Covalente etikettering met diethylpyrocarbonaat voor het bestuderen van eiwitstructuur in hogere orde door massaspectrometrie

Het karakteriseren van een eiwitstructuur is essentieel voor het begrijpen van de functie ervan. Massaspectrometrie is naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel voor dit doel, vooral voor eiwitsystemen die moeilijk te bestuderen zijn met traditionele methoden. Om een eiwitstructuur te bestuderen op massaspecificatie, worden specifieke chemische reacties uitgevoerd in oplossing die een eiwit structurele informatie in zijn massa codeert.

Een bijzonder effectieve aanpak is het gebruik van reagentia die covalent wijzigen bij het oplossen van toegankelijke zijketens van aminozuren. Deze reacties leiden tot massatoestijgingen die kunnen worden gelokaliseerd met residuniveauresolutie in combinatie met proteolytische spijsvertering en tandemmassaspectrometrie. Hier beschreven we de protocollen die verband houden met het gebruik van diethylpyrocarbonaat of DEPC als een covalent labelreagens samen met massaspecificatiedetectie.

DEPC is een zeer elektrofiele molecule die tot 30% van de residuen in het gemiddelde eiwit kan labelen, waardoor een uitstekende structurele resolutie wordt geboden. DEPC is met succes gebruikt in combinatie met massaspecificaties om structurele informatie te verkrijgen voor veel verschillende eiwitten. Begin met het bereiden van een gebufferde oplossing van uw eiwit van belang bij een concentratie in het bereik van tientallen micromolaren.

We gebruiken vaak een 10 millimolar pH 7.4 MOPS buffer. Als alternatief kan een bestaande eiwitoplossing bufferuitwisseling in MOPS of een andere buffer zijn als het oorspronkelijke monster een buffer bevat met nucleofiele functionele groepen. Het is noodzakelijk dat de buffer geen nucleofiele functionele groepen heeft omdat ze de DEPC-eiwitreactie verstoren.

Bereid in een andere microbuis een stamoplossing van 100 millimolER DEPC in droog acetonitril. Het bereiden van de stamoplossing in droog acetonitril is noodzakelijk om hydrolyse van DEPC te voorkomen. Bereid in een nieuwe microbuis een oplossing van één molaire imidazol in HPLC-water.

Meng in een nieuwe microtube de MOPS-buffer en de eiwitoplossing. Voeg aan het eiwit en de buffer een aliquot van de DEPC-voorraadoplossing toe en zorg ervoor dat deze goed wordt gemixt voordat u het reactiemengsel gedurende één minuut in een waterbad van 37 graden Celsius plaatst. Het volume van de GEBRUIKTE DEPC-voorraadoplossing moet worden gekozen op basis van de uiteindelijke gewenste DEPC-eiwitconcentratieverhouding.

Er is niet één set DEPC- en eiwitconcentraties die met elk eiwit zal werken, hoewel de optimale DEPC-concentratie kan worden geschat op basis van het aantal oplosmiddel toegankelijke histidine- en lysineresiduen in het eiwit. Opgemerkt moet worden dat het toegevoegde volume acetonitril, dat in feite het volume van de toegevoegde DEPC-oplossing is, niet groter mag zijn dan 1% van het totale reactievolume om verstoring van de eiwitstructuur tijdens de reactie te voorkomen. De reactietijd is uiteindelijk aan de gebruiker, hoewel een reactie van één minuut onder de voorbeeldconditie de etikettering van het eiwit en hydrolyse van de DEPC minimaliseert.

Nadat een minuut is verstreken, dooft u de reactie door de imidazol toe te voegen om de resterende op de gereageerde DEPC op te ruimen. Ervoor zorgen dat de uiteindelijke concentratie van imidazol 50 keer de DEPC-concentratie is. Om de residuen te identificeren die door DEPC zijn gewijzigd, moet het eiwit proteolytisch worden verteerd tot peptidefragmenten.

Kies voor de spijsvertering omstandigheden die vatbaar zijn voor eiwitten van belang. Veel voorkomende stappen die hier worden beschreven, zijn het ontvouwen van eiwitten en vervolgens het verminderen en alkyleren van disulfidebindingen, zodat de spijsverteringsefficiëntie kan worden verbeterd. Onze ervaring is dat het ontvouwen van het eiwit met een denaturant en warmte voorafgaand aan de spijsvertering de efficiëntie van de spijsvertering verbetert.

Terwijl eiwitten worden uitgevouwen, vergelijkt u oplossingen van TCEP en iodoacetamide in een geschikte spijsverteringsbuffer. TCEP moet worden gebruikt als reductiemiddel in plaats van dithiothreitol of DTT omdat DTT kan reageren met DEPC gemodificeerde residuen. Alkylering van de resulterende bestanden na reductie is essentieel om label scrambling te voorkomen waarin vrije bestanden en het eiwit reageren met gemodificeerde aminozuren.

Zodra de uitvouwstap is voltooid, vermindert u disulfidebindingen door TCEP aan het reactiemengsel toe te voegen en laat u het drie minuten reageren bij kamertemperatuur. Voeg na reductie iodoacetamide toe aan het reactiemengsel, laat het 30 minuten reageren bij kamertemperatuur in het donker. Hier bereikt door het reactiemengsel in een doos te plaatsen.

De uiteindelijke concentratie iodoacetamide moet het dubbele zijn van de concentratie die wordt gebruikt voor TCEP of 80 keer de eiwitconcentratie of disulfidebinding. Bereid het enzym van belang, meestal trypsine of chymotrypsine volgens de specificaties van de fabrikant. Na het bereiden van het enzym van keuze, begin de spijsvertering en incubeer het reactiemengsel op 37 graden Celsius.

Een 10:1 eiwit/enzym verhouding met een drie uur durende spijsvertering met behulp van geïmmobiliseerde enzymen is meestal een goede keuze voor DEPC gelabelde eiwitten. Na de spijsvertering moet het monster onmiddellijk worden geanalyseerd door LC-MS/MS of worden bevroren met vloeibare stikstof om de afbraak van het monster en het verlies van het etiket tot een minimum te beperken. Standaard LC-MS/MS-parameters voor bottom-up proteomica kunnen worden gebruikt om gelabelde locaties op de proteolytische peptidefragmenten te identificeren.

De omgekeerde fase C18 stationaire fase moet worden gebruikt om de beste scheiding van peptiden te bereiken. Onze ervaring is dat capillaire LC betrouwbaardere kwantitatieve informatie biedt over modificatieniveaus dan nano LC vanwege de hogere gebruikte monsterhoeveelheden. Een typische LC mobiele fase die wordt gebruikt om DEPC gelabelde peptiden te scheiden bestaat uit twee oplosmiddelen.

Oplosmiddel A is water met 0,1% mierenzuur en oplosmiddel B is een acetonitril met 0,1% mierenzuur. Er wordt een verloop-elutie gebruikt en de scheidingstijd kan worden geoptimaliseerd op basis van de complexiteit van het monster. Een massaspectrometer die in staat is om online LC-MS en MS/MS te doen, is vereist om DEPC-modificatiesites op de peptiden te identificeren.

In onze experimenten hebben we met succes verschillende soorten massaspectrometers gebruikt. We hebben ontdekt dat een Thermo Orbitrap Fusion uitstekende resultaten biedt, hoewel elke massaspectrometer die in staat is om automatisch MS / MS van veel peptiden uit te voeren tijdens een LC-MS-analyse geschikt zou moeten zijn. HPLC-omstandigheden en massaspectrometrische parameters moeten voorafgaand aan de meting correct worden ingesteld.

Als het monster is bevroren, moet het vlak voor de analyse worden ontdooid. Doe je best om de tijd tussen monstervoorbereiding en HPLC-injectie te minimaliseren. Laad en injecteer het verteerd gelabeld eiwitmonster in het LC-systeem en start de LC-MS/MS-acquisitie of DEPC-labellocatie-identificatie en piekgebiedkwantificering, er bestaan meerdere methoden.

Op Thermo Fisher instrumenten, excalibur of proteome discoverer misschien gebruikt. Stel de juiste parameters in voor peptide-identificatie in een programma. DEPC-toevoeging en carbamidomethylatie zijn opgenomen als variabele modificaties die residuen helpen of worden toegewezen.

Chromatografische piekgebieden van gewijzigde en ongewijzigde versies van de peptiden worden gebruikt om wijzigingspercentages van het residuniveau te bepalen. DEPC-etikettering met MS-detectie is ook een waardevol hulpmiddel voor het karakteriseren van structurele veranderingen in eiwitten in hogere orde. Uit onze studie kan DEPC covalente etikettering specifieke eiwitgebieden identificeren die structurele veranderingen ondergaan bij thermische en oxidatieve stress.

In de figuur worden significante veranderingen in wijzigingspercentages weergegeven in blauw voor de afname van etikettering en rood voor de toename van etikettering, terwijl residuen zonder significante etiketteringsveranderingen in lichtgroen worden weergegeven. Bijvoorbeeld, nadat bèta-2 microglobuline wordt blootgesteld aan hittestress, veel residuen die aanzienlijke dalingen in etiketteringsomvang ondergaan, N-terminus, serine 28, histidine 31, serine 33, serine 55, serine 57 en lysine 58 zijn dichter dan één kant van het eiwit wat suggereert dat dit gebied van het eiwit een bevestigingsverandering ondergaat of mogelijk aggregatie bemiddelt. Nadat het eiwit is blootgesteld aan oxidatieve stress, verschillende residuen met een afname van de etikettering, serine 11, histidine 13, lysine 19, lysine 41 en lysine 94 uit een cluster op een andere fase van het eiwit die aangeeft dat de oxidatie geïnduceerde confirmationele verandering elders optreedt.

Deze studie heeft belangrijke implicaties voor eiwittherapeutische geneesmiddelen, die momenteel het snelst groeiende segment van de farmaceutische markt zijn. Ander werk van onze groep heeft ook aangetoond dat DEPC covalente labeling mass spec plaatsen van confirmationele veranderingen in gestreste monoklonale antilichaamtherapieën kan detecteren en identificeren. Zoals u kunt zien, is covalente etikettering met DEPC eenvoudig experimenteel te implementeren, maar kan het waardevolle structurele informatie voor eiwitten bieden.

De structurele resolutie van DEPC-labeling mass spec is bescheiden in vergelijking met de technieken zoals röntgenkristallografie en NMR, maar het is vatbaar voor bijna elk eiwit, ongeacht de grootte of het vermogen om te worden gekristalliseerd. DEPC covalent labeling mass spec werkt ook met eiwitmengsels en kan werken met zeer gecompliceerde monstertypes, zoals cellysaat en het haCat-cellen. Na het bekijken van deze video zijn we ervan overtuigd dat u DEPC-etikettering een nuttig hulpmiddel zult vinden voor het karakteriseren van de eiwitstructuur.