Name: Toepassing van muis parthenogenetische haploïde embryonale stamcellen als een substituut van sperma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Leer hoe parthenogenetische haploïde embryonale stamcellen als spermavervanger worden gebruikt om semi-gekloonde muizenembryo's te creëren. Deze methode vergemakkelijkt genetische manipulatie en genomische imprintingonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr. Giulio Di Minin voor het afleiding van phaESC-lijnen en Dr. Remo Freimann voor de werking van flowcytometrie. We erkennen ook mevrouw Michèle Schaffner en de heer Thomas M. Hennek voor technische ondersteuning bij embryotransfer. Dit werk werd ondersteund door de Swiss National Science Foundation (subsidie 31003A_152814/1).

<ol><li>Ellegren, H., Galtier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+genetic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">Determinants of genetic diversity.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (7), 422-433 (2016).</li>
<li>Huijbers, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice%3A+A+decision+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice: A decision guide.</a> Methods in Molecular Biology. 1642, 1-19 (2017).</li>
<li>Aizawa, E., Dumeau, C. E., Freimann, R., Di Minin, G., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidy+of+semi-cloned+embryos+generated+from+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Polyploidy of semi-cloned embryos generated from parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> PloS One. 15 (9), 0233072(2020).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+live+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice.</a> Nature. 490 (7420), 407-411 (2012).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+fertile+bimaternal+offspring+following+intracytoplasmic+injection+of+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Birth of fertile bimaternal offspring following intracytoplasmic injection of parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell Research. 26 (1), 135-138 (2016).</li>
<li>Wan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+fertile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells produce fertile mice.</a> Cell Research. 23 (11), 1330-1333 (2013).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genetically+modified+mice+by+oocyte+injection+of+androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell. 149 (3), 605-617 (2012).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+efficiently+support+mouse+generation+by+oocyte+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells efficiently support mouse generation by oocyte injection.</a> Cell Research. 26 (1), 131-134 (2016).</li>
<li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+genetics+through+derivation+of+haploid+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse genetics through derivation of haploid mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 563-574 (2011).</li>
<li>Leeb, M., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+haploid+embryonic+stem+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Derivation of haploid embryonic stem cells from mouse embryos.</a> Nature. 479 (7371), 131-134 (2011).</li>
<li>Surani, M. A., Barton, S. C., Norris, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+reconstituted+mouse+eggs+suggests+imprinting+of+the+genome+during+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis.</a> Nature. 308 (5959), 548-550 (1984).</li>
<li>Li, Z. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bimaternal+and+bipaternal+mice+from+hypomethylated+haploid+ESCs+with+imprinting+region+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of bimaternal and bipaternal mice from hypomethylated haploid ESCs with imprinting region deletions.</a> Cell Stem Cell. 23 (5), 665-676 (2018).</li>
<li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+maintenance+of+mouse+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Shuai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mammalian+offspring+by+haploid+embryonic+stem+cells+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of mammalian offspring by haploid embryonic stem cells microinjection.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 31, 1-15 (2014).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2014).</li>
<li>O'Neill, G. T., Rolfe, L. R., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+potential+and+chromosome+constitution+of+strontium-induced+mouse+parthenogenones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Developmental potential and chromosome constitution of strontium-induced mouse parthenogenones.</a> Molecular Reproduction and Development. 30 (3), 214-219 (1991).</li>
<li>Campbell, K. H., McWhir, J., Ritchie, W. A., Wilmut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sheep+cloned+by+nuclear+transfer+from+a+cultured+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line.</a> Nature. 380 (6569), 64-66 (1996).</li>
<li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).</li>
<li>Wilmut, I., Schnieke, A. E., McWhir, J., Kind, A. J., Campbell, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+offspring+derived+from+fetal+and+adult+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.</a> Nature. 385 (6619), 810-813 (1997).</li>
<li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+frogs+derived+from+the+nuclei+of+single+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells.</a> Developmental Biology. 4, 256-273 (1962).</li>
<li>Campbell, K. H., Alberio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+the+genome%3A+role+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+Supplement%22%5BJournal%5D)">Reprogramming the genome: role of the cell cycle.</a> Reproduction Supplement. 61, 477-494 (2003).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-mediated+genetic+screening+in+mice+with+haploid+embryonic+stem+cells+carrying+a+guide+RNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-mediated genetic screening in mice with haploid embryonic stem cells carrying a guide RNA library.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 221-232 (2015).</li>
<li>Bai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genetic+screening+in+mice+through+haploid+embryonic+stem+cells+identifies+critical+genes+in+bone+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeted genetic screening in mice through haploid embryonic stem cells identifies critical genes in bone development.</a> PLoS Biology. 17 (7), 3000350(2019).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-mediated+base-editing+screening+in+mice+identifies+DND1+amino+acids+that+are+critical+for+primordial+germ+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development.</a> Nature Cell Biology. 20 (11), 1315-1325 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Het klonen van zoogdieren door somatische celkernoverdracht (SCNT) is in de jaren negentig1990 19,20,21geïntroduceerd . Deze ontwikkelingen volgden op kloonstudies die 30 jaar eerder bij amfibieën werden uitgevoerd22. De aanzienlijke vertraging weerspiegelt de moeilijkheid van embryologie en genomische inprenting bij zoogdieren. De ontwikkeling van zoogdier SCNT is de basis voor de toepassing van haESC voor het vervangen van sperma, dat in dit protocol wordt beschreven.
Celcyclussynchronisatie is een belangrijke factor voor het succes van SCNT23. Dit is ook het geval voor injectie van haESC in dit protocol. Het introduceren van een donorgenoom in een ontvanger vereist dat de celcyclusfasen worden afgestemd om chromosomale breuk of aneuploïdieën te voorkomen die de embryoontwikkeling zouden inbreken. Semi-klonen heeft de extra complexiteit dat twee genomen en een cytoplast compatibel moeten zijn. Een eerder rapport heeft aangetoond dat injectie van M-fase-gearresteerde androgenetische hemac's betere ontwikkelingssnelheden van semi-gekloonde embryo's opleverde dan injectie van G1-fase hematassen in oöcyten7. Dit rapport stelt M-fase voor als een geschikt synchronisatiepunt voor semi-klonen. Dienovereenkomstig werden phaESC's mitotisch gearresteerd in metafase met demecolcine en geïnjecteerd in het ooplasma van MII-oöcyten, die van nature werden gearresteerd in metafase II van meiose. Belangrijk is dat M-fase arrestatie kan worden bereikt in muis-ESC's met een hoog rendement, wat een uitstekende synchronisatie biedt tussen donor- en ontvangercelcycli.
Tijdens mitose breekt het kernmembraan af en vormt zich een spindel waaraan de gerepliceerde chromosomen zich hechten. Na injectie van M-fase DKO-phaESCs worden zusterchromatiden gescheiden in een pseudopolair lichaam en de zygote7 (Figuur 3E). Bijgevolg draagt een enkele set chromosomen uit een DKO-phaESC bij aan het semi-gekloonde embryo. Het is van cruciaal belang dat de zusterchromatiden van DKO-phaESC-chromosomen na injectie correct kunnen worden gescheiden. Het plasmamembraan van een intacte DKO-phaESC voorkomt segregatie in een pseudopolair lichaam. We hebben inderdaad zeldzame gevallen waargenomen waarin het plasmamembraan van DKO-phaESCs niet was gescheurd en embryo's intacte DKO-phaESCs vertoonden in het ooplasma na injectie (Figuur 3D). Daarom moet ervoor worden gezorgd dat het plasmamembraan van DKO-phaESCs wordt verwijderd door pipetten. Tijdens de injectie is het even belangrijk om de verstoring van de meiotische spindel van de oöcyt te voorkomen, wat kan leiden tot chromosoomsegregatiedefecten en ook aneuploïdie kan veroorzaken.
Bij zoogdieren beperkt genomische imprinting de toepassing van phaESC's als spermavervanging. Parthenogenetische hemoc's bezitten een maternale configuratie van genomische afdrukken, terwijl sperma een vaderlijke configuratie heeft. Daarom is de generatie van voldragen pups niet opgetreden na de injectie van wildtype phaESCs als spermavervanging. Om deze beperking te overwinnen, worden verwijderingen van de IG- en H19- DMR's ontworpen in phaESC's. Wijziging van de ingeprente expressie bij de maternale Igf2-H19 en Gtl2-Dlk1 loci is voldoende om de configuratie van genomische afdrukken te wijzigen om de generatie van semi-gekloonde muizen met een frequentie van meer dan 5,1% mogelijk te maken, gebaseerd op overgedragen 2-cel embryo's. Deze observaties suggereren dat het richten van twee ingeprente genen het genoom van phaESC's verandert in een functionele vaderlijke configuratie die sperma bij muizen kan vervangen. Niettemin is voor deze strategie een permanente genetische modificatie van de phaESC's vereist. Als alternatieve strategie kan androgenetische hematoc worden overwogen. Androgenetische hemacs zijn afgeleid van het spermagenoom en bezitten vaderlijke afdrukken. Er zijn meldingen geweest dat wildtype androgenetische hemdc 's als spermavervanging hebben bijgedragen aan het genereren van voldragen pups met een frequentie tussen 1,3% en 1,9% van de overgedragen embryo 's4,7,24. Voldragen pups zijn ook verkregen door androgenetische hemacs te injecteren met deleties van de IG- en H19-DMR's met een frequentie van 20,2% van de overgedragen 2-cel embryo's24. De verhoogde efficiëntie van semi-klonen met behulp van gemodificeerde androgenetische hemacs is waarschijnlijk omdat afdrukken onstabiel kunnen worden in de cultuur. Afdrukdefecten worden gecorrigeerd door de genetische deleties van kritische DMR's.
Gezien de moeilijkheid om genetische modificaties rechtstreeks in de oöcyt- of spermagenoom te introduceren, zijn hemOC's een waardevol hulpmiddel om de ouderlijke genomen afzonderlijk te manipuleren. Het gebruik van hemUS's als vervanging van sperma biedt een opmerkelijk voordeel voor genoombewerking in de muiskiembaan. Een recente studie heeft crispr/cas9-gebaseerde genoombewerking gecombineerd met de toepassing van hemac's voor de karakterisering van inprentingsgebieden die van cruciaal belang zijn voor embryonale ontwikkeling12. Deze studie analyseerde de rol van de Rasgrf1-DMR in combinatie met de H19-en IG-DMR's bij de ontwikkeling van bimaternal muizen, en de functie van 7 verschillende DMR's in de ontwikkeling van bipaternal muizen. De methode voor het vervangen van hemAC 's door sperma vormde de basis voor genetische screeningbenaderingen voor het identificeren van belangrijke aminozuren binnen het DND1-eiwit in de ontwikkeling van primordiale kiemcellen en voor het identificeren van genen in botontwikkeling24,25,26. Studies over genomische inprenting en genetische screening om belangrijke factoren in de embryonale ontwikkeling te identificeren, zijn aanzienlijke benaderingen voor de toepassing van hemac's als gametische genomen.

Bij zoogdieren zijn gameten de enige cellen die genetische informatie doorgeven aan de volgende generatie. Fusie van een oöcyt en een spermatozoon vormt een diploïde zygote die zich ontwikkelt tot een volwassen dier. Mutaties in gametische genomen worden daardoor geërfd door de nakomelingen en stimuleren genetische variatie in soort1. De introductie van mutaties in de kiembaan is toegepast om genetisch gemodificeerde dieren te produceren voor diverse biologische studies, waaronder de karakterisering van genfunctie en ziektemodellering. Zowel oöcyten als spermatozoa zijn terminaal gedifferentieerde en zeer gespecialiseerde cellen die de proliferatie hebben gestaakt. Daarom is directe modificatie van gameten technisch moeilijk en zijn gespecialiseerde benaderingen ontwikkeld. Genetische modificaties kunnen in de kiembaan van de muis worden geïntroduceerd door de injectie van genetisch gemodificeerde ESCs in blastocysten, waar ze integreren in het zich ontwikkelende embryo en de kiembaan koloniseren. Bovendien is genetische modificatie van zygotes met behulp van genoombewerkingsbenaderingen, waaronder het CRISPR / Cas9-systeem, op grote schaal overgenomen2.
Onlangs is een uitstekende aanpak gerapporteerd, die hemAT 's toepast als vervanging voor een gametisch genoom3,4,5,6,7,8. Hemocysten zijn stamcellijnen afgeleid van de binnenste celmassa van parthenogenetische of androgenetische haploïde blastocysten en bezitten een enkele set chromosomen4,7,9,10. Het is aangetoond dat zowel parthenogenetische als androgenetische hemacs kunnen bijdragen aan het genoom van semi-gekloonde muizen na intracytoplasmatische injectie in oöcyten. In tegenstelling tot andere benaderingen kunnen de genomen van hemoc's direct in cultuur worden gewijzigd vanwege hun zelfvernieuwingsvermogen. Het introduceren van genetische modificaties in de kiembaan door sperma te vervangen door hemic's is een belangrijke methode voor biologische studies. Het voorziet in de mogelijkheid om het maternale of vaderlijke genoom, dat is afgeleid van respectievelijk parthenogenetische of androgenetische hemacs, afzonderlijk te culteren en te manipuleren. HemA's kunnen vervolgens worden gebruikt als gametische genoomvervanging, wat vooral voordelig is voor studies van genomische inprenting, allelspecifieke expressie en ouderlijke specifieke processen.
Bij muizen is zowel maternale als vaderlijke genomische informatie vereist voor de normale embryoontwikkeling11. Daarom konden voldragen pups niet worden verkregen wanneer wild-type parthenogenetische hemk's (phaESC's) werden geïnjecteerd ter vervanging van het spermagenoom5,8. Om het ontwikkelingsblok te overwinnen, moet genomische inprenting van het maternale genoom van parthenogenetische hemac's worden gecorrigeerd tot een vaderlijke configuratie. Dit kan worden bereikt door manipulatie van de differentieel gemethyleerde regio's (DMR's). Tot op heden zijn gerichte deleties van de H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR en Rasgrf1-DMR bestudeerd om maternale genen in phaESC's3,5,8,12te onderdrukken . Deze studies toonden aan dat deleties van zowel de H19-DMR als de IG-DMR voldoende zijn om een moeder om te zetten in een vaderlijke afdrukconfiguratie die spermachromosomen kan vervangen. Intracytoplasmatische injectie van phaESC's die de twee DMR-deleties in oöcyten vervoeren, leverde semi-gekloonde pups op met een frequentie tussen 5,1% en 15,5% van de overgedragen 2-cel embryo's.
Dit protocol is gebaseerd op de toepassing van phaESC's met schrappingen van zowel H19-DMR als IG-DMR, die we double-knockout phaESCs (DKO-phaESCs) genoemden. We geven gedetailleerde instructies voor de wijziging van genomische imprinting in phaESC's om DKO-phaESC-lijnen vast te stellen, voor de injectie van DKO-phaESC's in oöcyten als vervanging voor een spermagenoom, voor de kweek van semi-gekloonde embryo's tot blastocysten en voor het verkrijgen van semi-gekloonde muizen. Dit protocol is een referentie voor onderzoekers die nauwkeurige en directe manipulatie van het vaderlijke genoom en de generatie van semi-gekloonde embryo's en muizen vereisen.

<table><tbody><tr><td>1.5 mLTube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>15 ml Tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>150628</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Merck</td><td>M6250</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>BSA fraction</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>Demecolcine solution</td><td>Merck</td><td>D1925</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>DR4 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3208</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>FBS</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>Freezing medium</td><td>amsbio</td><td>11897</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Merck</td><td>G1890</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>Hepes solution</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>Irradiated MEF</td><td>Gibco</td><td>A34966</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>LIF (Leukemia inhibitory factor)</td><td>(Homemade)</td><td>-</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>Lipofection reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>NDiff 227</td><td>Takara</td><td>Y40002</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene</td><td>Addgene</td><td>#40973</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>piggyBac transposase plasmid</td><td>System Biosciences</td><td>PB210PA-1</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>pX330 plasmid</td><td>Addgene</td><td>#42230</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>pX458 plasmid</td><td>Addgene</td><td>#48138</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>haESC-kweek</td></tr><tr><td>DNA polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549S</td><td>Genotypering</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>Genotypering</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Genotypering</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>Genotypering</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>109634</td><td>Genotypering</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Axon</td><td>A3830</td><td>Genotypering</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Merck</td><td>71729</td><td>Genotypering</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>Genotypering</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Epeendorf</td><td>5384000012</td><td>Genotypering</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>T1503</td><td>Genotypering</td></tr><tr><td>5 mL Tube</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>5 mL Tube with cell strainer cap</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Codan</td><td>62.1640</td><td>Superovulatie</td></tr><tr><td>30-gauge 1/2 inch needle</td><td>Merck</td><td>Z192362-100EA</td><td>Superovulatie</td></tr><tr><td>B6D2F1 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>100006</td><td>Superovulatie</td></tr><tr><td>hCG</td><td>MSD animal health</td><td>49451</td><td>Superovulatie</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010015</td><td>Superovulatie</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Avivasysbio</td><td>OPPA1037 5000 IU</td><td>Superovulatie</td></tr><tr><td>10-cm dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td>Embryo manipulatie</td></tr><tr><td>4-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td>Embryo manipulatie</td></tr><tr><td>50 mL tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>Embryo manipulatie</td></tr><tr><td>6 cm dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td>Embryo manipulatie</td></tr><tr><td>Center-well dish</td><td>Corning</td><td>3260</td><td>Embryo manipulatie</td></tr><tr><td>Digital rocker</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880020</td><td>Embryo manipulatie</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>AppliChem</td><td>A0878</td><td>Embryo manipulatie</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Merck</td><td>H4272</td><td>Embryo manipulatie</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-5F</td><td>Embryo manipulatie</td></tr><tr><td>M16 medium</td><td>Merck</td><td>M7292</td><td>Embryo manipulatie</td></tr><tr><td>M2 medium</td><td>Merck</td><td>M7167</td><td>Embryo manipulatie</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Merck</td><td>M8410</td><td>Embryo manipulatie</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Merck</td><td>P1049-1PAK</td><td>Embryo manipulatie</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Embryo manipulatie</td></tr><tr><td>Strontium chloride</td><td>Merck</td><td>13909</td><td>Embryo manipulatie</td></tr><tr><td>5ml syringe</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td>Microinjectie</td></tr><tr><td>Borosilicate glass cappilary</td><td>Science product</td><td>GB100T-8P</td><td>Microinjectie</td></tr><tr><td>CellTram 4r Oil</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Microinjectie</td></tr><tr><td>Fluorinert FC-770</td><td>Merck</td><td>F3556</td><td>Microinjectie</td></tr><tr><td>Holding pipette</td><td>BioMedical Instruments</td><td>-</td><td>Microinjectie</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td>Microinjectie</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Microinjectie</td></tr><tr><td>Microinjection pipette</td><td>BioMedical Instruments</td><td>-</td><td>Microinjectie</td></tr><tr><td>Microlaoder tips</td><td>Eppendorf</td><td>5252 95

toepassing van muis parthenogenetische haploïde embryonale stamcellen als een substituut van sperma

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

In organismen met seksuele voortplanting zijn kiemcellen de bron van totipotente cellen die zich ontwikkelen tot nieuwe individuen. Bij muizen creëert de bevruchting van een oöcyt door een spermatozoon een totipotente zygote. Onlangs hebben verschillende publicaties gemeld dat haploïde embryonale stamcellen (hemoc's) een substituut kunnen zijn voor gametische genomen en kunnen bijdragen aan embryo's, die zich ontwikkelen tot muizen. Hier presenteren we een protocol om parthenogenetische hemoc's toe te passen als vervanging van sperma om embryo's te construeren door intracytoplasmatische injectie in oöcyten. Dit protocol bestaat uit stappen voor het voorbereiden van hemAC's als spermavervanging, voor injectie van hemC-chromosomen in oöcyten en voor de kweek van semi-gekloonde embryo's. De embryo's kunnen vruchtbare semi-gekloonde muizen opleveren na embryotransfer. Het gebruik van hemac's als spermavervanging vergemakkelijkt genoombewerking in de kiembaan, studies van embryonale ontwikkeling en onderzoek naar genomische imprinting.

Het doel van dit protocol is om hematbussen toe te passen als vervanging van sperma om semi-gekloonde embryo's en muizen te verkrijgen. Voor dit doel werd een DKO-phaESC-lijn met het CAG-EGFP-transgeen gegenereerd en gebruikt voor intracytoplasmatische injectie in MII-oöcyten. Om een geschikte phaESC-lijn met een vaderlijke afdrukconfiguratie te verkrijgen, hebben we genetische manipulatie uitgevoerd met Cas9-nucleases. Een haploïde ESC-lijn bevat haploïde en diploïde cellen die ontstaan als gevolg van een inherente tendens van haploïde ESC's voor diploidisatie10. Een haploïde chromosoomset is een voorwaarde voor een succesvolle vervanging van het spermagenoom. DNA-inhoudsanalyse per flowcytometrie toont de verdeling van haploïde en diploïde cellen in G0/G1-, S-en G2/M-fasen (figuur 2A).
Om de DKO-phaESC-lijnen vast te stellen, werden wildtype phaESC-lijnen getransfecteerd met piggyBac transposon-constructies voor stabiele transgene EGFP-expressie en met CRISPR/Cas9-plasmiden voor het verkrijgen van schrappingen van de H19- en IG-DMR's. Om diploïde ESC's uit te sluiten en alleen haploïde ESC's te isoleren die EGFP uitdrukken, werd een specifieke sorteerpoort gedefinieerd (Figuur 2A). Enkele haploïde EGFP-positieve cellen werden vervolgens in individuele putten van 96-putplaten geplateerd om subklonen te verkrijgen. MEF-feeders werden gebruikt om de plating-efficiëntie en overleving van de transfected phaESCs te verhogen. Na uitbreiding van de culturen werd een eerste ronde genotypering uitgevoerd door PCR om subklonen te identificeren die verwijderingen van beide DMR's met zich meebrengen. Nadat MEF-feeders uit de culturen waren verwijderd, werd een tweede genotypering uitgevoerd om de afwezigheid van wildtype allelen bij de H19- en IG-DMRs (Figuur 2B) te bevestigen. Van in totaal 135 subkloontjes kregen we 5 haploïde DKO-phESC lijnen die de verwijderde allelen droegen en vrij waren van wildtype allelen van zowel de H19-DMR als de IG-DMR.
Een CAG-EGFP-transgeen werd geïntroduceerd in DKO-phaESC's om hun bijdrage aan semi-gekloonde embryo's te bestuderen door visualisatie van groene fluorescentie onder een microscoop (Figuur 3A). Voor de intracytoplasmatische injectie werden DKO-phaESCs behandeld met demecolcine om ze in de M-fase te arresteren. Zo werd de celcyclus van DKO-phaESC's gesynchroniseerd met die van MII-oöcyten. Flow cytometrie analyse toonde 2 populaties die overeenkomen met G2/M fase gearresteerd haploïde (2n) en diploïde cellen (4n) na de behandeling met demecolcine (Figuur 3B). Afwezigheid van de 1n haploïde piek gaf aan dat de celcyclus arrestatie grotendeels voltooid was. M-fase haploïde ESC's werden vervolgens gesorteerd en geïnjecteerd in oöcyten. Hiervoor werd een enkele DKO-phaESC in de micro-injectiepipet geladen en geïnjecteerd in het cytoplasma van een MII-oöcyt (figuur 3C). Het plasmamembraan van de DKO-phaESC werd gescheurd door pipetten in de punt van de micro-injectiepipet.
Na de injectie werd egfp-expressie zelden gedetecteerd in de geconstrueerde semi-gekloonde embryo's, omdat het cytoplasma van DKO-phaESC's zich had verspreid in het grote cytoplasma van de oöcyt (figuur 3D). In zeldzame gevallen kon een ronde vlek van intense EGFP-expressie worden waargenomen in het ooplasma. Deze observatie werd waarschijnlijk veroorzaakt door de onbedoelde injectie van intacte DKO-phaESCs. Het niet scheuren van het DKO-phaESC-celmembraan is waarschijnlijk niet compatibel met verdere embryoontwikkeling en moet worden vermeden. Een uur na de injectie werden embryo's geactiveerd door behandeling met strontiumchloride18. Zes uur na het begin van de activering werden maximaal 3 polaire lichamen onder de microscoop waargenomen (figuur 3E). Deze polaire lichamen komen overeen met de eerste en tweede polaire lichamen van de oöcyt en een pseudo polair lichaam uit de DKO-phaESC7. Bovendien werden twee pronuclei waargenomen onder een differentiële interferentiecontrastmicroscoop, die leek op het pronucleaire stadium van zygotes na normale bevruchting met sperma.
Om ontwikkelingscompetentie aan te tonen, werden semi-gekloonde embryo's gekweekt tot het blastocyststadium (figuur 5A). Bovendien werd een voldragen muis verkregen na het overbrengen van semi-gekloonde 2-cel stadium embryo's in de eileiders van een ontvangende vrouw (Figuur 5B). Zoals verwacht was de muis afgeleid van een semi-gekloond embryo een vrouw, omdat noch oöcyt noch van oöcyt afgeleide phaESC's een Y-chromosoom dragen. De semi-gekloonde muis was openlijk normaal en produceerde gezonde nakomelingen toen hij werd gepaard met een wild type Zwitsers Webster-mannetje. Tot nu toe leeft de semi-gekloonde muis al meer dan 600 dagen zonder duidelijke gezondheidsproblemen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig01v3.jpg"> Figuur 1: Overzicht van de toepassing van DKO-phaESCs als spermavervanging. (A) Een tijdschema van de procedures van het protocol. (B) De regeling toont de stappen voor het vaststellen van DKO-phaESC-lijnen (stappen 1–6). (C) Het schema toont de stappen om semi-gekloonde embryo's te construeren door intracytoplasmatische injectie van een DKO-phaESC in een MII-oöcyt (stappen 7-14). Afkortingen: DKO = double-knockout; phaESC = parthogenetische haploïde embryonale stamcel; FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering; MEF = embryonale fibroblast van de muis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig02v2.jpg"> Figuur 2: Vaststelling van DKO-phaESC lijnen door CRISPR/Cas9-gemedieerde schrappingen van H19- en IG-DMR's. (A) Flow cytometrie analyse van phaESCs na transfectie met piggyBac plasmiden voor stabiele EGFP expressie en met 4 CRISPR/Cas9 plasmiden. Niet-getransfecteerde phaESC's worden als controle weergegeven. Het DNA-profiel (boven) toont de celcyclusverdeling van haploïde en diploïde cellen. G1/S-fase haploïde cellen die EGFP uitdrukken, worden aangegeven door de groene poort (onder, rechts). (B) Genotypering van phaESC-subklonen die werden gekweekt op MEF's (eerste genotypering) en na verwijdering van MEF's (tweede genotypering). Subgekloonde phaESC-lijnen 1, 2, 3 en 4 vertegenwoordigen wildtypecellen, cellen met een H19-DMR-deletie, met een IG-DMR-deletie en met gecombineerde H19-en IG-DMR-deleties. DKO-phaESC lijnen 5–8 bezitten zowel H19-DMR als IG-DMR deleties en zijn vrij van wildtype allelen. Afkortingen: DKO = double-knockout; phaESC = parthogenetische haploïde embryonale stamcel; DMR = differentieel gemethyleerd gebied; MEF = embryonale fibroblast van de muis; EGFP = verbeterd groen fluorescerend eiwit; WT = wildtype. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig03v3.jpg"> Figuur 3: Injectie van mitotisch gearresteerde DKO-phaESC's in MII-oöcyten. (A) Morfologie van een DKO-phaESC-cultuur met een CAG-EGFP-transgeen en verwijderingen van de H19- en IG-DMR's; schaalbalk = 50 μm. (B) Representatieve flow cytometrie analyse van DKO-phaESCs na arrestatie met demecolcine gedurende 8 uur. DKO-phaESCs zonder demecolcine behandeling worden als controle getoond. (C) Morfologie van DKO-phaESC's in de micro-injectiepipet. Een enkele intacte DKO-phaESC voor (links) en na (rechts) scheuren van het plasmamembraan door pipetten wordt getoond; schaalbalk = 20 μm. (D) Geconstrueerde embryo's na injectie van DKO-phaESC's in MII-oöcyten. Er wordt een samengevoegde afbeelding van EGFP-fluorescentie en helder veld weergegeven. Zwarte pijlpunten duiden op ronde vlekken van intense EGFP-expressie na injectie van intacte DKO-phaESC's, die moeten worden vermeden; schaalbalk = 50 μm. (E) Een differentieel interferentiecontrastbeeld van semi-gekloonde embryo's 6 uur na het starten van activering met strontiumchloride wordt getoond. Witte pijlpunten duiden op embryo's met 3 polaire lichamen, waaronder één pseudopolair lichaam uit de geïnjecteerde DKO-phaESC; schaalbalk = 50 μm. Afkortingen: DKO = double-knockout; phaESC = parthogenetische haploïde embryonale stamcel; EGFP = verbeterd groen fluorescerend eiwit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig04.jpg"> Figuur 4: Schema van de opstelling voor intracytoplasmatische injectie van DKO-phaESC's in oöcyten. (A) De opstelling van een injectiepipet, een houdpipet en een oöcyt in de injectiekamer wordt getoond. α, buig de hoek van de micro-injection pipet. (B) Indeling van de druppels in de micromanipulatieschaal voor intracytoplasmatische injectie. Afkortingen: DKO = double-knockout; phaESC = parthogenetische haploïde embryonale stamcel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig05.jpg"> Figuur 5: Ontwikkeling van semi-gekloonde embryo's. (A) Pre-implantatie ontwikkeling van semi-gekloonde embryo's in vitro. Egfp-expressie wordt aanvankelijk waargenomen in viercellige embryo's op dag 2 na intracytoplasmatische injectie. Op dag 4 kan intense EGFP-expressie worden waargenomen bij blastocysten; schaalbalk = 100 μm. (B) Een semi-gekloonde muis verkregen na 2-cel embryotransfer naar een ontvangende vrouw. Op 74 dpp, de semi-gekloonde muis (pijlpunt) leverde haar eerste pups (asterisk) door natuurlijke geboorte na het paren met een wildtype Zwitserse Webster mannetje. Semi-gekloonde embryo's en de semi-gekloonde muis in deze afbeelding zijn identiek aan die gerapporteerd in Aizawa et al.3. Afkortingen: EGFP = enhanced green fluorescent protein; .dpp, dagen post-partum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">Gelatineoplossing</td>
		</tr><tr><td>Component</td>
			<td>Voorraadconcentratie</td>
			<td>Volume / gewicht</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr><tr><td>Water</td>
			<td>-</td>
			<td>500 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Gelatine</td>
			<td>-</td>
			<td>1 g</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Haploïde embryonale stamcel (HaESC) medium</td>
		</tr><tr><td>Component</td>
			<td>Voorraadconcentratie</td>
			<td>Volume / gewicht</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr><tr><td>NDiff 227</td>
			<td>-</td>
			<td>10 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Chir 99021</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>3 μL</td>
			<td>3 μM</td>
		</tr><tr><td>PD 0325901</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr><tr><td>Lif</td>
			<td>1 x 106 IE/ml</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>1.000 IE/ml</td>
		</tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td>
			<td>100x</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">HaESC onderhoudsbuffer</td>
		</tr><tr><td>Component</td>
			<td>Voorraadconcentratie</td>
			<td>Volume / gewicht</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr><tr><td>HaESC-medium</td>
			<td>-</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>HEPES-oplossing</td>
			<td>1 M</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Wasbuffer</td>
		</tr><tr><td>Component</td>
			<td>Voorraadconcentratie</td>
			<td>Volume / gewicht</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr><tr><td>DMEM / F-12</td>
			<td>-</td>
			<td>100 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>BSA-fractie</td>
			<td>7.5%</td>
			<td>7,1 ml</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">MEF-medium</td>
		</tr><tr><td>Component</td>
			<td>Voorraadconcentratie</td>
			<td>Volume / gewicht</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr><tr><td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>500 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>FBS</td>
			<td>-</td>
			<td>56 ml</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>β-Mercaptoethanol</td>
			<td>14,3 mol/L</td>
			<td>3,9 μL</td>
			<td>100 μM</td>
		</tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td>
			<td>100x</td>
			<td>5,6 ml</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Lysisbuffer</td>
		</tr><tr><td>Component</td>
			<td>Voorraadconcentratie</td>
			<td>Volume / gewicht</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr><tr><td>Water</td>
			<td>-</td>
			<td>8,25 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCl (pH 8,5)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr><tr><td>Edta</td>
			<td>0,5 m</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>SDS-oplossing</td>
			<td>10%</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td>Nacl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>400 μL</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr><tr><td>Proteïnase K</td>
			<td>20 mg/ml</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>100 μg/ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Activeringsmedium</td>
		</tr><tr><td>Component</td>
			<td>Voorraadconcentratie</td>
			<td>Volume / gewicht</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr><tr><td>KSOM</td>
			<td>-</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Strontiumchloride</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0,5 M, pH 8,0</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PVP-oplossing</td>
		</tr><tr><td>Component</td>
			<td>Voorraadconcentratie</td>
			<td>Volume / gewicht</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr><tr><td>M2-medium</td>
			<td>-</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Pvp</td>
			<td>-</td>
			<td>0,6 g</td>
			<td>12%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG-oplossing</td>
		</tr><tr><td>Component</td>
			<td>Voorraadconcentratie</td>
			<td>Volume / gewicht</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>PMSG</td>
			<td>500 IE/ml</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 IE/ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">hCG-oplossing</td>
		</tr><tr><td>Component</td>
			<td>Voorraadconcentratie</td>
			<td>Volume / gewicht</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Hcg</td>
			<td>500 IE/ml</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 IE/ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Hyaluronidase medium</td>
		</tr><tr><td>Component</td>
			<td>Voorraadconcentratie</td>
			<td>Volume / gewicht</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr><tr><td>M2-medium</td>
			<td>-</td>
			<td>380 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Hyaluronidase</td>
			<td>10 mg/ml</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>0,5 mg/ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Afkortingen: LIF = leukemie remmende factor; MEF = embryonale fibroblast van de muis;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">FBS = foetale runderserum; DMEM = Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium; BSA = runderserumalbumine;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">EDTA = ethyleendiaminetetraazijnzuur; SDS = natriumdodecylsulfaat; EGTA = ethyleen-bis(oxyethyleenitrilo)tetraazijnzuur;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing; PVP = polyvinylpyrrolidone; hCG = humaan choriongonadotrofine;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG = drachtige merrie serum gonadotropine.</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Recept van medium, buffer en oplossing.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Naam</td>
			<td colspan="2">Volgorde (5' tot 3')</td>
			<td>Toepassing</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">GTG GTT AGT TCT BIJ EEN TGG GG</td>
			<td>Genotyperen</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">AGA TGG GGT KAT TCT TTT CC</td>
			<td>Genotyperen</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT</td>
			<td>Genotyperen</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG</td>
			<td>Genotyperen</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA</td>
			<td>Genotyperen</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">ATA CGA TAC GGC OC CAA CG</td>
			<td>Genotyperen</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCT GCT TAG AGG TAC TAC GCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Lijst van oligonucleotiden.

Dit artikel is bedoeld om het gebruik van parthenogenetische haploïde embryonale stamcellen aan te tonen als vervanging voor sperma voor de bouw van semi-gekloonde embryo's.

Toepassing van muis parthenogenetische haploïde embryonale stamcellen als een substituut van sperma

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

Dit protocol dateert ten onrechte de wijziging van genomisch imprinting in Haploïde muis embryonale stamcellen, aangezien ons onderwerp vanwege valse sperma de generatie van eigen embryo's in muizen mogelijk maakt. De genetische modificatie van een gameet vereist over het algemeen moeilijke technieken. Met behulp van deze methodologie kunnen ouderlijke gameten worden gemanipuleerd in hybride embryonale stamcellen voor latere introductie in muizen als een sperma-vervangende optie.Aangezien deze methode onze kunstmatige specifieke modificatie van een vaderlijke gameet in embryo's mogelijk maakt, is het bijzonder toepasbaar voor het onderzoek naar genomisch imprinting en cauterisatie. Het demonstreren van deze procedure zal worden gedaan door Charles Etienne Dumeau, een muis embryoloog uit mijn laboratorium. Om houd- en microinjectie pipetten voor het experiment voor te bereiden, gebruikt u eerst een micropipettrekker om borosilicaat glas capillairen met een langwerpige vorm en een geleidelijke versmalling te trekken.Om houdpijpetten voor te bereiden, plaatst u een getrokken capillair met een buitendiameter van 60 tot 100 micrometer in een microsmeedijzer boven de glazen kraal op het filament. Schakel het filament in en laat de capillair zakken tot deze contact maakt met de kraal. Wanneer de capillair aan de kraal is bevestigd, schakelt u het filament uit en trekt u de capillair terug, waardoor de capillair met een rechte uiteind breekt.Plaats vervolgens het gebroken capillairtip horizontaal naast de glazen kraal op het filament en verwarm het filament om het uiteinde te smelten tot de binnendiameter van het capillairtip 10 tot 20 micrometer in diameter bereikt. Plaats vervolgens de capillair boven de glazen kraal ongeveer een millimeter van de punt en verwarm het filament om de capillair te buigen tot een hoek van 20 graden. Om een micro-injectiepijp te bereiden, plaatst u een getrokken capillair met een buitendiameter van ongeveer zes micrometer boven de glazen kraal op het verwarmde filament en laat de capillair zakken tot deze contact maakt met de kraal.Zodra de capillair is bevestigd, schakelt u het filament uit en trekt u de capillair terug. De capillair zal met een rechte uiteind breken. Beweeg vervolgens de capillair over de glazen kraal ongeveer een millimeter van de capillairtip en verwarm het filament om de capillair te buigen tot een hoek van 20 graden.Om een intracytoplasmatische injectie uit te voeren, plaatst u vijf microliter druppels PVP-oplossing en 20 microliter druppels M2-medium op de omgekeerde deksel van een 10 centimeter schaal en bedek de druppels met minerale olie. Plaats de schaal op het podium en installeer een houdpijp op de micromanipulator. Gebruik een micro-ladertip om de micro-injectiepijp te vullen met fluorocarbon olie en monteer de pijp op de piezo-actuator.Neem door het microscoop waar, laat de micro-injectiepijp zakken in een druppel PVP-oplossing. Wanneer de pijp is ondergedompeld, pijp omhoog en omlaag meerdere keren om het glas met de PVP te bedekken. Laad een kleine hoeveelheid PVP-oplossing in de micro-injectiepijp.Dompel de micro-injectie en houdpijpen in het M2-medium en focus op de pijp aan de onderkant van de druppel. Breng ongeveer twee microliter van de dubbele knockout parthogeense ES-cel suspensie over in de druppel M2-medium en gebruik een mondpijp om 10 M2-eicellen over te brengen naar dezelfde druppel. Draai een eicel rond en breng negatieve druk toe via de houdpijp om de eicel vast te houden zodat de perivitelline ruimte naar de micro-injectiepijp kijkt, waarbij erop wordt gelet dat de metafase twee plaat niet in de weg van de micro-injectiepijp is gepositioneerd.Zuig een dubbele knockout parthogeense ES-cel in de punt van de micro-injectiepijp en bevestig de ruptuur van de celmembraan. Breng lichte negatieve druk toe op de micro-injectiepijp en lever vier piezo-impulsen terwijl u de punt van de micro-injectiepijp naar de perivitelline ruimte duwt om door de zona pellucida te breken. Dring de eicel binnen met een micro-injectiepijp zodat de oolemma zich naar de andere kant uitrekt en breng één piezo-puls toe om de oolemma te doorboren, ervoor zorgen dat de oolemma ontspant langs de schacht van de micro-injectiepijp.Injecteer de dubbele knockout parthogeense ES-cel met een minimale hoeveelheid medium in het ooplasma en trek de micro-injectiepijp soepel uit de eicel. Laat de geïnjecteerde eicel los uit de houdpijp en verplaats deze naar de zijkant van de micro druppel voor latere verzameling. Wanneer alle eicellen zijn geïnjecteerd, brengt u de eicellen over naar een voorverwarmde centrumput schaal met KSOM-medium en incubeert u de schaal gedurende één uur op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide voor activering.DNA-inhoudsanalyse van deze representatieve dubbele knockout parthogeense ES-cel lijn, die het CAG/EGFP transgeen draagt door middel van flowcytometrie, illustreert de verdeling van haploïde en diploïde cellen in de G0, G1, S en G2 M fases. Genotypering kan worden uitgevoerd om de afwezigheid van wild type allelen bij de H19 en intergene differentieel gemethyleerde regio's te bevestigen. Een CAG/EGFP transgeen kan worden geïntroduceerd in dubbele knockout pathogene ES-cellen om hun bijdrage aan semi-gekloonde embryo's te bestuderen door de visualisatie van groen fluorescerend licht onder een microscoop.Flowcytometrieanalyse toont twee populaties die overeenkomen met de G2 M fase gearresteerde haploïde en diploïde cellen na behandeling met demuculcene. De afwezigheid van een 1N haploïde piek geeft aan dat de rustcyclus van de cel grotendeels voltooid was. Na injectie wordt EGFP-expressie zelden gedetecteerd in de geconstrueerde semi-gekloonde embryo's.Terwijl het cytoplasma van dubbele knockout parthogeense ES-cellen zich verspreidt in de grote cytoplasma van de eicel. Zes uur na activering kunnen tot drie polare lichamen worden waargenomen onder de microscoop. De eerste en tweede polare lichamen van de eicel en één pseudo polare lichaam van de haploïde ESC.Om hun ontwikkelingscompetentie aan te tonen, kunnen semi-gekloonde embryo's

application-mouse-parthenogenetic-haploid-embryonic-stem-cells-as

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Het vermogen van embryonale kiemcellen om in primordiale kiemcellen differentiëren tijdens de vroege ontwikkelingsstadia is een perfect model om onze hypothese te pakken over kanker en onvruchtbaarheid. Dit protocol laat zien hoe primordiale kiemcellen van de ontwikkeling van gonaden isoleren in 10.5-11.5 dagen na coitum muizenembryo's.

Isolatie en Afleiding van muis embryonale cellen Germinal

Protocollen voor kiemcellen transplantatie en testis weefsel xenografting worden beschreven. Germ celtransplantatie resulteert in een donor-afgeleide spermatogenese in de ontvangende testes en vertegenwoordigt een functionele reconstitutie test voor de identificatie van spermatogoniale stamcellen (SSC's). Testis weefsel xenografting reproduceert testis ontwikkeling en spermatogenese van verschillende soorten donor in de ontvangende muizen.

Germ Cell Transplantation en de testis weefsel Xenografting in Muizen

Hier laten we zien de nieuw ontwikkelde I • Cryo-kit voor de muis sperma cryopreservatie. Twee-cellig stadium embryo ontwikkeling met ingevroren-ontdooid sperma werd steeds verbeterd in 5 muizenstammen met het gebruik van deze kit. Over een periode van 1,5 jaar werden 49 genetisch gemodificeerde muis lijnen gearchiveerd door sperma cryopreservatie met de I • Cryo-kit en later met succes teruggevorderd door IVF.

Muis Sperma Cryopreservatie en herstel met behulp van de I · Cryo Kit

Het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPSC) lijnen produceert lijnen van verschillende ontwikkelingspotentieel, zelfs als ze passeren standaard tests voor pluripotentie. Hier beschrijven we een protocol muizen volledig zijn verkregen uit iPSCs die de iPSC lijnen gedefinieerd als hebbende full pluripotentie...

Generatie van Muizen Afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen

Dit artikel beschrijft een protocol om efficiënt ontlenen en cultuur pluripotente stamcellijnen uit muis embryo's in het blastocyst stadium.

Afleiding van stamcellijnen uit muis voor inplanting embryo 's

Hier presenteren we een protocol ter verhoging van de productie van de chimera zonder het gebruik van nieuwe apparatuur. Een verandering van de eenvoudige oriëntatie van het embryo voor injectie kan verhogen van het aantal embryo's geproduceerd, en potentieel het reduceren van de tijdlijn tot germline transmissie.

Trans-inner Cell Mass injectie van embryonale stamcellen tot hogere Chimerism tarieven leidt

Hier presenteren we een aangepaste methode voor cryopreservatie van eencellige embryo's, evenals een protocol dat het gebruik van gevriesontdooide embryo's en elektroporatie koppelt voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen.

Gebruik van gevriesde embryo's voor hoogrendementproductie van genetisch gemodificeerde muizen

Hier presenteren we een protocol voor het ontwikkelen van genetisch gemodificeerde muismodellen met behulp van embryonale stamcellen, vooral voor grote DNA knock-in (KI). Dit protocol is afgestemd met behulp van CRISPR / Cas9-genoombewerking, wat resulteert in een aanzienlijk verbeterde KI-efficiëntie in vergelijking met de conventionele homologe recombinatie-gemedieerde lineaire DNA-targetingmethode.

CRISPR/Cas9-gemedieerde zeer efficiënte gentargeting in embryonale stamcellen voor het ontwikkelen van gen-gemanipuleerde muismodellen

De gepresenteerde cervicale manipulatiemethode kan pseudozwangerschap bij muizen induceren zonder dat het nodig is om vrouwtjes te fokken met vasectomie mannetjes. De inductie van pseudozwangerschap is vereist voor het succes van niet-chirurgische embryotransfer en niet-chirurgische kunstmatige inseminatie, die beide ook worden gepresenteerd.

Het induceren van pseudopregnancy bij vrouwelijke muizen zonder de noodzaak van vasectomie bij mannen voorafgaand aan niet-chirurgische embryotransfer of kunstmatige inseminatie

Hier introduceren we een methode voor het uitvoeren van ronde spermatide-injectie (ROSI) bij muizen, een techniek met veelbelovende klinische toepassingen en bruikbaarheid voor het onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de embryonale ontwikkeling.

Muis Ronde Spermatide Injectie

Dit artikel stelt een pijplijn op voor hoogwaardige eencellige en kernsuspensies van gastrulerende muizenembryo's voor sequencing van individuele cellen en kernen.

Single-cell RNA-sequencing van gemuteerde hele muizenembryo's: van de epiblast tot het einde van de gastrulatie

Leer hoe parthenogenetische haploïde embryonale stamcellen als spermavervanger worden gebruikt om semi-gekloonde muizenembryo's te creëren. Deze methode vergemakkelijkt genetische manipulatie en genomische imprintingonderzoek.

Toepassing van muis parthenogenetische haploïde embryonale stamcellen als een substituut van sperma

Meer video's verkennen