Stapsgewijs cel zaaien opssellated steigers om ontkiemende bloedvaten te bestuderen
14 januari 2021
Gemanipuleerde weefsels zijn sterk afhankelijk van de juiste vasculaire netwerken om vitale voedingsstoffen en gassen te leveren en metabolisch afval te verwijderen. In dit werk creëert een stapsgewijs zaaiprotocol van endotheelcellen en ondersteunende cellen sterk georganiseerde vasculaire netwerken in een platform met hoge doorvoer voor het bestuderen van het ontwikkelen van vesselgedrag in een gecontroleerde 3D-omgeving.
Ons protocol stelt onderzoekers in staat om het vormingsproces van het vatennetwerk op een duidelijke en gemakkelijk traceerbare manier te bestuderen, de deuren te openen voor nieuwe studies en licht te werpen op het gedrag van bloedvaten. Deze techniek biedt de mogelijkheid om zeer georganiseerde en herhaalbare vasculaire netwerken te creëren die reageren op de omgeving. Endotheelcellen van patiënten die lijden aan een vasculaire ziekte kunnen worden teruggewonnen in het gebruik van dit systeem, waardoor het mogelijk is om de vasculaire ziekte opnieuw te creëren en een geschikte behandeling te vinden.
De voorgestelde methode kan worden uitgebreid voor het bestuderen van vasculair netwerkgedrag in combinatie met verschillende celtypen, waardoor de interactie van ontwikkelende vaten met een specifiek weefseltype kan worden waargenomen. Begin met het onderdompelen van de steigers in 70% ethanol gedurende minimaal 15 minuten en was ze vervolgens twee keer in PBS. Meng 1,5 microliter fibronectine stamoplossing met 28,5 microliter PBS per te zaaien steiger.
Bereid één fibronectineverdunning voor die voor alle steigers moet worden gebruikt om pipetfouten te voorkomen. Plaats de steigers schaars op een hydrofoob oppervlak en bedek elke steiger met 30 microliters van de fibronectineverdunning. Vervang het deksel van de plaat en plaats de met fibronectine bedekte steigers minimaal een uur in een incubatorset op 37 graden Celsius en 100% vochtigheid.
Spoel na incubatie de steigers lichtjes af in PBS om fibronectineresten te verwijderen. De steigers kunnen maximaal een week in PBS op vier graden Celsius worden gehouden. Bereid endotheelcel of EC-medium voor door het basale medium te mengen met de bijbehorende mediumkitcomponenten, waaronder een antibioticumoplossing, FBS en endotheelcelgroeisupplementen zoals aangegeven door de fabrikant.
Maak de menselijke vet microvasculaire endotheelcelsuspensie in EC-medium met een concentratie van vier miljoen cellen per milliliter. Plaats met behulp van een tang één met fibronectine beklede steiger per put in een niet-TC 24-put plaat. Bedek elke steiger met 25 microliterdruppels van de celophanging en zorg ervoor dat de ophanging niet van de steiger wegstroomt.
Doe het deksel op de plaat en plaats het in een incubator op 37 graden Celsius, 5% kooldioxide en 100% vochtigheid gedurende 60 tot 90 minuten. Vul na de incubatie elke put met 700 microliter EC-medium. Incubeer de endotheelsteigers totdat EG-samenvloeiing kan worden waargenomen met behulp van fluorescerende microscopie of gedurende drie dagen.
Verander het medium om de andere dag. Bereid DPSC medium door 500 milliliter dmem met lage glucose, 57,5 milliliter FBS, 5,75 milliliter niet-essentiële aminozuren, 5,75 milliliter GlutaMAX en 5,75 milliliter penicilline-streptomycine-nystatineoplossing te mengen. Breng de endotheelsteigers over in een nieuwe niet-TC 24-put plaat.
Gooi alle media van de huidige plaat met behulp van een pipet of vacuümzuiging en zorg ervoor dat u het vacuüm niet rechtstreeks op de steiger aanbrengt. Plaats een steiger in het midden van elke put en droog de omgeving vervolgens met lichtvacuüm. Verdun trombine- en fibrinogeenvoorraadoplossingen met PBS tot een eindconcentratie van respectievelijk vijf eenheden per milliliter en 15 milligram per milliliter.
Bereid een suspensie van acht miljoen DPSC per milliliter voor in de trombineverdunning en verdeel 12,5 microliter van de suspensie in afzonderlijke microtubes per te zaaien steiger. Zet een pipet van vijf tot 50 microliter op 12,5 microliter en vul deze met fibrinogeenoplossing. Zonder de punt te verwijderen, zet u de pipet op 25 microliter.
Het materiaal in de punt moet stijgen en een leeg volume achterlaten. Druk langzaam op de zuigerknop totdat de vloeistof de tipopening bereikt, maar niet uitlekt. Houd de zuiger in deze positie en plaats de tip in een van de microcentrifugebuizen met de cellen in trombinesuspensie en zorg ervoor dat de tip in contact komt met de vloeistof.
Laat de zuigerknop voorzichtig los en trek de celsuspensie in de punt. Meng beide materialen grondig en vermijd bubbelvorming. Verdeel de gemengde materialen snel over een endotheelsteiger.
Herhaal de vorige stappen voor elke steiger en zorg ervoor dat u tussen het gebruik door van uiteinde wisselt om onverwachte vorming van fibrinegel in de punt te voorkomen. Vervang het deksel van de plaat en incubeer de steigers gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius, 5% kooldioxide en 100% vochtigheid. Vul na incubatie elke put met één milliliter een-op-een DPSC en EC-medium.
Cultuur voor een week, het veranderen van het medium om de andere dag. Verwijder op verschillende tijdstippen tijdens de kweek het medium uit de put en beeld de constructies in met behulp van een confocale microscoop om de vasculaire ontwikkeling of een andere parameter van belang te bestuderen. Dit protocol maakt het mogelijk om tessellated steigers gemaakt van SU-8 fotoresist te fabriceren.
Steigers met verschillende compartimentgeometrieën en zeer nauwkeurige en herhaalbare functies werden verkregen. Met traditionele gelijktijdige seeding van zowel endotheelcellen als ondersteunende cellen, werden de cellen homogeen verdeeld over de steiger, wat resulteerde in onvoorspelbare en ongeorganiseerde vasculaire netwerken. Integendeel, stapsgewijs cel zaaien resulteerde in zeer georganiseerde vasculaire netwerken.
Bij gebruik van fluorescerende endotheelcellen kunnen de vaten in realtime worden afgebeeld. Rode fluorescerende eiwit uitdrukken endotheelcellen werden gekweekt op zeshoekige steigers en afgebeeld. De ondersteunende cellen werden op dag één toegevoegd en de vasculaire netwerken werden om de dag afgebeeld om de ontwikkeling van de bloedvaten te kwantificeren.
Voor elk keerpunt werden brede beelden van de hele steiger gemaakt. De groei van het vaartuig werd gekwantificeerd als totale lengte en oppervlakte van het vaartuig. Een confocale imaging time-lapse werd uitgevoerd om tracking van één vat mogelijk te maken met behulp van veelkleurige endotheelcellen.
Het scheepspad is gegenereerd uit de time-lapse, waardoor het mogelijk is om de migratie van schepen te observeren. De rijping van de bloedvaten werd waargenomen door de aanwezigheid van gladde spieractine en ondersteunende cellen. Voor de cirkelvormige, zeshoekige en kwadraatcompartimenten vermenigvuldigen en organiseren de cellen zich in structuren.
Op dag zeven vertoonden alle vormen een rijk en complex vasculair netwerk. Hogere vergroting beelden onthulden een dichtere gladde spier actine en ondersteuning cel aanwezigheid co-gelokaliseerd met gevormde vaten, evidencing ondersteuning cel rekrutering en differentiatie rond vasculaire structuren. Deze techniek kan worden gebruikt om het gedrag van driedimensionale vasculaire netwerken te bestuderen wanneer ze worden blootgesteld aan verschillende omstandigheden, zoals specifieke celremmers of in aanwezigheid van extra celtypen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het creëren van georganiseerde vasculaire netwerken met behulp van endotheelcellen en ondersteunende cellen in een 3D-omgeving. De methode maakt het mogelijk om het gedrag van vaten te observeren en vasculaire ziekten potentieel te recreëren voor het verkennen van behandelingen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Vasculaire biologie
- Weefseltechniek
- Celkweektechnieken
Achtergrond
- Correcte vasculaire netwerken zijn essentieel voor weefsels die in het laboratorium zijn gekweekt.
- Endotheelcellen spelen een cruciale rol bij de vorming van bloedvaten.
- Inzicht in het gedrag van vaten kan leiden tot vooruitgang in de behandeling van vasculaire aandoeningen.
- Een high-throughput platform maakt gecontroleerde studies van vasculaire netwerken mogelijk.
Doel van de studie
- Om een stapsgewijs zaaiprotocol voor endotheliale cellen te ontwikkelen.
- Om de vorming en het gedrag van vasculaire netwerken te bestuderen.
- Om vasculaire ziekten te recreëren met behulp van patiëntafgeleide cellen.
Gebruikte methoden
- Het onderdompelen van scaffolds in 70% ethanol voor sterilisatie.
- Het wassen van scaffolds in PBS.
- Het mengen van fibronectine met PBS voor celzaaien.
- Het gebruik van een high-throughput platform voor 3D-cultuur.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle creatie van georganiseerde vasculaire netwerken.
- Vermogen om vatenvorming te volgen in een gecontroleerde omgeving.
- Potentieel voor het bestuderen van interacties met verschillende weefseltypen.
- Haalbaarheid van het modelleren van vasculaire aandoeningen voor onderzoek.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor studies naar vasculaire netwerken.
- Het opent wegen voor onderzoek naar vasculaire aandoeningen.
- De techniek kan worden aangepast voor diverse celtypen en condities.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit protocol stelt biopharma R&D-teams in staat om georganiseerde, reproduceerbare vasculaire netwerken in 3D-scaffolds te genereren, wat bijdraagt aan de mechanistische risicoanalyse van angiogene therapieën. Door vasculair gedrag te isoleren in een gecontroleerd systeem met een hoge doorvoercapaciteit, worden de validatie van targets en het voorspellende vertrouwen in preklinische angiogenesimodellen verbeterd. Deze aanpak vermindert de biologische variabiliteit in studies naar vatvorming, waardoor de reproduceerbaarheid in discovery- en translationele workflows wordt verhoogd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de uitloop van vaten te observeren als reactie op de topografie van het steigerwerk en de geometrie van het compartiment.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd systeem voor functionele doelwitvalidatie van angiogene routes met gebruik van endotheliale cellen afkomstig van patiënten.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door de vorming van het vaatnetwerk te kwantificeren als functionele readout voor routemodulatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert zeer georganiseerde vasculaire netwerken die reageren op micro-omgevingssignalen, wat betrouwbare screening van verbindingen mogelijk maakt.
- Kwantitatieve outputs: Faciliteert de meting van vatlengte, oppervlakte en maturiteitsmarkers voor dosis-responsanalyse.
- Hergebruik van het platform: Ondersteunt aanpassing aan co-cultuursystemen en studies naar mechanische stimulus voor schaalbare screeningscampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziektemodellering: Maakt de recreatie van vasculaire aandoeningen mogelijk met behulp van patiëntafgeleide cellen om behandelingseffecten in een ziekterellevant systeem te evalueren.
- Translationele Continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekkingsfase en preklinisch onderzoek door kwantitatieve vasculaire metrieken te verschaffen voor go/no-go-beslissingen.
- Mechanistische Risicoreductie: Verduidelijkt de rol van ondersteuningscellen bij de rijping van vaten, waardoor onzekerheid bij de interpretatie van angiogene mechanismen wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via lead-identificatie tot verfijning van preklinische vasculaire modellen, in het bijzonder voor programma's die gericht zijn op angiogenese.
- Discovery Biology: Ondersteunt het testen van hypothesen over angiogene factoren door real-time tracking van vaatmigratie en netwerkvorming mogelijk te maken.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve vasculaire resultaten die vergelijking van compound-effecten onder verschillende condities mogelijk maken.
- Analytics: Biedt time-lapse imaging en morfometrische gegevens (vatlengte, oppervlakte) ter ondersteuning van statistische analyse van vasculaire responsen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische validatie door observatie van vaatrijping en co-lokalisatie van ondersteunende cellen met gevormde netwerken.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van vasculair gedrag onder gevarieerde condities, inclusief blootstelling aan inhibitoren en co-cultuur met weefselspecifieke cellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de validatie van angiogene targets door mechanistische ambiguïteit bij vaatvorming te verminderen.
- Operationele waarde: VerbeterVoor standaardisatie en reproduceerbaarheid van de generatie van vasculaire netwerken over laboratoria en projecten heen.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van angiogene kandidaten mogelijk te maken via kwantitatieve vasculaire fenotypering.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door functionele gegevens over vasculaire netwerken te leveren voor de prioritering van targets.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in endotheliale celkweek, confocale microscopie en beeldanalyse voor de kwantificering van vaten.
- Afhankelijk van toegang tot fabricagetools voor getesselleerde SU-8 scaffolds en incubatiesystemen met nauwkeurige controle van de vochtigheid en CO2.
- Vereist standaardisatie tussen teams wat betreft het tijdstip van uitzaaien, mediumformuleringen en beeldvormingsprotocollen voor consistente resultaten.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het uitbreiden van het protocol naar verschillende celtypen of coatings van de extracellulaire matrix.
- Beperkt door de behoefte aan gespecialiseerde beeldvormingsapparatuur voor het uitvoeren van time-lapse tracking en meerkleurige vattracing.
