Gebruik van Grafix voor de detectie van transiënte interactoren van Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexen

De gradiëntfixatiemethode, waarbij een glycerolgradiëntcentrifugatie wordt uitgevoerd in aanwezigheid van een cross-linker, helpt bij het identificeren van interacties tussen eiwitten die tijdelijk binden aan multi-subunit complexen. Het gebruik van fixeerreagentia in de glycerolgradiënt stabiliseert de binding van losse factoren, zonder de vorming van neerslagen, waardoor de identificatie van de interacties van specifieke eiwitten met gespleten semi-complexen mogelijk wordt. De demonstratie van het eindprotocol helpt gebruikers bij hun eerste keer om informatie te leren die moeilijk te begrijpen kan zijn uit geschreven tekst alleen.

Voor de bereiding van totale gistextract, kweek de gistcellen die een van de splitsingsfactoren tot expressie brengen die zijn gefuseerd met de tap-tag en één liter Y en B glucosemedium gesupplementeerd met de juiste aminozuren of nucleïnebasen. Wanneer de cultuur een optische dichtheid bereikt bij 600 nanometer van één, verzamel de gistcellen door centrifugatie in drie 500 milliliter centrifugeerbuisjes, en was de cellen twee keer in 10 milliliter koud steriel water per wasbeurt. Na de tweede wasbeurt, resuspendeer de cellen in een tiende van het celvolume van koud buffer A, en bevries 50 microliter druppels van de gistcelsuspensie in vloeibaar stikstof.

Na het bevriezen, vermaal de bevroren celpellets door zes cycli van 20 hertz gedurende drie minuten in een balmolen apparaat, waarbij het vat met bevroren cellen aan het einde van elke cyclus in vloeibaar stikstof wordt ondergedompeld. Na de laatste cyclus, plaats de buizen met de extracten in water op kamertemperatuur met gelegenheidsschudden. Eenmaal gesmolten, centrifugeer om de extracten te verzamelen.

En kwantificeer het eiwit dat de verdunde supernatanten bevatten met de BCA-methode. Bevries vervolgens aliquoten van de extracten snel in vloeibaar stikstof voor opslag op minus 80 graden Celsius. Om een glycerolgradiënt voor te bereiden, voeg een 0,1%eindconcentratie van het cross-linkende middel glutaraldehyde toe aan een 30%glycerol en buffer A oplossing, en meng om te homogeniseren.

Voeg zes milliliter koude 10%glycerol en buffer A oplossing toe aan een 12 milliliter centrifugeerbuis en gebruik een gradient master apparaat spuit met een lange naald om de 30%glycerol glutaraldehyde oplossing aan de onderkant van de buis te plaatsen. Gebruik een gradient master apparaat om een lineaire glycerolgradiënt te creëren volgens de specificaties van de fabrikant. Laag voorzichtig 200 microliter van een 7%glycerol en buffer A kussen op de bovenkant van de gradiënt voordat u ongeveer twee milligram celextract op de bovenkant van de buis toevoegt.

Na de vorming van de glycerolgradiënt, plaats het monster in een voorgekoelde swing bucket rotor en verzamel het extract door centrifugatie. Verdeel het monster van elke 12 milliliter monsterbuis in 24 fracties van 500 microliter, en gebruik een peristaltische pomp om een 40%glyceroloplossing door de 10 tot 30%gradiënt van de buis naar de fractiecollectie te duwen. Laad vervolgens 50 microliter van elke fractie direct op de nitrocellulosemembranen op een dot blot, gevolgd door toevoeging van blokkeerbuffer, en gebruik een primaire antilichaam tegen CBP om het eiwit op de immunoblot te detecteren, en een geschikt secundair antilichaam indien nodig.

In afwezigheid van cross-linker is CWC 24 geconcentreerd tussen fracties vijf en 13, overeenkomend met complexen van ongeveer 80 tot 200 megadalton. In aanwezigheid van de cross-linker is de positie van CWC 24 op de gradiënt echter verschoven naar fracties aan de onderkant van de gradiënt die overeenkomen met grotere complexen. Het vergelijken van CWC 24 sedimentatie met die van de U5 snRNP subeenheid, Prp8, en de NTC subeenheid, Prp19, toont aan dat CWC 24 geconcentreerd is in dezelfde fracties.

Maar omdat het tijdelijk geassocieerd is met het spliceosoom, is het ook aanwezig in de lichtere fracties. Interessant is dat fracties 11 en 12 die zijn waarin Prp8 en 19 beginnen te concentreren, wat suggereert dat dit het deel van de gradiënt is waar het B Act complex begint te sedimenteren. Western blot-analyse van fracties 11 en 12 onthult Prp8 en 19 signalen als vlekken die amper een 8%acrylamide gel binnenkomen, wat aantoont dat ze inderdaad deel uitmaken van grote complexen.

CWC 24 is ook aanwezig in fractie 12, maar in een veel lagere concentratie, consistent met zijn tijdelijke binding aan het B Act complex. Samenvattend tonen deze resultaten aan dat glutaraldehyde kan worden gebruikt als cross-linker om de binding van tijdelijke factoren aan splitsingssub-complexen te stabiliseren. Deze methode kan worden toegepast op het onderzoek van dynamische motorsub-eenheid complexen die tijdelijk geassocieerd zijn met enkele van hun componenten, zoals het spliceosoom.