Name: Directe herprogrammering van menselijke fibroblasten in myoblasten om therapieën voor neuromusculaire aandoeningen te onderzoeken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Leer hoe menselijke huidfibroblasten direct worden omgezet in myoblasten en myotubes met lentivirale vectoren. Deze snelle methode biedt een waardevol alternatief voor iPSC-technologie bij het onderzoeken van neuromusculaire aandoeningen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Dr. Vincent Mouly bedanken voor het delen van zijn kennis in het verleden over het model. Dit werk is ondersteund door het Us National Institutes of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01 NS043264 (K.M.F., en R.B.W.)), de Us National Institutes of Health National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., en N.W.). N.W. heeft fellowship-steun ontvangen van de Ohio State University /Nationwide Children's Hospital Muscle Group en de Philippe Foundation. Dit werk werd ook ondersteund door interne discretionaire fondsen en een deel van het exon 2 overslaande werk werd ook ondersteund door CureDuchenne (K.M.F.) en Association Francaise Contre Les Myopathies. IRB-nummer: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 en IBCSC#: IBS00000123.

<ol><li>Bigot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+aging+down-regulates+the+myogenic+regulatory+factors+in+human+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts.</a> Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (34), (2011).</li>
<li>Pantic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+and+versatile+immortal+muscle+cell+models+from+healthy+and+myotonic+dystrophy+type+1+primary+human+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Reliable and versatile immortal muscle cell models from healthy and myotonic dystrophy type 1 primary human myoblasts.</a> Experimental Cell Research. 342 (1), 39-51 (2016).</li>
<li>Thorley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+characteristics+are+preserved+in+hTERT%2Fcdk4+human+myogenic+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines.</a> Skeletal Muscle. 6 (1), 43(2016).</li>
<li>Chaouch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+skin+fibroblasts+expressing+conditional+MyoD+as+a+renewable+and+reliable+source+of+converted+human+muscle+cells+to+assess+therapeutic+strategies+for+muscular+dystrophies%3A+Validation+of+an+exon-skipping+approach+to+restore+dystrophin+in+duchen%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen.</a> Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).</li>
<li>Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+cell+and+animal+models+of+human+disease+by+genome+editing+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9.</a> The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).</li>
<li>Echevarría, L., Aupy, P., Goyenvalle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon-skipping+advances+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Exon-skipping advances for Duchenne muscular dystrophy.</a> Human molecular genetics. 27 (2), 163-172 (2018).</li>
<li>Hwang, J., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+exon-skipping+therapies+using+antisense+oligonucleotides+and+genome+editing+for+the+treatment+of+various+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+reviews+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in exon-skipping therapies using antisense oligonucleotides and genome editing for the treatment of various muscular dystrophies.</a> Expert reviews in molecular medicine. 21, 5(2019).</li>
<li>Wein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Skipping+of+Single+Exon+Duplications+in+DMD+Patient-Derived+Cell+Lines+Using+an+Antisense+Oligonucleotide+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuromuscular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).</li>
<li>De Angelis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+snRNA+molecules+carrying+antisense+sequences+against+the+splice+junctions+of+exon+51+of+the+dystrophin+pre-mRNA+induce+exon+skipping+and+restoration+of+a+dystrophin+synthesis+in+%CE%9448-50+DMD+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).</li>
<li>Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+alteration+of+pre-mRNA+splicing+patterns+by+modified+U7+small+nuclear+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).</li>
<li>Wein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+from+a+DMD+exon+5+IRES+results+in+a+functional+dystrophin+isoform+that+attenuates+dystrophinopathy+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice.</a> Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).</li>
<li>Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+oxidative+phosphorylation+of+immortalization+with+the+telomerase+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene.</a> Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).</li>
<li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499(2009).</li>
<li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+defects+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Myogenic defects in myotonic dystrophy.</a> Developmental Biology. 265 (2), 294-301 (2004).</li>
</ol>

Nationwide Children's Hospital heeft het exon 2 skipping programma dat hierin wordt beschreven in licentie gegeven aan Audentes Therapeutics. K.M.F. en N.W. hebben royaltybetalingen ontvangen als gevolg van deze licentie.

Om FM-cellijnen van goede kwaliteit te verkrijgen, zijn sommige stappen van cruciaal belang. Hoe eerder de huidbiopsie wordt verwerkt, hoe groter de kans op het verkrijgen van gezonde fibroblasten. Het passageaantal fibroblastenculturen is ook belangrijk. Primaire cellen hebben een beperkte proliferatieve capaciteit en na vele passages komen ze binnen in replicatieve senescentie. Het is dus beter om een voorraad fibroblasten te hebben met een laag passagenummer en cellen zo snel mogelijk te transformeren. 
<p class="...

Cellulaire modellen die rechtstreeks uit menselijke weefsels worden verkregen, zijn nuttig om veel menselijke genetische aandoeningen te modelleren, met het voordeel dat ze de oorspronkelijke genomische context hebben en in veel gevallen dezelfde moleculaire en cellulaire kenmerken reproduceren die bij de patiënten worden waargenomen. Op het gebied van neuromusculaire aandoeningen zijn spierbiopten een grote bron van menselijke myoblasten geweest en hebben ze geholpen bij de opheldering van pathologische mechanismen. Bovendien zijn ze een belangrijk hulpmiddel voor in vivo testen van geneesmiddelen en gentherapieën. Aan de ene kant is de afleiding van myoblasten uit spierfragmenten relatief eenvoudig. Aan de andere kant zijn de cultuur en het onderhoud van primaire myoblasten uitdagend, vanwege hun beperkte proliferatiesnelheid en replicatieve senescentie in vitro1. Een alternatief voor deze beperkingen is het vereeuwigen van myoblasten met het inbrengen van de menselijke telomerase (hTERT) en/of cycline-afhankelijke kinase 4 (CDK4) genen2,3, met behoud van skeletspierkenmerken4. Niettemin is de obtentie van primaire myoblasten nog steeds afhankelijk van spierbiopsie, een chirurgische procedure met nadelen voor de patiënten, die in veel gevallen hun spieren in geavanceerde degeneratie hebben. De spier van deze patiënten bestaat dus uit een aanzienlijk deel van het fibrotische en/of vetweefsel en levert minder spiercellen op, waardoor de cellen eerder moeten worden gezuiverd tot de vereeuwiging.
In tegenstelling tot spierbiopten zijn huidbiopten toegankelijker en minder schadelijk voor patiënten. Primaire fibroblasten kunnen in vitroworden afgeleid uit huidfragmenten . Hoewel fibroblasten niet voornamelijk worden beïnvloed door mutaties die neuromusculaire aandoeningen veroorzaken, kunnen ze worden getransdifferentieerd in myoblasten. Dit kan worden bereikt door het inbrengen van het Myod-gen, een myogene transcriptiefactor5. In dit manuscript beschrijven we het protocol om getransdifferentieerde myoblasten te verkrijgen, van de oprichting van fibroblastenculturen tot de obtentie van gedifferentieerde myostubes (een representatieve samenvatting van de methode is afgebeeld in figuur 1).
Preklinisch testen van therapeutische strategieën is afhankelijk van cellulaire en dierlijke modellen met mutaties die vergelijkbaar zijn met de mutaties die bij menselijke patiënten worden gevonden. Hoewel de ontwikkeling van diermodellen haalbaarder is geworden met de opmars van genbewerkingstechnologieën zoals CRISPR/Cas96, is het nog steeds uitdagend en kostbaar. Van patiënten afgeleide cellijnen zijn dus een toegankelijke optie om modellen te hebben, die het grote spectrum van mutaties van ziekten zoals Duchenne spierdystrofie (DMD) bestrijken. Obtention en creatie van celmodellen zijn cruciaal voor de ontwikkeling van gepersonaliseerde therapieën voor dergelijke pathologieën.
Onder gepersonaliseerde therapieën die zijn onderzocht, exon skipping strategieën is een van de veelbelovende voor verschillende spierdystrofieën7,8. Deze strategie bestaat uit het produceren van een korter maar functioneel eiwit. Dit wordt uitgevoerd door de exon-definitie te verbergen voor het spliceosome, waardoor de gemuteerde exon wordt uitgesloten van de laatste boodschapper. Dit is een veelbelovende technologie die is goedgekeurd door de FDA voor DMD. Zo beschrijven we in dit protocol ook methoden om myoblasten te transfecteren met twee verschillende exon skipping gerelateerde technologieën: antisense oligonucleotiden (AON) en U7snRNA-adeno-geassocieerd virus (AAV). AON-transfectie is een goed hulpmiddel voor de eerste screening van verschillende sequenties die zijn ontworpen om exon skipping9te bevorderen. De activiteit van AON's is echter van voorbijgaande aard. Om een aanhoudende expressie van antisense sequenties te verkrijgen, onderzochten we ook kleine nucleaire RNA's (snRNA's) in combinatie met AAV, waardoor nucleaire lokalisatie en opname in de splicingmachines mogelijk werd10. U7 is een snRNA dat betrokken is bij de verwerking van histon mRNA dat kan worden ontworpen om eiwitten te binden die het naar het spliceosome zullen leiden en antisense sequenties11zullen leveren. Het gebruik van gewijzigde U7-snRNA 's in combinatie met AAV-vectoren overwint beperkingen van AION 's , wat resulteert in een voortdurende expressie van de AION 's en een betere transductie van aandachtsweefsels12. We gebruiken cellen afgeleid van DMD-patiënten voor dit protocol om de exon-skippingstrategie te illustreren.

<table><tbody><tr><td>100 mm schaal</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA, fenol rood</td><td>Thermo Fisher</td><td>2500056</td><td></td></tr><tr><td>10X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>12-wells plaat</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>20X Transfer buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>20X Tris-acetaat SDS lopende buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>LA0041</td><td></td></tr><tr><td>3-8% Tris-Acetaat gel</td><td>Thermo Fisher</td><td>EA0378BOX</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 flacon</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>Antibioticum-Antimicotic 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-myosine zware ketting, sarcomeer antilichaam</td><td>Developmental Studies Hybridome Bank</td><td>MF20 supernatant</td><td>Verdunning 1:50</td></tr><tr><td>Antioxidant</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>BCA Eiwit Assay</td><td>Thermo Fisher</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D3571</td><td>Verdunning 1:1000</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Millipore Sigma</td><td>300410250MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, Hoge glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvaat</td><td>Thermo Fisher</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I set (250U)</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>E1010</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline Hydrochloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2653-5</td><td></td></tr><tr><td>Dup2 menselijke primers</td><td>Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3'</td><td>Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3'</td><td></td></tr><tr><td>Dystrophin antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab15277</td><td>Verdunning 1:200</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-muis, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td>Verdunning 1:1000</td></tr><tr><td>Halt Protease inhibitor cocktail 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Thermo Fisher</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD geit anti-Konijn IgG (H+L)</td><td>Li-Cor</td><td>926-68071</td><td>Verdunning 1:5000</td></tr><tr><td>Lab-Tek II CC2 kamer plaat systeem</td><td>Thermo Fisher</td><td>15852</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli</td><td>Bioworld</td><td>105700201</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfectie Reagens</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR membraan matrix</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412P-4</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty Bevries Container</td><td>Thermo Fisher</td><td>51000001</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membraan 0,45 µm</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat serum control</td><td>Thermo Fisher</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Blocking Buffer (PBS)</td><td>Li-Cor</td><td>927-40003</td><td>Blocking buffer voor Western blot</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Gereduceerd Serum Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>K0172</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatase inhibitor</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32957</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standaards</td><td>Bio Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>Revert 700 Totaal Eiwit Stain voor Western Blot Normalisatie</td><td>Li-Cor</td><td>926-11021</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp; Concentrator-25</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>Scalpels</td><td>Aspen Surgical</td><td>372611</td><td></td></tr><tr><td>Skeletal Muscle Cell Differentiatie medium</td><td>Promocell</td><td>C23061</td><td></td></tr><tr><td>Skeletal Muscle Cell Groei medium</td><td>Promocell</td><td>C23060</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>215682500</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol reagens</td><td>Thermo Fisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337500</td><td></td></tr><tr><td>Ultra lage temperatuur vriezer</td><td>Thermo Scientific</td><td>7402</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antifade bevestigingsmedium</td><td>Vector Labs</td><td>H1000</td><td></td></tr></tbody></table>

directe herprogrammering van menselijke fibroblasten in myoblasten om therapieën voor neuromusculaire aandoeningen te onderzoeken

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

Onderzoeken naar zowel de pathofysiologie als therapeutische doelen in spierdystrofieën zijn belemmerd door de beperkte proliferatieve capaciteit van menselijke myoblasten. Er zijn verschillende muismodellen gemaakt, maar ze vertegenwoordigen niet echt de menselijke fysiopathologie van de ziekte of zijn niet representatief voor het brede spectrum van mutaties bij mensen. De vereeuwiging van menselijke primaire myoblasten is een alternatief voor deze beperking; het is echter nog steeds afhankelijk van spierbiopsieën, die invasief zijn en niet gemakkelijk beschikbaar zijn. Huidbiopten zijn daarentegen gemakkelijker te verkrijgen en minder invasief voor patiënten. Fibroblasten afgeleid van huidbiopten kunnen worden vereeuwigd en getransdifferentieerd in myoblasten, waardoor een bron van cellen met een uitstekend myogen potentieel wordt geboden. Hier beschrijven we een snelle en directe herprogrammeringsmethode van fibroblast in een myogene afstamming. Fibroblasten worden getransduceerd met twee lentivirussen: hTERT om de primaire cultuur te vereeuwigen en een tet-inducerende MYOD, die bij toevoeging van doxycycline de omzetting van fibroblasten in myoblasten induceert en vervolgens myotubes rijpt, die late differentiatiemarkers uitdrukken. Dit snelle transdifferentiatieprotocol is een krachtig instrument om pathologische mechanismen te onderzoeken en innovatieve gengebaseerde of farmacologische biotherapieën voor neuromusculaire aandoeningen te onderzoeken.

Dit protocol laat zien hoe je menselijke huid-afgeleide fibroblastculturen vaststellen en omzetten in myoblasten en vervolgens in gedifferentieerde myotubes. Dit type cellijn is uiterst nuttig voor de studie van neuromusculaire aandoeningen en in vitro testen van potentiële therapieën.
Een schematische weergave van de fibroblastconversie wordt weergegeven in figuur 1. Figuur 2A toont een stukje huid en de fibroblasten die eru...

Dit protocol beschrijft de omzetting van huidfibbroblasten in myoblasten en hun differentiatie in myotubes. De cellijnen zijn afgeleid van patiënten met neuromusculaire aandoeningen en kunnen worden gebruikt om pathologische mechanismen te onderzoeken en therapeutische strategieën te testen.

Directe herprogrammering van menselijke fibroblasten in myoblasten om therapieën voor neuromusculaire aandoeningen te onderzoeken

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of ...

Hallo allemaal. Mijn naam is Nicolas Wein. Ik ben hoofdonderzoeker bij het Nationwide Children's Hospital in Columbus, Ohio.En vandaag laten we je een video zien over hoe je een huidbiopsie nemen en deze omzetten in myoblasten en myotube. Dit is een zeer nuttig hulpmiddel om neuromusculaire stoornis te bestuderen. Bovendien is het een veel snellere technologie in vergelijking met IPSC omdat we twee verschillende soorten virussen gebruiken om dit type cel direct te bestrijden.Deze video demonstreert het protocol voor het vaststellen van door de menselijke huid afgeleide fibroblastculturen, de omzetting in myoblasten en vervolgens gedifferentieerde myostubes. Een huidbiopsie wordt overgebracht naar celkweek om huidfibrose af te leiden. Lentivirussen met hTERT- en MYOD-genen worden gebruikt om deze fibroblasten te transduceren.Bij toevoeging van myoblastgroeimedium aangevuld met Doxycycline wordt het MYOD-gen uitgedrukt, waardoor de omzetting van fibroblasten in myoblasten wordt induceerd. Vervolgens wordt het medium overgeschakeld naar een differentiatiemedium, ook aangevuld met Doxycycline. Dan smelten de myoblasten met elkaar samen en vormen ze multinucleaire myotubes.Aspirateer het medium uit de buis en spoel de biopsie drie keer af met 10 milliliter, één x PBS bij kamertemperatuur. Laat na de derde wasbeurt de PBS in de tube. Giet de PBS en de huidbiopsie uit op een 10 centimeter vierkante schaal.Snijd met steriele scalpels de biopsie in stukken die zo klein mogelijk zijn. Breng met behulp van een pipet een individueel huidstuk over op een steriele schotel van 10 centimeter in het kwadraat. Aspirateer de overmaat aan PBS van rond elk stuk.Pas op dat u het stuk zelf niet aspireert. Bedek de gerechten gedeeltelijk met het deksel en laat de stukjes huidbiopsie vijf tot 20 minuten drogen. Laat de stukken niet te lang drogen.Zodra de stukken droog zijn, kantelt u de schaal onder een hoek van 45 graden en voegt u langzaam 12 milliliter fibroblastmedium toe aan de hoek van de schaal. Laat de schaal zakken en verspreid de media zorgvuldig, zodat de stukken niet door de media worden opgetild. Doe de borden in de couveuse.Vervang de media in vijf tot zeven dagen en daarna één keer per week. Zaad primaire fibroblasten bij 30% van de samenvloeiing en twee putten van een 12 putplaat, ongeveer 20.000 cellen per put, om de volgende dag ongeveer 50% van de samenvloeiing te hebben. Voeg voor lentivirale transductie twee tot 5 miljard virale genomen van hTERP Puromycine Lentivirus en 400 microliters fibroblastmedium toe.Voeg de lentivirusmix toe aan één put. Voeg aan de tweede put slechts 400 microliters fibroblastmedium toe. Voeg de volgende dag een milliliter media toe.Breng een of twee dagen later de cellen over in een plaat met zes putten en laat ze groeien tot ze 60 tot 70% samenvloeien. Vul het fibroblastmedium aan met één microgram per milliliter Puromycine en voeg twee milliliter toe aan elke put. Houd de cellen onder selectie totdat alle cellen in de controleput ten minste 12 dagen dood zijn en verander de media om de twee tot drie dagen.Seed H-grafiek die fibroblasten uitdrukt bij 30% samenvloeiing in drie putten van de 12 putplaat om de volgende dag ongeveer 50% samenvloeiing te hebben. Meng voor lentivirale transductie twee tot vijf miljard virale genomen van MYOD Hygromycine B lentivirus en 400 microliters fibroblastmedium en voeg toe aan twee putten. Voeg de volgende dag een milliliter medium toe.Breng een of twee dagen later de cellen over in een plaat met zes putten en groei tot 60 tot 70%. Vul groeimedia aan met 400 microgram per milliliter Hygromycine B.Voeg twee milliliter toe aan elke put. Houd de cellen onder selectie totdat alle cellen in de controleputten zijn gestorven, meestal duurt het minstens 12 dagen en verandert het medium om de twee tot drie dagen.Voor inductie van myoblasten, kweek fibroblasten tot ze 70% samenvloeien. Voeg acht microgram Doxycycline per milliliter Doxycycline toe aan het myoblastgroeimedium. Gebruik altijd verse aliquots van Doxycycline en medium.Het medium moet worden voorbereid vlak voordat media veranderen. Bovendien mag de Doxycycline niet worden gerefrrozen. Aspirateer het fibroblastmedium en spoel de cellen af met PBS.Voeg 10 milliliter aangevulde myoblastmedia toe. Twee tot drie dagen later zijn cellen voor 90 tot 95% samenvloeiend en zal hun morfologie zijn veranderd. Aspirateer de myoblastgroeimedia en spoel het celoppervlak af met PBS.Voeg 10 milliliter differentiatiemedia toe die zijn aangevuld met acht microgram per milliliter verse Doxycycline. Blijf de media om de twee tot drie dagen veranderen totdat myotubes zijn gevormd. Zeven tot tien dagen na het starten van myotube differentiatie moeten cellen volledig worden gedifferentieerd, maar dit varieert van de ene cellijn tot de andere.De eerste fibroblasten kunnen vijf dagen nadat de huidstukken in cultuur zijn geweest ontstaan. In afbeelding B zijn fibroblasten samenvloeiend en klaar om te worden overgebracht naar vierkante kolven van 75 centimeter voor verdere proliferatie. Het is belangrijk om verschillende flesjes fibroblasten te bevriezen bij lage doorgangsnummers, omdat primaire cellen de replicatieve senescentie binnenkomen.Zodra de FM-cellijnen zijn vastgesteld voor de omzetting van fibroblasten in myotubes, moeten de fibroblasten zich verspreiden tot 70% confluent zoals weergegeven in afbeelding A.Het is belangrijk om de 80% confluency niet te overschrijden, omdat een hoge dichtheid de differentiatie kan aantasten. Na toevoeging van Doxycycline aan het medium worden de cellen binnen twee tot vier dagen myoblasten, gekenmerkt door een langwerpige morfologie en parallelle oriëntatie zoals te zien in afbeelding B.Gedifferentieerde myostubes worden weergegeven in afbeelding C.De tijd voor fusie en differentiatie van myotubes kan variëren van zeven tot 21 dagen, afhankelijk van het celgenotype. De cellen moeten worden verzameld of gerepareerd voordat ze losraken.Het begin van het onthechting kan worden waargenomen door kleur en helderheid van de randen van de myotube, zoals aangegeven door de pijlen in deze afbeelding. Door immunofluorescentie bevestigt de expressie van volwassen spierspecifieke eiwitten de succesvolle omzetting van fibroblasten in myotubes. Op deze foto's worden drie verschillende cellen getoond.De mate van differentiatie varieert van cel tot cel en kan al dan niet worden uitgevoerd door de primaire mutatie, omdat dit het geval is bij cellen in de figuren B en C.Verdere validatie van het model werd bevestigd door RNAseq. Zoals getoond in dit plot zijn er meer dan 12.000 differentieel uitgedrukte genen gedetecteerd in FM myotubes in vergelijking met die van skeletspieren. De significante correlatie tussen beide transcriptomen ondersteunt dat FM-cellen een spierspecifiek expressieprofiel hebben dat aantoont dat ze een nuttig en betrouwbaar surrogaat zijn voor van spieren afgeleide cellijnen.Om het nut van dit in vitro model te illustreren, hebben we een van de meest voorkomende exonische duplicaties in het DMD-gen gebruikt. Duplicatie van Exon twee leidt tot de verstoring van het DMD-leesframe, en het overslaan ervan kan leiden tot herstel van dat leesframe of het gebruik van de interne ribosoomingangssite. Deze therapie is al gevalideerd met in vivo studies figuur A, we demonstreerden proof of concept door RTPCR analyse van deze specifieke gemuteerde cellijn, met en zonder behandeling door exon skipping.De westelijke vlek in figuur B toont aan dat functioneel Dystrofine-eiwit wordt uitgedrukt in behandelde cellen. Bij het vergelijken van de efficiëntie van deze therapie met in vivo modellen, ondersteunen de resultaten de betrouwbaarheid van de celdifferentiatietechniek en ondersteunen ze het gebruik ervan voor het testen van verschillende mutatiespecifieke gentherapieën. Vóór klinische studies die nodig zijn om de werkzaamheid van officiële therapieondersteuning op neuromusculaire aandoeningen te testen, afhankelijk van het vermogen van dierlijke en cellulaire modellen.De ontwikkeling van diermodellen, hoewel tegenwoordig gemakkelijker, is geen haalbare optie voor elke specifieke mutatie. Het genereren van myoblasten via IPS-cellen afkomstig van huidfibroomblasten is een alternatief, maar het is een tijdrovende techniek. Deze procedure is dus een eenvoudig alternatief voor IPS-generatie die de directe omzetting van fibroblasten in myoblasten mogelijk maakt.Het vergemakkelijkt de toegang tot menselijke celmodellen door de meer invasieve toepassing van spierbiopsieën te vermijden Concluderend is deze directe omzetting van fibroblasten in myoblasten een krachtig hulpmiddel voor het testen van therapieën voor neuro-spieraandoeningen in een beperkingsspecifieke context.

direct-reprogramming-human-fibroblasts-into-myoblasts-to-investigate

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

We presenteren een protocol voor een efficiënte herprogrammering van menselijke somatische cellen in het menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) met behulp van retrovirale vectoren die coderen voor Oct3 / 4, Sox2, Klf4 en c-myc (OSKM) en de identificatie van de opnieuw aangeleerd hiPSC door live kleuring met Tra- 1-81 antilichaam.

Selecteren en isoleren van Koloniën van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen geherprogrammeerd tegen Adult Fibroblasten

Een niet-invasieve middelen voor het succes van transplantatie myoblast evalueren beschreven. De methode maakt gebruik van een verenigd fusie reportergen samengesteld uit genen waarvan de expressie kan worden afgebeeld met verschillende beeldvormende technieken. Hier maken we gebruik van...

Molecular Imaging te Getransplanteerde Muscle Progenitor Cellen Target

Dit protocol omvat gedetailleerde procedures voor de isolatie van urine-afgeleide cellen van patiënten met spierdystrofie; hun efficiënte en snelle herprogrammering door Sendai-virus transductie.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van spierdystrofie patiënten: Efficiënte-Integratie gratis herprogrammeren van Urine-afgeleide cellen

Dit protocol beschrijft technieken voor het isoleren van levende cellen en de primaire kweek van myogene en fibroblastcellijnen uit spier- of huidweefsel. Er wordt ook een techniek beschreven voor het onvergankelijk maken van deze cellijnen. Samenvattend bieden deze protocollen een betrouwbare tool om afgeleide cellen van patiënten te genereren en te bewaren voor downstream-toepassingen.

Isolatie en immortaliseren van Patient afgeleide cellijnen van spierbiopsie for Disease Modeling

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Directe neuronale herprogrammering genereert neuronen die de leeftijd van de begincel van somatische handhaven. Hier beschrijven we een enkele vector-gebaseerde methode voor het genereren van geïnduceerde neuronen van dermale fibroblasten van volwassen menselijke donors verlangde.

Eenvoudige generatie van de cultuur van een hoog rendement van geïnduceerde neuronen van menselijke volwassen huid fibroblasten

Hier presenteren we een robuuste methode om te herprogrammeren primaire embryonale fibroblasten in functionele cardiomyocytes via overexpressie van GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 en miR-133 (GHMT2m) naast remming van TGF-β signalering. Ons protocol genereert kloppend cardiomyocytes zo spoedig 7 dagen na transductie met korting tot 60% efficiëntie.

Onderdrukking van Pro-fibrotische signalering Potentiates Factor-gemedieerde herprogrammering van muis embryonale fibroblasten in geïnduceerde Cardiomyocytes

Hier beschrijven we een klinisch relevante, hoog rendement, feeder-vrije methode om te herprogrammeren menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van gemodificeerde mRNAs codering herprogrammering factoren en volwassen microRNA-367/302 nabootst. Ook inbegrepen zijn methoden om herprogrammering efficiëntie, te beoordelen vouw klonale iPSC kolonies en bevestigen van de expressie van de pluripotent markering TRA-1-60.

RNA gebaseerde herprogrammering van menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen

Celherprogrammering vereist de introductie van belangrijke genen, die de pluripotente celtoestand reguleren en onderhouden. Het protocol beschreven maakt de vorming van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kolonies van menselijke dermale fibroblasten zonder virale/integrerende methoden, maar met behulp van niet-gemodificeerde Rna's (NM-Rna's) in combinatie met immuun ontduiking factoren vermindering van cellulaire afweermechanismen.

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

We beschrijven een protocol om menselijke huid-afgeleide fibroblasten te herprogrammeren in geïnduceerde Neuronal Progenitor Cells (iNPC's), en hun daaropvolgende differentiatie in geïnduceerde Astrocyten (iA's). Deze methode leidt tot een snelle en reproduceerbare generatie van iNPC's en iA's in grote hoeveelheden.

In vitro modellering voor neurologische ziekten met behulp van directe conversie van fibroblasten naar neuronale voorlopercellen en differentiatie in astrocyten

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd direct herprogrammeringssysteem voor melanocyten en een zeer efficiënt, geconcentreerd virusverpakkingssysteem dat zorgt voor een soepele directe herprogrammering.

Directe herprogrammering van muisfibroblasten in melanocyten

Leer hoe menselijke huidfibroblasten direct worden omgezet in myoblasten en myotubes met lentivirale vectoren. Deze snelle methode biedt een waardevol alternatief voor iPSC-technologie bij het onderzoeken van neuromusculaire aandoeningen.

Directe herprogrammering van menselijke fibroblasten in myoblasten om therapieën voor neuromusculaire aandoeningen te onderzoeken (Video) | JoVE Journal

Directe herprogrammering van menselijke fibroblasten in myoblasten om therapieën voor neuromusculaire aandoeningen te onderzoeken

Meer video's verkennen