Gonadectomie en bloedafname procedures in het kleine formaat Teleost Model Japanse Medaka(Oryzias latipes)
11 december 2020
Het artikel beschrijft een snel protocol om bloed van de kleine teleostvis te gonadectomiseren en te bemonsteren, met behulp van Japanse medaka (Oryzias latipes) als model, om de rol van geslachtssteroïden in de dierfysiologie te onderzoeken.
Deze methode zal helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de fysiologische functie van geslachtsklieren, inclusief de rol van geslachtshormonen in neuro-endocriene systeemplasticiteit en -regulatie bij teleosten en in grotere mate bij gewervelde dieren. Dit protocol maakt het mogelijk om gonadectomie met een hoge succesratio uit te voeren bij kleine modelteleosten medeka, die veel wordt gebruikt in de onderzoeksgemeenschap. Om succesvol te zijn en een hoge overlevingskans te bereiken, vereist deze techniek een goede training, met name bij het beoordelen van de geslachtsklieren en het sutureren van de vissen.
Begin met het vissen uit de anesthesieoplossing te halen en het horizontaal op zijn zijde onder een dissectiemicroscoop te plaatsen. Om de ovariectomie bij vrouwtjes uit te voeren, schraap de schubben in het snedegebied. Maak voorzichtig een snede van twee tot 2,5 millimeter tussen de ribben en de bekken- en anaalvinnen met een scheermesje.
Prikt zachtjes in de buik van de vis terwijl de eierstokken worden verwijderd met een fijne pincet met een brede punt. Het is belangrijk om te voorkomen dat de ribben breken, wat de dood kan veroorzaken. Snijd het uiteinde van de eierstokken af met de fijne pincet en leg ze opzij.
Om de orchidectomie bij mannetjes uit te voeren, maak een snede tussen de ribben boven het anus en open de snede langzaam met fijne pincetten. Pak voorzichtig de teelballen met de pincetten en verwijder ze langzaam. Snijd vervolgens het uiteinde van de teelballen af om ze volledig te verwijderen.
Na het uitvoeren van de procedure, sutureer de snede op vergelijkbare wijze voor mannetjes en vrouwtjes. Plaats de nylondraad naast het snedegebied en prik de huid vanaf de rechterkant van de snede door de binnenste lichaamsholte, waarbij ultrafijne pincetten worden gebruikt om de draad naar binnen te brengen. Prik vervolgens de huid vanaf de linkerkant van de snede door de buitenste lichaamsholte om de draad naar buiten te brengen.
Sluit de snedeopening, maak twee knopen en snijd de overtollige draad af. Plaats de vis in het isotonische herstelvocht en laat ze daar minimaal 24 uur voordat ze naar het aquariumsysteem worden overgebracht. Monteer de bloedafname door een glazen naald aan het siliconen capillair te bevestigen.
Breek de punt van de naald met een pincet met een brede punt en bedek de binnenkant van de naald met anticoagulantieoplossing door zuigen en blazen. Richt de naald richting het pedunculaire gebied van de vis, gericht op de caudale pedunculaire ader, en trek het bloed af met de mond totdat minimaal 1/4 van het totale volume van de naald is gevuld. Laat de naald los en plaats een stukje plakband nabij de scherpe kant.
Plaats een deksel met een gat op een opvangbuis en plaats de naald in de buis door het gat met de naaldpunt aan de buitenkant. Plaats de vis in het herstelvocht en laat ze daar minimaal 24 uur voordat ze naar het aquariumsysteem worden overgebracht. Draai het bloed gedurende één tot twee seconden met 1.000 keer G om het bloed in de buis te verzamelen.
De overlevingskans na ovariectomie, of OVX, bij vrouwtjes was 100% en 94% bij mannetjes na orchidectomie. Alle vissen overleefden de bloedafnameprocedure. Sham-geopereerde vrouwtjes vertoonden OV-positie.
Alle eieren werden bevrucht en gingen door naar embryonale ontwikkeling. Wanneer de gonadectomieprocedure correct werd uitgevoerd, veranderde de lichaamsvorm van de vis lichtjes en er bleven geen stukken geslachtsklieren achter. De snede en het hechtmateriaal verdwenen volledig vier weken na gonadectomie.
Na vier maanden vertoonden alle vissen nog steeds een gezond fenotype en er werd geen gonadale weefsel aangetroffen. Bloedanalyse bij vrouwtjes toonde aan dat het E2-niveau bij OVX-vissen significant lager was dan bij sham-geopereerde vissen 24 uur na de operatie. Na vier maanden was het E2-niveau bij OVX-vissen nog steeds significant lager dan bij sham-geopereerde vissen.
Deels OVX-vissen, waarbij slechts 1/3 tot 1/2 van de geslachtsklier werd verwijderd, vertoonden significant lagere E2-niveaus dan sham-geopereerde vissen en significant hogere E2-niveaus dan volledig OVX-vissen. De 11-KT-concentratie bij orchidectomiseerde mannetjes was significant lager dan bij sham-geopereerde vissen 24 uur na de operatie. Na vier maanden was het 11-KT-niveau nog steeds lager dan bij sham-geopereerde vissen.
Deels orchidectomiseerde vissen vertoonden lagere 11-KT-niveaus dan sham-geopereerde vissen en hogere niveaus dan volledig orchidectomiseerde vissen. Om ervoor te zorgen dat de procedure succesvol is, is het essentieel om de geslachtsklier zo voorzichtig en volledig mogelijk te verwijderen, zonder andere organen in de vis te beschadigen. Aangezien bekend is dat geslachtshormonen een belangrijke rol spelen in hersen- en hypofysencellplasticiteit, biedt deze techniek een krachtig hulpmiddel om onderliggende mechanismen in kleine teleostmodellen te onderzoeken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Het artikel presenteert een snel protocol voor de gonadectomie van de Japanse medaka (Oryzias latipes) en het afnemen van bloed om de rol van geslachtshormonen in de dierfysiologie te onderzoeken. Deze methode stelt onderzoekers in staat om effectief de fysiologische functies van de gonaden te bestuderen en hoe deze gerelateerd zijn aan neuro-endocriene plasticiteit bij teleostei en vertebraten.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Gonadectomietechnieken bij teleosteï vissen
- Onderzoek naar de fysiologische rollen van geslachtshormonen
- Plasticiteit van het neuroendocriene systeem
Achtergrond
- De Japanse medaka is een veelgebruikt model in het onderzoek
- Het begrijpen van de functies van de gonaden is essentieel voor het bestuderen van de fysiologie van gewervelden
- Eerdere technieken vertoonden onvoldoende overlevingspercentages
Gebruikte methoden
- Protocollen voor ovariectomie en orchidectomie
- Japanse medaka (Oryzias latipes) als biologisch model
- Technieken voor bloedafname en hormoonanalyse
Belangrijkste resultaten
- 100% overlevingspercentage bij vrouwtjes en 94% bij mannetjes na de operatie
- Significant lagere oestrogeen- (E2) spiegels bij ovariectomiseerde vissen vergeleken met sham-geopereerde vissen
- Verlaagde 11-ketotestosteron- (11-KT) spiegels bij orchidectomiseerde mannetjes
Conclusies
- Deze studie demonstreert een effectieve methode voor gonadectomie met implicaties voor hormoononderzoek
- De bevindingen benadrukken de rol van geslachtshormonen in de fysiologie van kleine teleost-modellen
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Gonadectomie en bloedafname bij de Japanse medaka maken het mogelijk om mechanistisch risico's te beperken bij het bestuderen van geslachtshormoonpaden in neuroendocrinologisch onderzoek. Dit kleine teleost-model ondersteunt doelwitvalidatie door reproduceerbare hormoonklaring en fenotypische stabiliteit te bieden. De aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen in vroege ontdekkingsfasen door de verwijdering van de gonaden te koppelen aan meetbare endocriene resultaten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar hormoon-feedbackmechanismen afgeleid van gonaden in de neuroendocriene regulatie van gewervelden mogelijk.
- Operationele waarde: Behaalt hoge overlevingspercentages (100% vrouwtjes, 94% mannetjes) en volledige verwijdering van de gonaden zonder residu weefsel.
- Strategische waarde: Ondersteunt hypothesetesten over de rol van geslachtsteroiden in de plasticiteit van de hersenen en hypofyse voor risicoreductie van doelen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een gevalideerd biologisch systeem met kwantificeerbare steroïdeputatie (E2 en 11-KT) voor assay-kalibratie.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde bloedafname via de caudale pedunkelvene maakt consistente hormoonmetingen over cohorten heen mogelijk.
- Strategische waarde: Faciliteert schaalbare screening van verbindingen die gericht zijn op steroïdensynthese of signaleringspaden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Demonstreert ziekte-relevante modellering van endocriene disruptie met fenotypische stabiliteit op lange termijn (4 maanden na de chirurgische ingreep).
- Operationele waarde: Reproduceerbare chirurgische en bemonsteringsprocedures ondersteunen de standaardisatie tussen laboratoria in preklinische workflows.
- Strategische waarde: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang mogelijk door target engagement te bevestigen via verschuivingen in hormoonspiegels.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode wordt geïntegreerd in de ontdekkingsbiologie voor hypothese-gestuurde targetvalidatie, wat bijdraagt aan de ontwikkeling van assays voor het screenen van endocriene modulatoren.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt het mechanische risicobeheer van gonade-afhankelijke paden via kwantificeerbare hormoonablatie.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde bloedafname en hormoonkwantificatie (E2, 11-KT) na gonadectomie.
- Analytica: Genereert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (steroïdeconcentraties) om experimentele condities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door middel van aanhoudende hormoononderdrukking en fenotypische monitoring.
- Bedrijfbrede herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar chirurgisch en bemonsteringsplatform voor longitudinale neuroendocriene studies.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende zekerheid bij targetvalidatie via significante hormoonreductie (E2, 11-KT) na gonadectomie.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde protocollen voor gonadectomie en bloedafname waarborgen reproduceerbaarheid en overleving.
- Strategische waarde: Vermindert biologische onzekerheid bij de selectie van neuroendocriene targets door mechanische risicoreductie.
- Impact op portfolio: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door de modulatiecapaciteit van het target in een ziekterelevant systeem te bevestigen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in microschirurgie en gonadidentificatie onder een dissectiemicroscoop.
- Afhankelijk van fijne pincetten, scheermesjes, nylonhechtdraad en met antistollingsmiddel gecoate glazen naalden.
- Necessiteert standaardisatie tussen teams voor incisiegrootte, hechttechniek en het volume van de bloedafname.
- Aanpassing voor verschillende teleost-soorten vereist correctie voor de grootte en anatomische positie van de gonaden.
- Beperkt door de omvang van de vis; niet geschikt voor modellen waarbij grote bloedvolumes vereist zijn.
