Microfluïdisch model om de eerste gebeurtenis van neovascularisatie na te bootsen

Neovascularisatie, het genereren van nieuwe bloedvaten is een sterk gereguleerd proces in zowel normale als pathologische gebeurtenissen. Om de neovascularisatie beter te begrijpen, is het belangrijk om het proces in natuurlijke cellulaire micro-omgeving in vitro te reconstrueren. We hebben een microfluïdische chip en automatische besturing ontwikkeld.

Zeer efficiënte circulaties worden gedaan om perfusiemicrobuizen te vormen en te simuleren om het eiwit te gebruiken om het eerste geval van nieuwe vascularisatie samen te vatten. De microfluïdische kiemchip bestond uit drie kanalen. Een endotheelcelkweekkanaal en een vloeibaar kanaal werden gescheiden door een breed centraal hydrogelkanaal.

Het microfluïdische regelsysteem bestond uit een microsyringepomp en elektromagnetische knijpklep. Een bubble trap chip, een microfluïdische kiemchip, een micro-peristaltische pomp en een kweekmedium reservoir. Met een microfluïdisch systeem kunnen endotheelcellen worden gestimuleerd door hoge luminale schuifspanning, fysiologisch niveau van transendotheliale stroom en verschillende vasculaire endotheelgroeifactorverdelingen tegelijkertijd.

Pipet 20 microliter van 125 microgram per milliliter fibronectine in één media-injectiepoort van celkweekkanaal. Knip een pipetpunt om de poort van het celkweekkanaal met een schaar te passen. Steek de pipettip in de andere media-injectiepoort van het celkweekkanaal.

Pipetteer vervolgens lucht uit het celkweekkanaal om het te vullen met fibronectine. Incubeer de chips een uur lang op 37 graden Celsius. Pipetteer voor het zaaien van cellen 20 microliter endotheelcelmedium in elke media-injectiepoort en incubeer de chips gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius.

Pipetteer vervolgens alle media in alle media-injectiepoorten. Pipetteer vervolgens vijf microliter celsuspensie in één media-injectiepoort van het celkweekkanaal. Vervolgens verspreiden endotheelcellen zich snel over het hele kanaal onder differentiële hydrostatische druk.

Voeg ongeveer vier tot zes microliter ECM-media toe aan de andere poort om de hydrostatische druk aan te passen en het bewegen van de cel te stoppen. Afstandsbediening van de chips naar cel incubator. Draai vervolgens de chips elke 30 minuten om totdat endotheelcellen zich twee uur later om het interne oppervlak van het celkweekkanaal bedekken.

Gebruik pipettip om bevestigde cellen in de injectiepoorten zeer voorzichtig te verwijderen. Plaats vervolgens vier vrouwelijke Luer-adapters met weerhaken in de media-injectiepoorten en vul met ECM-media. Verwijder de chips naar cel incubator, verander ECM media en Luer adapters om de 12 uur.

Om het microfluïdische controlesysteem te monteren, bereidt u twee polytetrafluorethyleenbuizen, twee korte siliconenbuizen, drie lange siliconenbuizen, een vrouwelijke Luer-adapter met weerhaken, een Y-type connector en vervolgens drie L-type connectoren voor. Vul de spuit met 10 milliliter voorverwarmd ECM-medium. Sluit een polytetrafluorethyleenbuis aan op de spuit door een vrouwelijke Luer-adapter met weerhaken.

Sluit vervolgens het andere uiteinde van de polytetrafluorethyleenbuis aan op een connector van het type Y. Sluit vervolgens twee lange siliconenbuizen aan op de andere twee uiteinden van de Y-connector. We gebruiken de ene buis om verbinding te maken met het reservoir en de andere buis om verbinding te maken met de bubble trap chip.

Sluit nog een lange siliconenbuis aan op het reservoir. Gebruik vervolgens twee korte siliconenbuizen om alle inlaat- en uitlaatgaten op de bovenste laag van de bubble trap-chip aan te sluiten. Sluit een polytetrafluorethyleenbuis aan op de achterkant van de chip.

Bevestig vervolgens een spuit op de microsyringepomp. Klem twee lange siliconen buizen in de elektromagnetische knijpklep. Schakel vervolgens de elektromagnetische knijpklep om de pijpleiding tussen de spuit en het reservoir te openen.

Injecteer media in het reservoir met behulp van een microsyringepomp om lucht in de buis af te nemen. Schakel vervolgens de klep opnieuw om de pijpleiding tussen de spuit en de bubble trap-chip te openen. Injecteer media om de vloeistofkamer en backend tube van bubble trap chip te vullen.

Haal endotheelscheuten uit de celincubator en verwijder vervolgens Luer-adapters aan de celkweekzijde. Steek twee pijppluggen in de hydrogel injectiepoorten van microfluïdische kiemchip. Sluit de back-end buis van bubble trap chip aan op één poort van het celkweekkanaal.

Plaats een T-type connector op de andere poort en sluit deze aan op een lange siliconenbuis die is verbonden met het reservoir. Klem de lange siliconenbuis in de micro peristaltische pomp. Plaats vervolgens een luchtfilter in het reservoir.

Monteer vervolgens de microfluïdische kiemchip naar de podiumtop incubator. Sluit vervolgens de vacuümpomp aan op de gaten in de onderste laag van de bubble trap-chip door een TPU-buis. Stel het tegenovergestelde circulatievolume en een debiet in het aangepaste programma in dat tegelijkertijd de microsyringepomp en de elektromagnetische knijpklep regelt.

Stel vervolgens het debiet van de microperistaltische pomp in. Zet de microsyringepomp aan. Vervolgens wordt het circulatiecontrolesysteem ingesteld.

We testen de barrièrefunctie van sommige microvaten in ons model door de diffusiepermeabiliteitscoëfficiënt van 40 kDa F-I-T-C dextrine te meten. Zoals in de figuur wordt getoond, is de diffusiepermeabiliteitscoëfficiënt van statische cultuurchip met celvoering 0,1 plus of min 0,3 micrometer per seconde. En de diffusiepermeabiliteitscoëfficiënt van leeg kanaal zonder celvoering is 5,4 plus of min 0,7 micrometer per seconde.

Endotheliale kiemtest toonde aan dat endotheelcellen grotendeels na 24 uur statische cultivering in de centrale hydrogel ontkiemden, terwijl de mate van ontkiemen aanzienlijk afnam met de toename van luminale schuifspanning. Kwantitatief verminderde luminal shear stress het endotheel ontkiemen aanzienlijk in termen van kiemgebied, gemiddelde kiemlengte en de langste kiemlengte. Met ons systeem kan schuifspanning op endotheelcellen optioneel op elk moment tijdens het experiment worden gewijzigd, terwijl de transendotheliale stroom op fysiologisch niveau bleef.

Dit in vitro 3D biomimetische model kan direct worden toegepast op de studie van het neovasularisatiemechanisme en houdt de potentiële belofte als een goedkoop platform voor geneesmiddelenscreening en toxicologische toepassingen.