Isolatie en differentiatie van primaire witte en bruine preadipocyten van pasgeboren muizen

Dit protocol biedt een eenvoudige strategie voor het genereren van celculturele modellen van witte en bruine adipocyten die in vitro getrouw de fysiologie van het vetweefsel dat we in vivo hebben, samenvatten. Dit protocol maakt gelijktijdige isolatie van zowel witte als bruine preadipocyten van pasgeboren muizen mogelijk en de cellen die we met deze methode isoleren, beoordelen een hoge proliferatieve capaciteit en differentiatiepotentieel. Cellen die met deze aanpak worden geïsoleerd, weerspiegelen de complexiteit van vetweefsel beter dan andere kweekmodellen.

En het kan worden gebruikt om de adipocytfunctie bij obesitas en diabetes nauwkeuriger te bestuderen. We richten ons voornamelijk op het begrijpen van vetweefseldisfunctie bij obesitas. Cellen die met deze methode zijn voorbereid, kunnen echter ook worden gebruikt om basisvragen over cel in ontwikkelingsbiologie te bestuderen.

De sleutel tot een succesvol experiment is het bepalen hoe de witte vetdepots kunnen worden geïdentificeerd als deze depots, die klein zijn, maar zeer rijk en proliferatie preadipocyten kunnen moeilijk te onderscheiden zijn bij pups. Visuele demonstratie illustreert hoe eenvoudig dit protocol is en maakt het mogelijk om tips te geven voor het lokaliseren en ontleden van de witte en bruine vetdepots. Het zien van de isolatie van het depot is zeer nuttig.

Om onderhuids wit vetweefsel te verzamelen, snijdt u de huid rond de buik van een geëuthanaseerde pasgeboren pup en trekt u de huid voorzichtig onder de benen. Zonder huidweefsel te verzamelen, oogst u zorgvuldig het vetdepot, dat verschijnt als een helder of wit, dun langwerpig weefsel dat aan de binnenkant van de huid of bovenop de quadriceps is bevestigd. Spoel het geoogste depot af in PBS en plaats het vetweefsel in een buis van 1,5 milliliter met 250 microliter PBS en 200 microliter 2X isolatiebuffer op ijs.

Om interscapulair bruin vetweefsel te verzamelen, trekt u de huid van de schouderbladen over het hoofd en tilt u het diep roodbruine vetweefsel tussen de schouderbladen op. Maak voorzichtig incisies rondom het vet om het los te maken van het lichaam en controleer het weefsel op consistentie en kleur. Plaats het weefsel na het spoelen in een tweede buis van 1,5 milliliter met 250 microliter PBS en 200 microliter 2X isolatiebuffer op ijs.

Wanneer alle depots zijn verzameld, gebruikt u een schaar om elk depot vier tot zes keer voorzichtig rechtstreeks in de buizen te gehakt en voeg 50 microliters 10X collagenase in 2X isolatiebuffer toe aan elke buis. Draai vervolgens de buizen snel om om de weefsels te mengen en plaats ze gedurende 30 minuten in een temperatuurgecontroleerde mixer bij 37 graden Celsius en 1400 omwentelingen per minuut. Plaats aan het einde van de spijsvertering de buizen terug op ijs en filtreer de spijsverteringsweefsels door 100 micron celstampersen in nieuwe buizen van 50 milliliter.

Om de celopbrengst te maximaliseren, spoelt u elke buis af met één milliliter isolatiemedium en filtert u deze was door de zeef. Verdun de bruine en witte vetweefseloplossingen tot twee milliliter weefselsuspensie per put per depot in een vers isolatiemedium. Vervolgens plaat twee milliliter witte vetweefsel suspensie aan elk van vier tot zes putten en twee milliliter bruin vetweefsel suspensie aan elk van twee tot drie putten van een zes put plaat door een 100 micron filter per put.

Wanneer alle cellen zijn geplateerd, plaatst u de plaat gedurende 60 tot 90 minuten in de celkweek-incubator. Was aan het einde van de incubatie elke put met twee milliliter serumvrij medium en roer de plaat voorzichtig om eventuele bloedcellen van de bodem van de putten los te maken. Voeg na drie wasbeurten twee milliliter vers isolatiemedium toe aan de putten en breng de plaat terug naar de celkweek-incubator.

Wanneer de cellen 80 tot 90% samenvloeiing bereiken, bedek nieuwe bestemmingsplaten met steriele 0,1% gelatine gedurende 10 minuten in gedestilleerd water bij 37 graden Celsius. Terwijl de platen incuberen, wast u de cellen met PBS voordat u ze drie minuten met trypsine behandelt in de celkweek-incubator. Wanneer de cellen zijn losgeraakt, pipet de celsuspensie meerdere keren om het celherstel te maximaliseren en de cellen over te brengen naar een nieuwe buis.

Wanneer alle cellen zijn verzameld, wast u elke put met één milliliter isolatiemedium en trekt u de wasbeurten met de celsuspensie. Verzamel de cellen door centrifugeren en resuspend de pellet in drie tot vijf milliliter isolatiemedium voor het tellen. Verdun de cellen tot de juiste concentratie voor beplating in een vers isolatiemedium en was de met gelatine bedekte platen met PBS om overtollige gelatine te verwijderen.

Zaai vervolgens de cellen op de met gelatine bedekte platen en breng de cellen terug naar de celkweek-incubator. Wanneer de cellen samenvloeiing bereiken, vervangt u het isolatiemedium door het differentiatiemedium. Als u bruine vetweefselpreadipocyten differentieert, voeg dan ook een nanomolar triiodothyronine toe.

Ververs het medium na 48 uur met het juiste onderhoudsmedium per cultuur. Op dit moment moet de ophoping van kleine vloeibare druppeltjes in de cellen zichtbaar worden onder heldere veldmicroscopie. Zelfs na het filteren blijven sommige cellulaire brokstukken en bloedcellen in de celsuspensie.

Zachte wasbeurten een uur na het plateren zullen niet-relevante cellen verwijderen, omdat de preadipocyten zich snel aan de bodem van de put hechten. Hoewel zowel witte als bruine preadipocyten geïsoleerd van pasgeboren pups een hoge proliferatieve capaciteit hebben, is de opbrengst van witte preadipocyten over het algemeen twee keer zo hoog als die van bruine preadipocyten per depotbasis. Daarom, als gesynchroniseerde culturen gewenst zijn, moet deze startdichtheid van de witte preadipocyten dienovereenkomstig worden berekend.

Aan het einde van de differentiatie lijken de cellen geladen te zijn met lipidedruppels en zullen ze klassieke markers van respectievelijk witte en bruine adipocyten uitdrukken. In deze vergelijkende analyse van het zuurstofverbruik in een mitochondriale stresstest van primaire witte en bruine adipocyten onder basale omstandigheden, evenals als reactie op bekende stimulatoren van de mitochondriale functie, kunnen deze specifieke bio-energetische capaciteiten van elk celtype worden waargenomen. Vergeet niet dat we levende cellen isoleren en dat we ze enkele dagen willen cultuleren.

Zorg er dus voor dat u tijdens de isolatie steriele omstandigheden behoudt om besmetting te voorkomen, wat de daaropvolgende kweek in gevaar kan brengen. Deze methode genereert volgroeide adipocyten die kunnen worden gebruikt voor verschillende toepassingen, waaronder functionele assays, genetische of chemische schermen of omics-profilering om cel-autonome mechanismen te bestuderen die de adipocytfunctie beïnvloeden.