High-Content Screening Differentiatie en Rijpingsanalyse van foetale en volwassen neurale stamcel-afgeleide oligodendrocyten precursor celculturen

Het protocol combineert leeftijdsspecifieke isolatie van van neurale stamcellen afgeleide spontane gemengde culturen die differentiërende oligodendrocytenvoorlopercellen en astrocyten bevatten, assays die pathologische omstandigheden nabootsen en robuuste, hooggehalte uitlezingen. Deze kenmerken maken het mogelijk om ontwikkelingsmyelinisatie en volwassen remyelinisatie differentieel te bestuderen in fysiologische en pathologische omstandigheden en in een micro-omgeving die rekening houdt met de bijdrage van astrocyten. Voor neurale stamcelisolatie vanaf embryonale dag 13,5 tot 14,5 foetale voorhersenen, plaats de hoofden van de embryo's in een schone petrischaal met ijskoude PBS en gebruik een tang om de huid onder vergroting van de schedel te verwijderen.

Zodra de hersenen zichtbaar zijn en van de huid zijn ontdaan, gebruikt u een tang om de hersenen uit de schedel te persen en het cerebellum te verwijderen. Gebruik de tang om de hersenvliezen te verwijderen en plaats het geïsoleerde weefsel in de niet-enzymatische dissociatiebuffer. Wanneer al het hersenweefsel is geïsoleerd, trekt u twee tot drie monsters in 150 microliter niet-enzymatische dissociatiebuffer per buis van 1,5 milliliter en incubeert u de buizen gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius met continu schudden.

Voeg aan het einde van de incubatie 850 microliter standaardmedium toe aan elke buis en pipet om te mengen totdat de suspensie vrij is van klonten. Als niet-gedissocieerd weefsel nog steeds zichtbaar is, laat de monsters dan twee minuten rusten om de weefsels naar de bodem van de buizen te laten bezinken. Wanneer de dissociatie is voltooid, plaatcellen met een dichtheid van 10 tot 50 cellen per microliter in 10 tot 30 milliliter neurosfeermediumconcentratie in een T25- of T45-kolf en plaats de kolf in de celkweekincubator in een verticale positie om celaanhechting te voorkomen.

van 2,5 maanden oude volwassen muizen, plaats hersenen van vier tot vijf volwassen muizen in een 50-milliliter buis ijskoude HBSS en plaats één brein, ventrale kant naar beneden, in de rostrale-caudale richting op een steriele met aluminiumfolie bedekte kolf gevuld met minus 20 graden Celsius 's nachts koud water. Gebruik een scheermesje om de olfactorische bollen te verwijderen en om twee tot drie coronale plakjes van een millimeter dik van de cortex naar het optische chiasma te snijden. Plaats de plakjes op het koude oppervlak in een ventro-dorsale positie en identificeer het corpus callosum en de twee laterale ventrikels.

Gebruik vergroting, isoleer de wanden van de laterale ventrikels, zorg ervoor dat er geen stukjes van het corpus callosum worden opgenomen en plaats het geïsoleerde weefsel in vijf tot 10 milliliter enzymatische dissociatiebuffer gedurende een incubatie van 15 minuten bij 37 graden Celsius. Pipetteer de weefsels aan het einde van de incubatie minstens 50 keer voordat u de monsters nog eens 10 minuten bij 37 graden Celsius incubeert. Neutraliseer aan het einde van de incubatie de trypsine met vijf milliliter standaard kweekmedium en filter de weefselsuspensie door een filter van 70 micron.

Centrifugeer de gefilterde oplossing gedurende vijf minuten bij 400 maal g en suspensie de pellet opnieuw in sucrose-oplossing voor een tweede centrifugering. Aan het einde van de centrifugatie suspensuspensie de pellet opnieuw in runderserumalbuminewasoplossing voor een andere centrifugatie, suspensuspensie vervolgens de pellet opnieuw in standaard kweekmedium voor het tellen en plaats de cellen in een rechtopstaande T-25- of T-45-kolf. Voeg voor primaire neurosfeerdifferentiatie om de twee dagen basisfibroblast- en endotheelgroeifactoren toe aan de neurale stamcelcultuur.

Wanneer de neurosferen een diameter van 100 tot 500 micron bereiken, passeren de cellen door mechanische dissociatie volgens standaardprotocollen. Voor oligosfeerdifferentiatie, behandel de cellen met basische fibroblast groeifactor in bloedplaatjes-afgeleide factor-AA om de twee dagen. Wanneer de oligosferen een diameter van 100 tot 150 micron bereiken, dissociëren de bollen door mechanische dissociatie volgens standaardprotocollen en zaaien de celsuspensie met een dichtheid van 3000 cellen per vierkante centimeter op poly-DL-ornithine laminine gecoate platen.

Vervang na drie dagen het supernatant van elke cultuur door hetzelfde volume oligodendrocytendifferentiatiemedium. Om een ontstekingsgemedieerde differentiatieblokinductie uit te voeren, voegt u na neurosferendissociatie en tijdens oligosfeerproductie de cytokinemix van belang toe aan het kweekmedium. Om zuurstof-glucosedeprivatie celdood te induceren, twee dagen na het zaaien in de multi-well platen, breng het supernatant van elke cultuur over in individuele putten van een multi-well plaat.

Voeg de helft van het volume OGD-medium toe aan de putten en breng de culturen over naar een luchtdichte hypoxiekamer verzadigd met 95% stikstof en 5% koolstofdioxide. Plaats de kamer in de celkweekincubator. Vervang na drie uur het medium in de kamers door het medium dat opzij is gezet van de multi-well kweekplaat.

Nadat u de kwaliteit van de celkleuring hebt gecontroleerd, selecteert u in het menu Acquisitie van de screeningsoftware met hoog gehalte vaste belichtingstijd en Miniscan en selecteert u 10 velden per put en twee putten per experimentele toestand om de analyseparameters in de subset van velden voor de hele plaat in te stellen. Volg de workflow stap voor stap om het hele algoritme te ontwikkelen. Selecteer Afbeelding verwerken voor elk kanaal en klik op Achtergrond verwijderen om het gewenste signaalniveau te selecteren.

Als u de kernen wilt identificeren en selecteren door kernkleuring, klikt u op Primair object identificeren, past u de drempel aan om afzonderlijke kernen te identificeren en klikt u op Primaire objecten valideren om de drempelwaarden in te stellen op basis van objectgebieden en positie. Klik op Vlekken identificeren voor elk kanaal dat overeenkomt met de specifieke afstammingsmarkers en stel de breedte van de ringwaarde in op drie en de afstand op nul om de cytoplasmatische fluorescentie te kunnen identificeren. Selecteer Referentieniveaus in de workflow om de analyse samen te stellen en om automatische telling van de gecondenseerde kernen mogelijk te maken op basis van de nucleaire grootte en nucleaire kleuringsintensiteit en van de specifieke markerpositieve cellen op basis van de cytoplasmatische fluorescentie die door de ring wordt geïdentificeerd, en klik vervolgens op Afspelen.

Tijdens de eerste fase van de kweek behouden de neurale stamcellen hun nestinexpressie. De meeste cellen zijn ook NG2-positief. CNPase-positieve cellen die overeenkomen met het pre-oligodendrocytenstadium zijn detecteerbaar drie tot zes dagen na T3-gemedieerde differentiatie-inductie, terwijl volwassen MBP-positieve oligodendrocyten in een significant percentage verschijnen na zes tot 12 dagen in vitro.

Screeningsanalyse met een hoog gehalte maakt de detectie van afzonderlijke cellen in de cultuur mogelijk door middel van nucleaire kleuring en fluorescentie-intensiteitsanalyse. De samenstelling van de cultuur aan het einde van de differentiatiefase verschilt afhankelijk van of de culturen van foetale of volwassen oorsprong zijn, waarbij foetale culturen beter reageren op T3-gemedieerde differentiatie en een hoger percentage volwassen oligodendrocyten bereiken. Merk op dat wanneer neurale stamcel-afgeleide oligodendrocytenvoorlopercellen met een hoge dichtheid worden gezaaid, ze aggregeren en replicerende astrocyten snel een samenvloeiende cellaag produceren, waardoor observatie van de karakteristieke spinnennetvorm van volwassen oligodendrocyten wordt voorkomen.

Ontstekingsgemedieerde, differentiatieblokkering induceert een sterke afname van pre- en volwassen oligodendrocyten, zoals gedetecteerd door CNPase en MBP-kleuring in zowel foetale als volwassen culturen. Een toename van het aantal oligodendrocytenvoorlopercellen treedt ook op in met cytokine behandelde volwassen culturen. Terwijl foetale en volwassen oligodendrocytenvoorlopercellen hetzelfde vertonen voor inflammatoire cytokineblootstelling, zijn alleen foetale afgeleide culturen gevoelig voor zuurstof-glucosedeprivatietoxiciteit.

De methode kan worden geïmplementeerd met elke vorm van oligodendrocytenvoorlopercellen, differentiatie en rijpingsinterferentieproces, om nieuwe strategieën te testen die gericht zijn op het bestrijden van ziekten die myelinisatie of remyelinisatie beïnvloeden