CRISPR/Cas9 Editing van het C. elegans rbm-3.2 Gen met behulp van de dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker en Geassembleerde Ribonucleoproteïne Complexen.

Deze techniek is nuttig voor het introduceren van precieze mutaties in C.elegans door CRISPR/Cas9 genoombewerking binnen een korte tijdsperiode. Deze techniek biedt een efficiënte, gestroomlijnde manier om het C.elegans genoom te bewerken, omdat het gebruik van een Co-CRISPR marker de kans op het identificeren van positief bewerkte wormen aanzienlijk vergroot. Zorg ervoor dat je de micro-injecties oefent en dat je beide gonaden van zoveel mogelijk wormen injecteert om de kans op het verkrijgen van de gewenste bewerkingen te vergroten.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Amy Smith, Mary Bergwell, Danita Mathew, Ellie Smith en Carter Dierlam, die allemaal bachelorstudenten zijn uit mijn laboratorium. Om jonge volwassen wormen voor injectie voor te bereiden, pluk L2, L3 fase C.elegans op een verse bacterie-lawn op een MYOB-plaat en incubeer de plaat overnacht bij 20 graden Celsius. De volgende ochtend bereidt u het injectiemengsel voor zoals beschreven in de tabel in steriele, nuclease-vrije buisjes en meng door te pipetteren.

Incubeer het injectiemengsel gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius om de ribonucleoproteïnecomplexen samen te stellen voordat u de mix door centrifugatie naar beneden spint. Gebruik vervolgens een dissectiemicroscoop om ongeveer 30 jonge volwassen wormen met minder dan 10 embryo's in de baarmoeder te plukken, en injecteer beide gonaden van elke worm met enkele picoliters injectiemengsel per arm. Na micro-injectie gebruikt u een herstelapparaat om geïnjecteerde wormen voorzichtig van het injectiepad op een 60 millimeter MYOB-plaat gezaaid met OP50 E.coli te piketten.

Laat de geïnjecteerde wormen een uur bij kamertemperatuur herstellen. Aan het einde van de herstelperiode gebruikt u een platinadraad om elke geïnjecteerde worm over te brengen naar een enkele gezaaide 35 millimeter MYOB-agarplaat en laat de wormen eieren leggen bij 20 graden Celsius. Na 24 uur verplaatst u de geïnjecteerde wormen naar nieuwe individuele 35 millimeter platen.

Gedurende drie tot vier dagen na de injectie gebruikt u een dissectiemicroscoop om platen te identificeren met F1 nakomelingen die roller-fenotypes vertonen, zoals aangegeven door het lichaam van het dier dat rond zijn lange as draait terwijl de dieren in een cirkelpatroon bewegen, en dumpy-fenotypes, zoals blijkt uit een kortere en stevigere fysiologie vergeleken met controledieren in hetzelfde ontwikkelingsstadium. Breng 50 tot 100 F1 roller wormen over naar hun eigen individuele platen en laat de wormen een tot twee dagen eieren leggen. Na één tot twee dagen F2 wormenproductie, verplaatst u elke enkele F1 roller moeder van een genummerde plaat naar de bijbehorende genummerde PCR-buis met 2,5 microliter lysisbuffer aangevuld met een 1:100 verdunning van 20 milligram per milliliter proteinase K. Vries de buizen gedurende 20 minuten bij min 30 graden Celsius voordat u wormen in een thermocycler lyst, zoals aangegeven.

Aan het einde van de cyclus voegt u 12,5 microliter 2X PCR-mix toe met deoxynucleosidetrifosfaten, DNA-polymerase, magnesiumchloride en laadkleurstof, één microliter van 10 micromolaire voorwaartse primer, één microliter van 10 micromolaire omgekeerde primer en voldoende sterieel water om het reactiemengsel per gelyseerd wormmonster op 25 microliter te brengen. Voer vervolgens de monsters in de thermocycler uit zoals aangegeven. Om te screenen op bewerkingen van minder dan 50 basenparen in lengte, brengt u 10 microliter van elke PCR-reactie over naar een nieuwe buis en voegt u vijf microliter van het restrictie-digestie mastermix toe aan elke buis.

Incubeer de digestiereacties gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, verwarmt en activeert u de digesties met een 10 tot 15 minuten durende incubatie bij 65 graden Celsius. Laad vervolgens de volledige reactie van elke buis in een enkele put van een 1% tot 2% agarosegel en voer de gel uit bij 110 milliampère totdat de juiste bandscheiding is bereikt.

Aan het einde van de run visualiseert u agarosegels onder UV-licht om de DNA-bandgrootten te detecteren. Positief bewerkte wormen zullen een extra DNA-band tonen bij de verwachte grootte als gevolg van bewerking met behulp van de reparatiesjabloon, die de restrictieplaats op de gewenste locus binnen het wormgenoom draagt. Pluk acht tot 12 wild type-uitziende niet-rollende F2 wormen van de respectieve positief bewerkte F1 roller wormplaten en laat de wormen eieren leggen en nakomelingen produceren gedurende één tot twee dagen.

Vervolgens identificeert u de homozygote wormlijnen zoals gedemonstreerd voor positief bewerkte wormen en analyseert u de sequencingresultaten met behulp van sequence-analysesoftware om de aanwezigheid van de bewerking te bevestigen volgens standaardprotocollen. Hier kunnen het genomische DNA en de ontworpen CRISPR RNA en reparatiesjabloon voor het C.elegans rbm-3.2 gen worden waargenomen. In deze representatieve analyse werden zeven van de 73 F1 wormen positief bevonden voor de bewerking.

Niet-bewerkte wormen vertoonden het enkele DNA-fragment van 445 basenparen na EcoRI-digestie, terwijl wormen die een vroegtijdig stopcodon in het rbm-3.2 gen droegen, twee fragmenten bij 265 en 166 basenparen vertoonden na EcoRI-digestie. Heterozygote bewerkte wormen vertoonden drie fragmenten na EcoRI-digestie. Zes van de 12 F2 wormen van de geïdentificeerde positieve F1 heterozygoten bleken homozygoot voor de bewerking van belang te zijn.

Het genomische DNA van een geïdentificeerde homozygote bewerkte wormlijn kan vervolgens worden gebruikt om een DNA-sequencingreactie op te zetten, die de aanwezigheid van de bewerking in zijn homozygote toestand bevestigde. Zorg ervoor dat de bewerkingsreagentia en screeningprimers correct zijn ontworpen en dat het injectiemengsel correct is bereid. Een nauwkeurige micro-injectie is ook cruciaal.

Volgend op deze procedure kunnen fenotyische validatie van de bewerking, indien van toepassing, en gen- en eiwitexpressie-analyse worden uitgevoerd om de nauwkeurigheid van de genoombewerking te verifiëren.</