Aanvulling van splicingactiviteit door een Galectin-3 - U1 snRNP-complex op kralen

Dit rapport levert de experimentele bewijzen voor de documentatie dat een galectin-3 U1 snRNP-complex zich bindt aan pre mRNA-substraatvormen, een functioneel complex vormt en leidt tot producten van de splitsingsreactie. Dit protocol gebruikt het galectin-3 U1 snRNP immunogeselecteerd op kralen covalent gekoppeld aan anti-gal3-antilichamen om de splitsingsreactie te initiëren, die tot voltooiing kan worden voortgezet. Een cruciale stap in het protocol is het zorgvuldig verwijderen van vloeistof na het pellen van de kralen die het galectin-3 U1 snRNP-complex bevatten en het onmiddellijk gebruik ervan bij het initiëren van de splitsingsreactie.

Om U1 snRNP's uit het nucleaire extract te depelten, incubeer 200 microliter nucleair extract met 100 microliter anti-U1-kralen. Voeg vijf microliter RNA's toe aan het mengsel en draai de microbuiskop kop over staart bij vier graden Celsius gedurende één uur. Pelleer het mengsel door centrifugatie en verzamel het ongebonden materiaal met een Hamilton-spuit.

Dialyseer het gehele volume U1-depleteerd nucleair extract samen met een aparte 50 microliter aliquot van het oorspronkelijke niet-gedepleteerd nucleair extract in afzonderlijke compartimenten van een micro-dialysator met roeren gedurende 75 minuten tegen 60% buffer D bij vier graden Celsius. Gebruik een dialysemembraan met een moleculair gewicht van 8K. Direct na dialyse verdeel je de bereidingen in 20 microliter aliquots, bevries ze snel in een dry ice ethanol bad en bewaar ze bij min 80 graden Celsius.

Net voor gebruik, was de anti-gal3-kralen twee keer met 0,5 milliliter TX-wasbuffer. Voeg voor elke wassing de wasbuffer toe en centrifugeer. Verwijder het supernatant eerst met een micropipet en vervolgens met een Hamilton-spuit om de vloeistof uit de kralen te halen.

Fractioneer het nucleair extract over een 12% tot 32% glycerolgradiënt. Combineer en meng glycerolgradiëntfracties drie, vier en vijf die zich dicht bij de 10S-regio bevinden. Bereid twee 150 microliter aliquots van gecombineerde gradiëntfracties drie tot vijf voor en plaats ze in 50 microliter anti-gal3-kralen.

Parallel hieraan, bereid twee monsters voor, elk met 150 microliter fractie één en plaats ze in 50 microliter anti-gal3-kralen. Als controle, plaats 150 microliter 60% buffer D in 50 microliter anti-gal3-kralen. Meng voorzichtig door de buisjes te tikken en draai ze vervolgens kop over staart bij vier graden Celsius gedurende één uur.

Pellet de monsters met zachte centrifugatie. Verwijder het grootste deel van het supernatant met een micropipet. Verwijder het supernatant met een Hamilton-spuit door de naaldtip voorzichtig tot op de bodem van de kralen te steken.

Gebruik de kralen onmiddellijk voor de splitsingsreacties. Stel de splitsingsreactie samen zoals beschreven in het tekstmanuscript en voeg deze toe aan één set van de kraalmonsters. Stel een identieke set splitsingsreacties samen in een totaal volume van 24 microliter maar zonder U1-gedepleteerd nucleair extract en voeg deze toe aan de andere set kralen.

Bereid een controlesplitsingsreactie voor om uitgevoerd te worden in afwezigheid van enige kralen in een totaal volume van 12 microliter. Deze controlereactie bevat nucleair extract, 60% buffer D en radioactief splitsingssubstraat. Meng de buisjes voorzichtig door te tikken en draai ze kop over staart bij 30 graden Celsius gedurende 90 minuten, pel het mengsel vervolgens door zachte centrifugatie.

Stop de reactie en elueer de eiwitten van de kralen door 24 microliter 2X SDS-monsterbuffer toe te voegen aan de buisjes met kralen en 12 microliter 2X SDS-monsterbuffer aan de controlebuis met nucleair extract maar geen kralen. Vorm een vortex met elke buis. Verhit de buisjes gedurende zeven minuten bij 100 graden Celsius.

Centrifugeer de buisjes bij 1.000 keer G in een zwevende emmer rotor bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 15 seconden. Breng de supernatanten over naar verse microbuisjes. Voeg 20 milligram per milliliter proteinase K toe om de eiwitten te verteren en te solubiliseren.

Incubeer de buisjes bij 37 graden Celsius gedurende 40 minuten. Na de incubatie, centrifugeer de buisjes voorzichtig. Verdun de kraalelusies met 39,5 microliter TE en 10 microliter drie molair natriumacetaat.

Verdun het nucleair extract controle met 63,5 microliter TE en 10 microliter natriumacetaat. Extraheer en analyseer het RNA zoals beschreven in het tekstmanuscript. Nucleaire extracten gedepleteerd van U1 snRNP en gal3 U1 snRNP-complexen uit de 10S-regio van glycerolgradiënt geïmmunoprecipiteerd door anti-gal3 werden gemengd in een splitsingsreactie.

Deze reactiemix bevatte U1 snRNA, evenals het U1-specifiek eiwit U1-70K. Zoals verwacht, heeft het anti-gal3 geprecipiteerd gal3. U1 snRNA, U1-70K-eiwit en gal3 werden niet gevonden in de pre-immune controleprecipitatie.

In vergelijking met een niet-gedepleteerd nucleair extract dat als positieve controle werd uitgevoerd, vertoonde het nucleair extract gedepleteerd van U1 snRNP geen splitsingsactiviteit. Splitsingsactiviteit in het U1-gedepleteerd nucleair extract kon worden gerestaureerd door het kraalgebonden gal3 U1 snRNP-complex. Beide producten van de splitsingsreactie, geligeerde exonen en uitgesneden intron lariat evenals in intermediaire producten, werden gevonden.

De componenten van fracties drie tot vijf waren cruciaal voor het herstel van de splitsing in het U1-gedepleteerd nucleair extract. Toen deze fracties werden vervangen door alleen buffer, kon geen splitsingsactiviteit worden waargenomen, wat aangeeft dat de anti-gal3-kralen niet verantwoordelijk waren voor het herstel van de splitsingsactiviteit in het U1-gedepleteerd nucleair extract. Overtuigender nog, toen fracties drie tot vijf werden vervangen door fractie één in de immunoprecipitatieprocedure en vervolgens werden toegevoegd aan het U1-gedepleteerd nucleair extract, werden er geen intermediaire producten of producten van de splitsingsreactie gevonden. Wanneer je dit protocol probeert, zou één persoon de immuno