Toepassing van muis parthenogenetische haploïde embryonale stamcellen als een substituut van sperma
19 november 2020
Dit artikel is bedoeld om het gebruik van parthenogenetische haploïde embryonale stamcellen aan te tonen als vervanging voor sperma voor de bouw van semi-gekloonde embryo's.
Dit protocol dateert ten onrechte de wijziging van genomisch imprinting in Haploïde muis embryonale stamcellen, aangezien ons onderwerp vanwege valse sperma de generatie van eigen embryo's in muizen mogelijk maakt. De genetische modificatie van een gameet vereist over het algemeen moeilijke technieken. Met behulp van deze methodologie kunnen ouderlijke gameten worden gemanipuleerd in hybride embryonale stamcellen voor latere introductie in muizen als een sperma-vervangende optie.
Aangezien deze methode onze kunstmatige specifieke modificatie van een vaderlijke gameet in embryo's mogelijk maakt, is het bijzonder toepasbaar voor het onderzoek naar genomisch imprinting en cauterisatie. Het demonstreren van deze procedure zal worden gedaan door Charles Etienne Dumeau, een muis embryoloog uit mijn laboratorium. Om houd- en microinjectie pipetten voor het experiment voor te bereiden, gebruikt u eerst een micropipettrekker om borosilicaat glas capillairen met een langwerpige vorm en een geleidelijke versmalling te trekken.
Om houdpijpetten voor te bereiden, plaatst u een getrokken capillair met een buitendiameter van 60 tot 100 micrometer in een microsmeedijzer boven de glazen kraal op het filament. Schakel het filament in en laat de capillair zakken tot deze contact maakt met de kraal. Wanneer de capillair aan de kraal is bevestigd, schakelt u het filament uit en trekt u de capillair terug, waardoor de capillair met een rechte uiteind breekt.
Plaats vervolgens het gebroken capillairtip horizontaal naast de glazen kraal op het filament en verwarm het filament om het uiteinde te smelten tot de binnendiameter van het capillairtip 10 tot 20 micrometer in diameter bereikt. Plaats vervolgens de capillair boven de glazen kraal ongeveer een millimeter van de punt en verwarm het filament om de capillair te buigen tot een hoek van 20 graden. Om een micro-injectiepijp te bereiden, plaatst u een getrokken capillair met een buitendiameter van ongeveer zes micrometer boven de glazen kraal op het verwarmde filament en laat de capillair zakken tot deze contact maakt met de kraal.
Zodra de capillair is bevestigd, schakelt u het filament uit en trekt u de capillair terug. De capillair zal met een rechte uiteind breken. Beweeg vervolgens de capillair over de glazen kraal ongeveer een millimeter van de capillairtip en verwarm het filament om de capillair te buigen tot een hoek van 20 graden.
Om een intracytoplasmatische injectie uit te voeren, plaatst u vijf microliter druppels PVP-oplossing en 20 microliter druppels M2-medium op de omgekeerde deksel van een 10 centimeter schaal en bedek de druppels met minerale olie. Plaats de schaal op het podium en installeer een houdpijp op de micromanipulator. Gebruik een micro-ladertip om de micro-injectiepijp te vullen met fluorocarbon olie en monteer de pijp op de piezo-actuator.
Neem door het microscoop waar, laat de micro-injectiepijp zakken in een druppel PVP-oplossing. Wanneer de pijp is ondergedompeld, pijp omhoog en omlaag meerdere keren om het glas met de PVP te bedekken. Laad een kleine hoeveelheid PVP-oplossing in de micro-injectiepijp.
Dompel de micro-injectie en houdpijpen in het M2-medium en focus op de pijp aan de onderkant van de druppel. Breng ongeveer twee microliter van de dubbele knockout parthogeense ES-cel suspensie over in de druppel M2-medium en gebruik een mondpijp om 10 M2-eicellen over te brengen naar dezelfde druppel. Draai een eicel rond en breng negatieve druk toe via de houdpijp om de eicel vast te houden zodat de perivitelline ruimte naar de micro-injectiepijp kijkt, waarbij erop wordt gelet dat de metafase twee plaat niet in de weg van de micro-injectiepijp is gepositioneerd.
Zuig een dubbele knockout parthogeense ES-cel in de punt van de micro-injectiepijp en bevestig de ruptuur van de celmembraan. Breng lichte negatieve druk toe op de micro-injectiepijp en lever vier piezo-impulsen terwijl u de punt van de micro-injectiepijp naar de perivitelline ruimte duwt om door de zona pellucida te breken. Dring de eicel binnen met een micro-injectiepijp zodat de oolemma zich naar de andere kant uitrekt en breng één piezo-puls toe om de oolemma te doorboren, ervoor zorgen dat de oolemma ontspant langs de schacht van de micro-injectiepijp.
Injecteer de dubbele knockout parthogeense ES-cel met een minimale hoeveelheid medium in het ooplasma en trek de micro-injectiepijp soepel uit de eicel. Laat de geïnjecteerde eicel los uit de houdpijp en verplaats deze naar de zijkant van de micro druppel voor latere verzameling. Wanneer alle eicellen zijn geïnjecteerd, brengt u de eicellen over naar een voorverwarmde centrumput schaal met KSOM-medium en incubeert u de schaal gedurende één uur op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide voor activering.
DNA-inhoudsanalyse van deze representatieve dubbele knockout parthogeense ES-cel lijn, die het CAG/EGFP transgeen draagt door middel van flowcytometrie, illustreert de verdeling van haploïde en diploïde cellen in de G0, G1, S en G2 M fases. Genotypering kan worden uitgevoerd om de afwezigheid van wild type allelen bij de H19 en intergene differentieel gemethyleerde regio's te bevestigen. Een CAG/EGFP transgeen kan worden geïntroduceerd in dubbele knockout pathogene ES-cellen om hun bijdrage aan semi-gekloonde embryo's te bestuderen door de visualisatie van groen fluorescerend licht onder een microscoop.
Flowcytometrieanalyse toont twee populaties die overeenkomen met de G2 M fase gearresteerde haploïde en diploïde cellen na behandeling met demuculcene. De afwezigheid van een 1N haploïde piek geeft aan dat de rustcyclus van de cel grotendeels voltooid was. Na injectie wordt EGFP-expressie zelden gedetecteerd in de geconstrueerde semi-gekloonde embryo's.
Terwijl het cytoplasma van dubbele knockout parthogeense ES-cellen zich verspreidt in de grote cytoplasma van de eicel. Zes uur na activering kunnen tot drie polare lichamen worden waargenomen onder de microscoop. De eerste en tweede polare lichamen van de eicel en één pseudo polare lichaam van de haploïde ESC.
Om hun ontwikkelingscompetentie aan te tonen, kunnen semi-gekloonde embryo's
Overzicht
Dit artikel demonstreert het gebruik van parthenogenetische haploïde embryonale stamcellen als vervanger voor sperma bij het construeren van semi-gekloneerde embryo's. De methodologie maakt genetische manipulatie van gameten mogelijk, wat de studie naar genomische imprinting faciliteert.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Onderzoek naar embryonale stamcellen
- Genomische imprinting
- Reproductieve biologie
Achtergrond
- Haploïde embryonale stamcellen van muizen kunnen worden gemodificeerd om embryo's te creëren.
- Traditionele technieken voor gametenmanipulatie zijn complex.
- Parthenogenetische stamcellen bieden een nieuwe benadering voor de creatie van embryo's.
- Dit onderzoek is van groot belang voor het begrijpen van genetische bijdragen aan de embryonale ontwikkeling.
Doel van de studie
- Om het potentieel van haploïde embryonale stamcellen als alternatief voor sperma te verkennen.
- Om genomische imprinting via gemodificeerde gameten te onderzoeken.
- Om de procedure voor het creëren van semi-gekloneerde embryo's te demonstreren.
Gebruikte Methoden
- Voorbereiding van de vasthoud- en micro-injectiepipetten.
- Intracytoplasmatische injectie van parthenogenetische ES-cellen in oocyten.
- Flowcytometrie voor DNA-gehalteanalyse.
- Kweek van semi-gekloneerde embryo's tot het blastocyststadium.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle injectie van haploïde ES-cellen in oocyten.
- Observatie van pollichamen en embryo-ontwikkeling.
- Generatie van vrouwelijke muizen op volle termijn uit semi-gekloneerde embryo's.
- Analyse van genetische modificaties en hun implicaties.
Conclusies
- Parthenogenetische haploïde embryonale stamcellen kunnen sperma effectief vervangen.
- Deze methode vergroot het begrip van genomische imprinting.
- Potentiële toepassingen in de reproductieve biologie en genetisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directieleden
Dit protocol maakt gerichte manipulatie van vaderlijke genomische bijdragen in muisembryo's mogelijk en biedt een schaalbaar systeem voor het valideren van hypothesen met betrekking tot imprinting en kiemlijnoverdracht. Door sperma te vervangen door genetisch gemodificeerde haploïde embryonale stamcellen kunnen onderzoekers vaderlijke alleleffecten isoleren zonder storende moederlijke bijdragen, waardoor het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie wordt vergroot. Deze aanpak ondersteunt vroege discovery-workflows waarin mechanistische helderheid en allelspecificiteit essentieel zijn voor portfoliotriage.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de functie van het vaderlijke allel bij de embryonale ontwikkeling te onderzoeken door sperma te vervangen door bewerkte haploïde embryonale stamcellen.
- Operationele waarde: Biedt een hernieuwbare bron van genetisch manipuleerbare mannelijke gametenequivalenten voor een consistente experimentele input.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de studie naar mechanismen van genomische imprinting via gecontroleerde disruptie van differentieel gemethyleerde regio's zoals H19.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert semi-gekloneerde embryo's met gedefinieerde vaderlijke genotypen voor fenotypische screening van ontwikkelingsuitkomsten.
- Operationele waarde: Standaardiseert de productie van embryo's via intracytoplasmatische injectie, waardoor variabiliteit in gametenkwaliteit wordt verminderd en reproduceerbare assaycondities mogelijk worden.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt flowcytometrie-gebaseerde kwantificering van haploïde/diploïde celpopulaties om de genetische integriteit vóór gebruik te bevestigen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt de generatie van vruchtbare semi-gekloneerde muizen mogelijk, wat longitudinale beoordeling van genetische modificaties via kiemlijnoverdracht toestaat.
- Operationele waarde: Ondersteunt preklinische modellering van imprintingstoornissen door embryo's met gedefinieerde epigenetische toestanden te produceren.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar effecten van de ouderlijke oorsprong in ziekte-relevante systemen mogelijk met behulp van androgene of parthenogenetische haploïde ESC-lijnen.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door nauwkeurige bewerking van het vadersgenoom mogelijk te maken vóór de vorming van het embryo, wat hypothesetests en mechanistische risicobeperking bij vroege targetvalidatie ondersteunt.
- Discovery Biology: Maakt de isolatie van de vaderlijke bijdrage aan de activering van het zygotische genoom en de vestiging van imprinting mogelijk door het genotype van de haESC te controleren.
- Screening: Levert gestandaardiseerde embryo's met gedefinieerde vaderlijke genotypen voor consistente fenotypische resultaten in verbindingen- of genetische screenings.
- Analytics: Maakt DNA-gehalteanalyse via flowcytometrie mogelijk om de haploïde status en de efficiëntie van genetische modificatie vóór injectie te bevestigen.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de generatie van semi-gekloneerde nakomelingen om de langetermijn fenotypische en epigenetische gevolgen van vaderlijke genoommodificaties te beoordelen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een platform voor iteratieve genetische modificatie van de mannelijke gametische input, toepasbaar op meerdere targets en studies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in de vaderlijke genfunctie door het elimineren van materiale genomische ruis in vroege embryo's.
- Operationele waarde: Verhoogt de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde workflows voor de preparatie van haESC en intracytoplasmatische injectie.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door kiemlijntransmissiestudies mogelijk te maken zonder dat er mannelijke fokkolonies onderhouden hoeven te worden.
- Impact op de portfolio: Informeert go/no-go-beslissingen door ouder-specifieke fenotypes vroegtijdig in de ontdekkingsfase te onthullen.
Overwegingen voor implementatie
- Expertise in muisembryologie, micromanipulatie en de kweek van haploïde embryonale stamcellen is vereist.
- Microforge- en piezo-actuatorsystemen zijn noodzakelijk voor de preparatie van pipetten en precieze intracellulaire aflevering.
- Standaardisatie van de kwaliteit van de haESC-lijn, inclusief ploidie en de status van genetische modificatie, is cruciaal voor consistente resultaten.
- Aanpassing aan androgene haESC-lijnen maakt substitutie van vaderlijke of moederlijke gameten mogelijk, afhankelijk van het onderzoeksontwerp.
- Embryo-activatie en kweekcondities moeten worden geoptimaliseerd om ontwikkeling tot het blastocyst- en termijnstadium te ondersteunen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:09
Holding and Microinjection Pipette Preparation
2:58
Intracytoplasmic Double Knockout Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cell (DKO-phaESC) Injection
5:34
Results: Representative Establishment and Application of DKO-phaESC
7:23
Conclusion
