Monstervoorbereiding voor metabole profilering met behulp van MALDI massaspectrometrie beeldvorming
December 22nd, 2020
Het doel van dit protocol is om gedetailleerde richtlijnen te geven over de monstervoorbereiding bij het plannen van experimenten met MALDI MSI om metabole en moleculaire detectie in biologische monsters te maximaliseren.
MALDI-beeldvorming massaspectrometrie is een unieke vooruitgang op het gebied van metabolomics die ons in staat stelt om relatieve metabolieten abundantie en distributie te meten en te visualiseren, die indicatief zijn voor organismen, fysiologische en pathologische omstandigheden. Het belangrijkste voordeel van MALDI-beeldvorming is de mogelijkheid om metabolieten in C2 te detecteren zonder dat er labeling nodig is. Bij het demonstreren van de procedure hebben we Sami Sauma, een afgestudeerde student uit het laboratorium van Dr. Patricia Casita.
Yuki Chen en Kelly Veerasammy, student-onderzoekers uit mijn laboratorium. Na het oogsten, plaatsten we het weefsel onmiddellijk in een bootje van aluminiumfolie in een vak met vloeibare stikstof, afgekoeld, en in een polystyreen doos. Sluit het deksel van de polystyreen doos om het weefsel 2 tot 10 minuten te bevriezen, afhankelijk van de grootte van het weefsel.
Wanneer het weefsel voldoende bevroren is, gebruiken we pincetten om het bootje te verwijderen en transporteren het weefsel, dat in het folie op droogg ijs is beveiligd, naar de cryostaat. Voordat u het weefsel snijdt, moet u ervoor zorgen dat u niet op de dia's ademt. Gebruik handschoenen en een voltmeter ingesteld op weerstand om de geleidbaarheid van het juiste aantal MALDI-compatibele met indium tin oxide beklede glazen dia's te testen voor de analyse.
Na het labelen, plaatst u de dia's op een schone papieren handdoek en een met 70% ethanol gereinigde cryostaat ingesteld op min 20 graden Celsius. Plaats het weefselmonster in de cryostaat en stel de temperatuur van de cryostaatkamer en het monsterstuk in, afhankelijk van het type weefsel. Nadat het weefsel 30 minuten is geëquilibreerd, gebruikt u cryo weefsel inbeddingsmiddel om het weefsel op de klemklem te monteren.
En plaats en vergrendel een schone mes in de trap, Pas de positie van de trap en de hoek van het monster aan om de gewenste snijwhoek te bereiken. En snijd het weefsel totdat het gebied van belang is onthuld. Wanneer het gewenste gebied is bereikt, verkrijgt u secties van 10 tot 12 micron dik, met behulp van een voorgekoelde borstel om elke sectie zorgvuldig maar snel op de gelabelde kant van elke dia te verzamelen zodra ze worden verkregen.
Plaats een vinger onder de dia's om de secties te verwarmen, om een veilige montage op de dia te garanderen. De secties worden binnen 5 tot 10 seconden transparant en worden na ongeveer 30 tot 60 seconden ondoorzichtig. Wanneer alle secties zijn verzameld, plaatst u de dia's in de diahouder en draagt u deze op droogg ijs naar een ontdozer.
Alternatief kunnen dia's in een vacuümdoos worden vervoerd. Plaats de dia's in een ontdozer met droogmiddel en droog de dia's 45 tot 60 minuten vacuüm. Na het drogen, als u deze niet onmiddellijk gebruikt, plaatst u de dia's in de diatransporteur en vult u de transporteur met stikstof.
Versluit de houder met parafilm en plaats de houder in een tweede gelabelde ritssluiting. Plaats vervolgens de eerste ritssluiting in een tweede gelabelde ritssluiting die droogmiddel bevat voor opslag bij min 80 graden Celsius voor maximaal zes maanden. Na dehydratatie, gebruikt u een dik punten zilveren marker om X-tekens op de lege ruimtes van de dia's buiten de weefselsecties te plaatsen en gebruikt u een zwarte fijne punt marker om een tweede zwarte X bovenop elke zilveren X te plaatsen. Laad een dia in het MALDI-schuifmetaaldoel en plaats een plastic deksel over de dia.
Schetst de locatie van het monster op het plastic deksel en plaats de dia en MALDI-doel op het oppervlak van een flatbed scanner. Bekijk vervolgens de dia en selecteer het gewenste gebied. Scan de dia in 16-bits grijstinten, in 2, 400 dots per inch en sla het beeld op voor later gebruik.
Om matrix op de dia's aan te brengen, zet u een automatische matrixspuiter in, zorg ervoor dat de klep op laad staat en start u de spuitersoftware. Controleer of de afzuigventilator goed werkt en bevestig onder het tab communicatie dat het systeem correct communiceert. Start de oplosmiddelpomp op 100 microliter per minuut met een tegendruk van ongeveer 500 pond per vierkante inch.
En stel de stikstoftank in op 30 pond per vierkante inch om de persluchtstroom naar de matrixspuiter te starten. Stel de drukregeling aan de voorkant van de spuiter in op 10 pond per vierkante inch en stel de temperatuur van de spuiterpijp op het gewenste niveau in. Met de klep en de laadpositie gebruikt u de spuit om de lus te spoelen met zeven milliliter 70% methanol voordat u de lus vult met zes milliliter matrix.
Plaats een lege glazen dia in de houder en de spuiter, plak beide uiteinden vast om beweging te voorkomen en controleer of de stroomsnelheid en temperatuur stabiel zijn. Druk op start om de mondstuktemperatuur in te stellen en om de pompstroomsnelheid aan te passen, om overeen te komen met de geselecteerde methode. Schakel de klep van laad naar spuit en klik op doorgaan.
Sta het systeem toe om de volledige cyclus te doorlopen. Wanneer de depositie is voltooid, schakel de klep van spuiten naar laden en klik op doorgaan. Bekijk het patroon van matrixcodering onder een microscoop.
Als een gelijkmatige laag fijne matrixkristal wordt waargenomen, deponeer dan de matrix op de geschikte steekproefdia's zoals net is aangetoond. Wanneer alle dia's zijn behandeld, reinigt u het systeem volgens de instructies van de fabrikant om verstopping van de spuiterpijp te voorkomen. Hier worden outputafbeeldingen weergegeven vanuit MALDI MS-beeldvormingsgegevensanalyse van massaontlaadspectra geselecteerd uit elk interval van 100 Dalton, waarbij duidelijk de nuttigheid voor de identificatie van spectra van kleine molecuulmetabolieten tot lipiden met een hoog molecuulgewicht wordt weergegeven.
Elke weg bevat respectievelijk ionenhittekaarten die zowel ruimtelijke als spectrale informatie bevatten van een specifieke metabolietensoort in drie weefsels verzameld op postnatale dagen 1, 21 en 60
Overzicht
Dit protocol biedt gedetailleerde begeleiding voor het voorbereiden van biologische monsters voor MALDI Imaging massaspectrometrie (MALDI MSI) om metabolische en moleculaire detectie te verbeteren. Door MALDI MSI te gebruiken, kunnen onderzoekers de abundantie en verdeling van metabolieten visualiseren, wat cruciaal is voor het begrijpen van fysiologische en pathologische toestanden in organismen.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Onderzoeksgebied
- Metabolomics
- Voorbereiding van biologische monsters
- Massaspectrometrietechnieken
Achtergrond
- MALDI MSI maakt de meting van metabolieten zonder labeling mogelijk
- Belangrijk voor het bestuderen van fysiologische en pathologische toestanden
- Maakt gebruik van specifieke methodologieën voor monstervoorbereiding en analyse
Gebruikte methoden
- Monster invriezen en in delen snijden met behulp van een cryostaat
- Gebruik van MALDI-compatibele glasplaten
- Matrixdeposities en beeldtechnieken
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van metabolietenverdelingen in verschillende weefseltypes
- Variaties in metabolietenabundantie op basis van ontwikkelingsstadia
- Inzichten in specifieke anatomische structuren gerelateerd aan de aanwezigheid van metabolieten
Conclusies
- Deze studie illustreert de effectiviteit van MALDI MSI in het onthullen van metabolische fenotypes
- Belicht potentiële toepassingen in de ontwikkelingsbiologie en pathologieonderzoek
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
MALDI MSI enables label-free spatial mapping of metabolites, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The technique provides quantitative, visualization-ready data that aids in hypothesis testing and portfolio triage for metabolic pathways. Proper sample preparation ensures reproducibility and predictive confidence in downstream applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through metabolite distribution mapping.
- Operational Value: Supports biological de-risking by visualizing metabolite enrichment in disease-relevant tissues.
- Predictive Value: Facilitates target confidence by linking metabolite signatures to developmental or pathological states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening with spatial metabolite resolution.
- Operational Value: Ensures assay standardization through reproducible cryosectioning and matrix deposition protocols.
- Scalability: Enables platform reuse across tissue types and developmental stages for consistent compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase metabolite profiling to preclinical validation via developmental stage comparisons.
- Biomarker Alignment: Supports identification of metabolites enriched in specific anatomical structures or disease conditions.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement choices by revealing spatially resolved metabolic phenotypes across models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification by providing spatially resolved metabolic data that informs target selection and validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking through metabolite ion heat maps across tissue compartments.
- Screening: Delivers assay readiness via standardized tissue sectioning and matrix application for reliable compound screening.
- Analytics: Generates quantitative mass discharge spectra at 100 Dalton intervals for comparative condition analysis.
- Translational Research: Enables continuity from neonatal to adult tissue metabolite profiling for developmental biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for metabolic profiling across disease models and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through label-free metabolite detection and spatial distribution analysis.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled cryostat sectioning and matrix deposition.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in metabolic pathway analysis.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via visualization of metabolite enrichment in disease-relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryostat operation, tissue handling, and MALDI-compatible slide preparation.
- Dependent on instrumentation including cryostat, matrix sprayer, and MALDI-MS imaging platform.
- Necessitates cross-team standardization for sample storage, sectioning thickness, and matrix application consistency.
- Involves adaptation considerations for varying tissue types and developmental stages in neuropathological models.
- Limited by sample degradation risks if dissection, storage, or sectioning protocols are not strictly followed.
