel uit de staartknop. Houd de laatst gevormde 3-4 somieten intact, snijd het meer voorste weefsel eruit (full-axis explant).<ol>
<li>De dooier moet er voornamelijk intact uit komen van deze procedure. In het geval van een gescheurde dooier kunnen aanzienlijke korrels dooier aan het ventrale oppervlak van het weefsel blijven gehecht. Gebruik dan een wimpergereedschap om de resterende dooierkorrels voorzichtig af te reinigen. OPMERKING: Een onbalans van huidweefsels aan de zijkanten van een explant zou het weefsel niet in staat stellen een rechte groeirichting te behouden. De explant buigt in plaats daarvan naar de zijkant van een meer uitgerekte huid. Deze onbalans kan onder de stereoscope worden gecorrigeerd door de huidlaag te scheuren met behulp van een microchirurgische mes.</li>
		<li>Voor huidloze explants, druk op een punt van de huidlaag met naald en pel het weefsel explant af met het microchirurgische mes. Deze explants zullen hun lichaamsas in cultuur niet verlengen.</li>
		<li>Naast de full axis explants kunnen bij deze stap alternatieve explants worden gemaakt. Ontleed bijvoorbeeld reeds gesegmenteerde somieten met behulp van het microchirurgische mes (full-PSM explants) of ontleed de PSM in zijn halve anteroposterior (half-PSM explants). Zie punt 5.1 voor de toepassing van dergelijke alternatieve explants.</li>
	</ol></li>
	<li>Breng de ontlede explant onmiddellijk over op een afdeklip van 22 mm x 22 mm waarop de beeldvorming zal worden uitgevoerd.<ol>
<li>Plaats de explant plat op de dorsoventrale as, de ventrale zijde raakt de afdeklip (Figuur 1B). Verwijder voorzichtig de overtollige media rond de weefselexplant met behulp van een 20 μL gefilterde tippipet. OPMERKING: Vertraagde overdracht van ontleedde explants naar de afdeklip resulteert in vervormingen van het weefsel, omdat het wordt ontlast van de geometrische beperkingen van de dooier.</li>
	</ol></li>
	<li>Draai de afdeklip met de explant snel en voorzichtig over de met groeimedia gevulde schuifkamer.<ol>
<li>Om bellenvorming te voorkomen, plaatst u een kant van de vierkante afdeklip op de tapekamer en laat u de andere kant voorzichtig los. Zorg ervoor dat u de explant in deze stap niet beweegt/vervormt.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig overtollige mediabloedingen uit de kamer door op de schuifkamer op een laboratoriumweefsel te drukken. De afdeklip zal stabiel op de schuifkamer zitten voor live beeldvorming, vanwege de oppervlaktespanning van het vloeibare medium zonder enige afdichting.</li>
		<li>Gebruik voor langdurige cultivering (>6 uur) een grotere kamer. In dergelijke gevallen kunnen rechthoekige coverslips van 22 mm x 50 mm worden gebruikt, samen met twee parallelle rijstroken van tapelagen op dia's. Tussen twee tapebanen kan een ~1 mm brede opening worden gelaten om de luchttoegang tot het groeimedium te vergemakkelijken.</li>
	</ol></li>
	<li>Herhaal stap 3.3-3.8 om meer explants voor te bereiden. Voorbereide explants verlengen hun A-P lichaamsas met een gemiddelde snelheid van ~ 30 μm / h en segmenteren hun somieten met ~ 40 minuten intervallen bij 25 °C (Figuur 2A, Video 1).<ol>
<li>Voor niet-langwerpige explants, oefen zachte druk uit op de zijkanten van de dia en houd het monster in stap 3.8.2 terwijl u de overtollige media op een laboratoriumweefsel zuigt. Als alternatief kunnen explants worden gekweekt in diakamers met één tapelaag. Ook zal het chemisch activeren van het oppervlak van de diakamer met type I collageen resulteren in niet-langwerpige explants (Figuur 2B, Video 2).<ol>
<li>Voer van tevoren de coating van de kamer uit met type I-collageen door de schuifkamers volledig te bedekken met 15-20 ml prediluted collageenoplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Gebruik een laminaire stromingskap voor dit protocol om steriliteit te behouden. Spoel de kamers aan het einde voorzichtig af met dissectiemedium.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voor embryo's ouder dan 15 somietstadium monteert u het staart explantweefsel lateraal in plaats van een vlakke (dorsoventrale) mount (Video 3). Om spiertrekkingen te voorkomen, moet u 0,004% tricaïneoplossing in de cultuurmedia opnemen als verdovingsmiddel3.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Live beeldverwerving
<ol><li>Beeldmonsters op een dissectiebereik voor breedveldgetransmitteerde lichtbeeldvorming van somietsegmentatiegroottes en -perioden, of met gestructureerde verlichting/confocale/lichtbladmicroscopie met behulp van transgene reportervislijnen.</li>
	<li>Equilibreer de temperatuur van weefsel explants met de beeldvorming kamertemperatuur gedurende ten minste 15 minuten.<ol>
<li>Gebruik voor een nauwkeurigere temperatuurregeling een commercieel temperatuurregelingssysteem dat op een omgekeerde microscoop is gemonteerd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stel de beeldverwervingsframeintervallen in op 2 - 10 minuten, afhankelijk van het biologische proces van belang. OPMERKING: Zebravis somietsegmentatie is een snel proces, variërend van 20 - 55 minuten voor levensvatbare temperaturen van 30 °C tot 21,5 °C in hele embryo's. Explants zullen verlengen en segmenteren ~ 30% langzamer dan de hele embryo's.<ol>
<li>Let op om voldoende vertraging achter te laten tussen sets kanaalaanwinsten om mogelijke fototoxiciteit voor levend weefsel te voorkomen. Stel het weefsel niet meer dan de helft van de beeldvormingsduur bloot aan de excitatiestraal en verlaag de straalintensiteit zoveel mogelijk. OPMERKING: Accumulatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) is over het algemeen de belangrijkste oorzaak van fototoxiciteit in levende monsters4. Ascorbinezuur als ROS-aaseter kan worden aangevuld met groeimedium bij 4 mM-concentratie om de ROS-activiteit te bufferen en fototoxiciteit te verlichten. Nadelige effecten van fototoxiciteit kunnen moeilijk op te merken zijn tijdens live beeldvorming. Staart explants zijn voordelig in dit aspect, omdat sommige visuele markers van fototoxiciteit zoals mitotische arrestatie, belemmerde weefselontwikkeling (d.w.z. vorming van somieten, staartverlenging) en desintegrerend weefsel gemakkelijker op te merken zijn. Raadpleeg de verstrekte referentie4 voor een gedetailleerde bespreking.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik RNA in één celtraps geïnjecteerde embryo's om 4D-beelden te verkrijgen die bedoeld zijn om te worden gesegmenteerd en geanalyseerd in cellulair resolutieniveau.<ol>
<li>Gebruik 300 pg RNA uit in vitro getranscribeerd membranen en nucleaire fluorescerende reporter marker plasmiden zoals pCS-membrane-ceruleanFP (Addgene plasmide #53749) of pCS-memb-mCherry (Addgene plasmide #53750) in combinatie met pCS2+ H2B-mTagBFP2 (Addgene plasmide #99267) of pCS2+ H2B-TagRFP-T (Addgene plasmide #99271) in injecties. Voor een voorbeeldfilm met celmembraan en kernmarkeringen zie Video 4. OPMERKING: De gemiddelde celgrootte van PSM-weefsel is ongeveer ~ 5 μm in diameter, waarvan kernen ~ 3 - 4 μm omvatten. Een pixelgrootte van ~0,5 μm en een z-doorsnede van ~1 μm moeten worden geregistreerd voor een goede celsegmentatie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Immunostaining van staart explants
OPMERKING: Weefsels die zijn gekweekt na verschillende dissectiescenario's (langwerpig, niet-langwerpig, staartknop ontleed, halve PSM enz.) als plat gemonteerde staart explants5 kunnen worden teruggewonnen uit diakamers voor verdere immunostaining kwantificering van eiwitten van belang. Hier presenteren we het protocol dat wordt gebruikt voor di-fosforylated extracellulaire signaal gereguleerde kinase (ppERK) kleuring van explants als FGF-signalering gradiënt uitlezing.
<ol><li>Na de vorming van somieten tot het gewenste stadium, schuift u voorzichtig de deklip halverwege naar de hoek van de schuifkamer zonder op te tillen.</li>
	<li>Met behulp van ~100 μL aanvullend dissectiemedium in een glazen Pasteur pipet, haal je de explants van de glijbaan en breng je ze over in een 64-put celkweekplaat. OPMERKING: Vanaf deze stap kunnen alle oplossingsvervangingen worden uitgevoerd onder een dissectiebereik met een aparte glazen pipet voor vaste monsters. Dit zorgt ervoor dat er geen explantweefsels in putten verloren gaan of ze tussendoor worden overgedragen.</li>
	<li>Zuig na het overbrengen van alle explants het overmatige medium één voor één uit de putten en doe 100 μL 4% paraformaldehyde in PBS (PFA) in elke put. LET OP: PFA is een toxische oplossing met kankerverwekkende effecten. Tijdens het gebruik moet een goede PBM worden gebruikt.</li>
	<li>Bevestig explants in een 64-put plaat op kamertemperatuur gedurende 1 uur op een shaker.<ol>
<li>Weefsel explants zijn gevoeliger voor vervormingen dan hele embryo's. Pas de schudsnelheid dienovereenkomstig aan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Was het fixatief drie keer uit met 150 μL PBS-Tw (0,1% Tween20 in PBS). Verzamel de eerste wasbeurt in een specifieke "PFA Waste" container.</li>
	<li>Dehydrateer explant in stappen van 4×5 minuten door ~40 μL oplossing elke keer te vervangen door 100% methanol (MeOH). LET OP: MeOH is een giftige chemische stof die vluchtig en ontvlambaar is. Werk in een goed geventileerde ruimte en gebruik de juiste PBM voor de hantering.</li>
	<li>Als laatste stap van uitdroging, verwijder alle oplossing uit putten en vervang door 100 μL MeOH. Incubeer bij -20 °C gedurende 15 min. OPMERKING: Gebruik een specifieke "MeOH Waste" container om de oplossingen op te halen tot stap 5.11.</li>
	<li>Voeg 50 μL MeOH toe en schud 5 min op kamertemperatuur.</li>
	<li>Rehydrateer explants in stappen van 4×5 minuten door ~40 μL oplossing elke keer te vervangen door PBS-T (0,1% Triton-X 100 in PBS). Gebruik een specifieke "MeOH Waste" container om de oplossingen op te halen.</li>
	<li>Als laatste stap van rehydratatie, verwijder alle oplossing uit putten en vervang door 100 μL PBS-T.</li>
	<li>Voor weefselpermeabilisatie explants behandelen met 1,5% Triton-X 100 in PBS gedurende 20 min bij kamertemperatuur op de shaker.</li>
	<li>Wasmonsters met MAB-D-T (0,1% Triton-X 100 wasmiddel en 1% dimethylsulfoxide (DMSO) in 150 mM NaCl 100 mM maleïnezuurbuffer pH 7,5) 3×5 min. LET OP: DMSO is ontvlambaar en een giftig mutageen. Tijdens het gebruik moet een goede PBM worden gebruikt.</li>
	<li>Incubeer explants in 100 μL/well serumblokkerende oplossing (2% foetale runderserum in MAB-D-T) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Vervang alle blokkerende oplossing door 50-100 μL/put primaire antilichaamoplossing (1:1000 verdunning van monoklonaal muisantilichaam tegen ppERK in serumblok). Incubeer monsters O/N (>16 uur) bij 4 °C op shaker.</li>
	<li>Was de primaire antilichaamoplossing met MAB-D-T 5×5 min.</li>
	<li>Incubeer monsters in secundaire antilichaamoplossing (Alexa Fluor 597 geitenantimuis IgG2b (1:200) en Hoechst 33342 (1:5000) in MAB-D-T) O/N bij 4 °C op een shaker of gedurende 3 uur bij kamertemperatuur. OPMERKING: Bedek vanaf deze stap de 64-putplaat met aluminiumfolie om blootstelling aan secundaire met antilichamen behandelde monsters te voorkomen. LET OP: Hoechst 33342 is een potentieel kankerverwekkend. Tijdens het gebruik moet een goede PBM worden gebruikt.</li>
	<li>Was de secundaire antilichaamoplossing met PBS-Tw 3×5 min.</li>
	<li>Bevestig monsters met PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Was het fixatief met PBS-Tw en equilibreer monsters binnen 60% glycerol. Monteer explants op microscoopglaasjes met nagellak en 60% glycerol voor beeldvorming. Voor representatieve immunostaining resultaten zie figuur 3.</li>
</ol>

<ol><li>Assheton, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAssheton%2C+R+%22Growth+in+length%3A+Embryological+Essays%22">Growth in length: Embryological Essays</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (1916).</li>
<li>Gomez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+segment+number+in+vertebrate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of segment number in vertebrate embryos.</a> Nature. 454 (7202), 335-339 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%2C+3rd+edition%22">The Zebrafish Book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), 3rd edition</a>. , University of Oregon Press. Oregon. (1995).</li>
<li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy%2C+and+how+to+avoid+it%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (1700003), (2017).</li>
<li>Simsek, M. F., Ozbudak, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+fold+change+of+Fgf+signaling+encodes+positional+information+for+segmental+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Spatial fold change of Fgf signaling encodes positional information for segmental determination in zebrafish.</a> Cell Reports. 24 (1), 66-78 (2018).</li>
<li>Dubrulle, J., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fgf8+mRNA+decay+establishes+a+gradient+that+couples+axial+elongation+to+patterning+in+the+vertebrate+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">fgf8 mRNA decay establishes a gradient that couples axial elongation to patterning in the vertebrate embryo.</a> Nature. 427 (6973), 419-422 (2004).</li>
<li>Diez del Corral, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+FGF+and+Retinoid+Pathways+Control+Ventral+Neural+Pattern%2C+Neuronal+Differentiation%2C+and+Segmentation+during+Body+Axis+Extension%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Opposing FGF and Retinoid Pathways Control Ventral Neural Pattern, Neuronal Differentiation, and Segmentation during Body Axis Extension.</a> Neuron. 40 (1), 65-79 (2003).</li>
<li>Stern, H. M., Hauschka, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tube+and+notochord+promote+in+vitro+myogenesis+in+single+somite+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural tube and notochord promote in vitro myogenesis in single somite explants.</a> Developmental Biology. 167 (1), 87-103 (1995).</li>
<li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Developmental Dynamics. 228 (3), 464-474 (2003).</li>
<li>Picker, A., Roellig, D., Pourquié, O., Oates, A. C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+micromanipulation+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Tissue micromanipulation in zebrafish embryos.</a> Methods in molecular biology. 546 (11), 153-172 (2009).</li>
<li>Manning, A. J., Kimelman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx16+and+Msgn1+are+required+to+establish+directional+cell+migration+of+zebrafish+mesodermal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tbx16 and Msgn1 are required to establish directional cell migration of zebrafish mesodermal progenitors.</a> Developmental Biology. 406 (2), 172-185 (2015).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139, 3242-3247 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets openbaar te maken en verklaren geen belangenconflicten.

Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol van een weefselkweek explant techniek die we onlangs hebben ontwikkeld en gebruikt5 voor zebravis embryo's. Onze techniek bouwt voort op de vorige explantmethoden in kuiken8 en zebravis9,10,11 modelorganismen. Staart explants bereid met dit protocol kunnen overleven zolang >12 uur in een eenvoudige diakamer, blijven verlengen van d...

Metamerische segmentatie van organismen wordt veel gebruikt in de natuur. Herhaalde structuren zijn essentieel voor de functionaliteit van laterale organen zoals wervels, spieren, zenuwen, bloedvaten, ledematen of bladeren in een lichaamsplan1. Als gevolg van dergelijke fysiologische en geometrische beperkingen van de axiale symmetrie, de meeste phyla van Bilateria-zoals anneliden, geleedpotigen, en chordaten-vertonen segmentatie van hun embryonale weefsels (bijv. ectoderm, mesoderm) antero-posteriorly.
Gewervelde embryo's segmenteren hun paraxiale mesoderm langs de hoofdas van het lichaam achtereenvolgens in somieten met soortspecifieke intervallen, tellingen en grootteverdelingen. Ondanks deze robuustheid tussen individuele embryo's binnen een soort, is somietsegmentatie veelzijdig tussen gewervelde soorten. Segmentatie vindt plaats in een uitgebreid regime van tijdsintervallen (van 25 min in zebravissen tot 5 uur bij mensen), maten (van ~20 μm in staart somieten van zebravissen tot ~200 μm in stam somieten van muizen) en tellingen (van 32 in zebravissen tot ~300 in maïsslangen)2. Interessanter is dat visembryo's zich kunnen ontwikkelen in een breed scala aan temperaturen (van ~ 20,5 °C tot 34 °C voor zebravissen) terwijl ze hun somieten intact houden met de juiste grootteverdelingen door zowel segmentatie-intervallen als axiale reksnelheden te compenseren. Naast dergelijke interessante kenmerken blijft zebravis een nuttig modelorganisme om segmentatie bij gewervelde dieren te bestuderen vanwege de externe, synchrone en transparante ontwikkeling van een plenitude van embryo's van broers en zussen en hun toegankelijke genetische hulpmiddelen. Vanuit microscopieperspectief ontwikkelen teleostembryo's zich op een omvangrijke bolvormige dooier, die het gastrulerende weefsel eromheen uitrekt en rondt (figuur 1A). In dit artikel presenteren we een afgeplatte 3D-weefsel explantcultuur voor zebravisstaarten. Dit explantsysteem omzeilt de bolvormige beperkingen van dooiermassa, waardoor toegang wordt verstondkbaar tot live beeldvorming met hoge resolutie van visembryo's voor somietpatronen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61981/61981fig01.jpg"> Figuur 1: Slide Chamber Explant System for Zebrafish Embryos. (A) Zebravisembryo's hebben voordelen voor levende beeldvorming, zoals de transparantie van gastrulerend embryonaal weefsel (blauw), maar het weefsel vormt zich rond een omvangrijke bolvormige dooiermassa (geel) die beeldvorming met een hoge resolutie in intacte embryo's voorkomt. Staart explants kunnen worden ontleed beginnend met een microchirurgische mes (bruin) gesneden uit het weefsel voorste van somieten (rood) en verder op de grens met de dooier posteriorly. (B) Ontlede staart explants kunnen op een afdeklip (lichtblauw) dorsoventrally worden geplaatst; het houden van neuraal weefsel (lichtgrijs) aan de bovenkant en notochord (donkergrijs) aan de onderkant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61981/61981fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td>REF 309597</td><td>voor het dechorioneren van embryo's en manipulaties</td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol, Anhydrous</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td>voor immunokleuring</td></tr><tr><td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&times;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>voor weefseldisseratie media</td></tr><tr><td>Calcium Chloride Anhydrous, Powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>499609</td><td>voor weefseldisseratie media</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>voor immunokleuring</td></tr><tr><td>Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel</td><td>Integra-Miltex</td><td>MIL4-411</td><td>voor het voorbereiden van tape slide wells</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td><td>(optioneel) voor het verdoven van weefsels ouder dan 20 somites-stadium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>A3160601</td><td>extra voor weefselkweek media</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>Cat#A-21145; RRID: AB_2535781</td><td>secundaire antilichaam voor immunokleuring</td></tr><tr><td>L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red</td><td>GIBCO</td><td>21083-027</td><td>voor weefseldisseratie media</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337</td><td>voor immunokleuring</td></tr><tr><td>Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade</td><td>Surgical Specialties</td><td>72-2863</td><td>voor weefseldisseratie</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-ppERK</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#M8159; RRID:AB_477245</td><td>voor ppERK immunokleuring</td></tr><tr><td>NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>R37106</td><td>(optioneel) voor live kleuring van celkernen</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Powder, 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>voor het fixeren van monsters voor immunokleuring</td></tr><tr><td>Rat Tail Collagen Coating Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>122-20</td><td>(optioneel) voor het chemisch activeren van slide kamers</td></tr><tr><td>Stage Top Incubator</td><td>Tokai Hit</td><td>tokai-hit-stxg</td><td>(optioneel) voor temperatuurcontrole tijdens live beeldvorming</td></tr><tr><td>Transparent Tape 3/4''</td><td>Scotch</td><td>S-9782</td><td>voor het voorbereiden van tape slide wells</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>voor immunokleuring</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>voor immunokleuring</td></tr><tr><td>Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP)</td><td>Campbell et&nbsp;al., 2015</td><td>ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4</td><td>transgene vis met nucleair gelokaliseerde EGFP</td></tr><tr><td>Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)</td><td>Cooper et&nbsp;al., 2005</td><td>ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75</td><td>transgene vis met op de celmembraan gelokaliseerde EGFP</td></tr></tbody></table>

een 3d tail explant-cultuur om gewervelde segmentatie bij zebravissen te bestuderen

A 3-D Tail Explant Culture to Study Vertebrate Segmentation in Zebrafish

Gewervelde embryo's patroon hun belangrijkste lichaamsas als repetitieve somieten, de voorlopers van wervels, spieren en huid. Somieten segmenteren geleidelijk van het presomitische mesoderm (PSM) terwijl het staarteinde van het embryo achterstedig verlengt. Somieten vormen zich met regelmatige periodiciteit en schaal in grootte. Zebravis is een populair modelorganisme omdat het genetisch tracteerbaar is en transparante embryo's heeft die levende beeldvorming mogelijk maken. Niettemin worden tijdens somitogenese visembryo's om een grote, rondende dooier gewikkeld. Deze geometrie beperkt de levende beeldvorming van PSM-weefsel in zebravisembryo's, met name bij hogere resoluties die een nauwe objectieve werkafstand vereisen. Hier presenteren we een afgeplatte 3D-weefselkweekmethode voor levende beeldvorming van zebravisstaart explants. Staart explants bootsen intacte embryo's na door een proportionele vertraging van de verlenging van de as en verkorting van rostrocaudal somietlengtes. We zijn verder in staat om de verlengingssnelheid van de as door de explantcultuur te vertragen. Dit stelt ons voor het eerst in staat om de chemische input van signaalgradiënten te ontwarren uit de mechanistische input van axiale rek. In toekomstige studies kan deze methode worden gecombineerd met een microfluïdische opstelling om tijdgestuurde farmaceutische verstoringen of screening van gewervelde gewervelde segmentatie mogelijk te maken zonder problemen met de penetratie van geneesmiddelen.

Dit protocol maakt vlakke geometrische cultivering van levende zebravisstaart explants mogelijk. Weefselkweek biedt drie grote voordelen ten opzichte van hele embryo's: 1) controle van de verlengingssnelheid van de as, 2) controle over verschillende signaalbronnen (morfogene) door eenvoudige dissectie, en 3) bijna-objectieve, hoge vergroting en hoge NA live beeldvorming.
Chemisch onbehandelde schuifkamers zorgen ervoor dat de staart explant zijn hoofdas kan verlengen (figu...

Hier presenteren we het protocol voor 3D-weefselkweek van de achterste lichaamsas van zebravissen, waardoor live studie van gewervelde segmentatie mogelijk is. Dit explantmodel biedt controle over de verlenging van de as, wijziging van morfogene bronnen en live beeldvorming op weefselniveau op subcellulair resolutieniveau.

Een 3D Tail Explant-cultuur om gewervelde segmentatie bij zebravissen te bestuderen

Vertebrate embryos pattern their major body axis as repetitive somites, the precursors of vertebrae, muscle, and skin. Somites progressively segment from ...

3D zebravis staart explants laten we de transparantie van zebravisembryo's ten volle benutten tijdens somietontwikkeling en gewervelde segmentatie. Vul een lege paringstank met vissysteemwater. Reinig de zeef met systeemwater.Hef de barrières tussen paringsparen op. Verplaats het vispaar selectief in de zoetwatertank. Verzamel embryo's in de zeef door wateroverdrachten met een lege tank.Spoel verzamelde embryo's af met vissysteemwater en draai een petrischaaltje om. Ethanol-glazuur dissectie gereedschap. Maak twee lagen tapes op dia's.Snijd de horizontale zijden van diepe kamers door. Complete kamersneden met verticale zijkanten. Verwijder de tape van het kameroppervlak.Giet celkweekmedia in een buis. Meng calciumchloride 2,8 millimoll eindconcentratie. Voeg antibiotica-oplossing toe.Aliquot dissectie media in een aparte buis. Compliment foetale runderserum om weefselkweekmedium te maken. De-corrinate embryo's met naalden.Spoel de embryo's af in een zoetwaterschaal en verzamel ze voor explanting. Stabiliseer het embryo met de naald en begin te onjokken. Knip de overgebleven tissues eraf.Breng de explants over op de afdeklip. Maak het weefsel plat en zuig overtollige media eruit met pipet. Plaats de afdeklip op groeimedium met schuifkamer.Leg het explantweefsel op een tissuedoekje. Breng dompelolie aan op het doel. Monteer de schuifkamer op de microscoop.Pas laserkanalen aan voor beeldverwerving. Controleer de z-laaglimieten van het monster. Instellen van tijdbeeldvorming en z-lagen.3D staart explant systeem houdt celintegratie aan staartknop en overtollige rek intact als hele embryo's. Het is ook mogelijk om overtollige rek te stoppen door het oppervlak chemisch te activeren met type één collageen. 3D zebravis staart explants systeem stelt ons in staat om de transparantie van zebravis embryo's te benutten door ons in staat te stellen hoge resolutie en bijna objectieve microscopie beelden te nemen.Daarnaast kunnen we de overmaat aan rek loskoppelen van morfogene signalering en ook de morfogene signaalbronnen controleren met eenvoudige dissectiemethoden.

a-3-d-tail-explant-culture-to-study-vertebrate-segmentation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Somitogenesis is een ritmische ontwikkelingsproces dat ruimtelijk patronen het lichaam as van gewervelde embryo's. Eerder ontwikkelden we transgene zebravis lijnen die fluorescerende verslaggevers gebruiken om de cyclische genen die dit proces sturen observeren. Hier hebben we cultuur verspreid cellen van deze lijnen en het imago van hun oscillaties in de tijd in vitro.

Generatie Dispersed presomitische Mesoderm Cell Cultures for Imaging van de zebravis Segmentatie Klok in enkele cellen

Processen als proliferatie, patroon, differentiatie en axon begeleiding kan gemakkelijk worden gemodelleerd in de zebravis ruggenmerg. In dit artikel beschrijven we een montageprocedure voor zebravis embryo's die visualisatie van deze gebeurtenissen optimaliseert.

Dissectie en horizontale bevestiging van de zebravis embryo&#39;s: Analyse van Spinal Cord Development

Omdat veel zebravismodellen van neurologische en niet-neurologische ziekten worden bestudeerd in de volwassen vissen dan het embryo / larven ontwikkelden we een kwantitatieve dwarslijn regeneratieve test die kan worden toegepast bij de zebravis ziektemodellen volwassene. De test betrokken resolutie bij de 1) neuromast en 2) individuele haar cel niveaus.

Een test voor laterale lijn Regeneration in Adult zebravis

We presenteren een protocol voor het vastleggen van de dynamica van regeneratie van de staartvin van zebravislarven op een volledige weefselschaal met behulp van stereomicroscopie op basis van helder veld. Deze techniek maakt het mogelijk om de regeneratiedynamica met een enkele celresolutie vast te leggen. Deze methodologie kan worden aangepast aan elke stereomicroscoop uitgerust met een CCD-camera en time-lapse software.

Vastleggen van Tissue Repair in zebravis Larven met Time-lapse Helderveld stereomicroscopie

De zebravis is een uitstekend modelsysteem voor genetische en ontwikkelingsstudies. Het implanteren van kralen is een waardevolle techniek voor weefselmanipulatie die kan worden gebruikt om ontwikkelingsmechanismen te onderzoeken door veranderingen in lokale cellulaire omgevingen te introduceren. Dit protocol beschrijft hoe microkralenimplantatie in de zebravis-embryo moet worden uitgevoerd.

Microkraal Implantatie in de zebravis embryo

Hier presenteren we een veelzijdige montagemethode die langetermijn tijds-gelaps beeldvorming mogelijk maakt van de ontwikkeling van het achterste lichaam van levende zebravisembryo's zonder de normale ontwikkeling te verstoren.

Een veelzijdige Montage Methode voor de lange termijn beeldvorming van ontwikkeling van de zebravis

Hier beschrijven we een methode om de grootte van zebravis embryo's te verkleinen zonder de normale ontwikkelingsprocessen te verstoren. Deze techniek maakt de studie van het patroon schalen en ontwikkelingsstoornissen robuustheid tegen grootte te veranderen.

Chirurgische grootte vermindering van zebravis voor de studie van het embryonale patroon schrapen

Hier beschrijven we computationele hulpmiddelen en methoden die visualisatie en analyse van drie- en vierdimensionale beeldgegevens van muizenembryo's mogelijk maken in de context van axiale elongatie en segmentatie, verkregen door into optische projectietomografie en door live beeldvorming en whole-mount immunofluorescentiekleuring met behulp van multifotonenmicroscopie.

Drie- en vierdimensionale visualisatie- en analysebenaderingen om gewervelde axiale rek en segmentatie te bestuderen

Zebravis blastoderm explantaten worden gegenereerd door embryonale cellen te isoleren van endogene signaleringscentra in het vroege embryo, waardoor relatief naïeve celclusters worden geproduceerd die gemakkelijk ex vivokunnen worden gemanipuleerd en gekweekt. Dit artikel geeft instructies voor het maken van dergelijke explants en toont hun nut aan door rollen te onderzoeken voor nodale signalering tijdens gastrulatie.

Generatie van naïeve Blastoderm Explants uit Zebravis Embryo's

Hier presenteren we een effectief, eenvoudig en snel 3D-kweekprotocol voor de vorming van sferoïden van twee zebravissen (Danio rerio) cellijnen: ZEM2S (embryo) en ZFL (normale hepatocyt).

Een 3D-kweekmethode van sferoïden van embryonale en lever zebraviscellijnen

Leer een 3D staart-explantcultuurmethode voor het bestuderen van gewervelde segmentatie bij zebravisembryo's. Dit protocol maakt live-beeldvorming en manipulatie van morfogenen mogelijk.

Een 3D Tail Explant-cultuur om gewervelde segmentatie bij zebravissen te bestuderen

Meer video's verkennen