Monstervoorbereiding voor metabole profilering met behulp van MALDI massaspectrometrie beeldvorming

MALDI-beeldvorming massaspectrometrie is een unieke vooruitgang op het gebied van metabolomics die ons in staat stelt om relatieve metabolieten abundantie en distributie te meten en te visualiseren, die indicatief zijn voor organismen, fysiologische en pathologische omstandigheden. Het belangrijkste voordeel van MALDI-beeldvorming is de mogelijkheid om metabolieten in C2 te detecteren zonder dat er labeling nodig is. Bij het demonstreren van de procedure hebben we Sami Sauma, een afgestudeerde student uit het laboratorium van Dr. Patricia Casita.

Yuki Chen en Kelly Veerasammy, student-onderzoekers uit mijn laboratorium. Na het oogsten, plaatsten we het weefsel onmiddellijk in een bootje van aluminiumfolie in een vak met vloeibare stikstof, afgekoeld, en in een polystyreen doos. Sluit het deksel van de polystyreen doos om het weefsel 2 tot 10 minuten te bevriezen, afhankelijk van de grootte van het weefsel.

Wanneer het weefsel voldoende bevroren is, gebruiken we pincetten om het bootje te verwijderen en transporteren het weefsel, dat in het folie op droogg ijs is beveiligd, naar de cryostaat. Voordat u het weefsel snijdt, moet u ervoor zorgen dat u niet op de dia's ademt. Gebruik handschoenen en een voltmeter ingesteld op weerstand om de geleidbaarheid van het juiste aantal MALDI-compatibele met indium tin oxide beklede glazen dia's te testen voor de analyse.

Na het labelen, plaatst u de dia's op een schone papieren handdoek en een met 70% ethanol gereinigde cryostaat ingesteld op min 20 graden Celsius. Plaats het weefselmonster in de cryostaat en stel de temperatuur van de cryostaatkamer en het monsterstuk in, afhankelijk van het type weefsel. Nadat het weefsel 30 minuten is geëquilibreerd, gebruikt u cryo weefsel inbeddingsmiddel om het weefsel op de klemklem te monteren.

En plaats en vergrendel een schone mes in de trap, Pas de positie van de trap en de hoek van het monster aan om de gewenste snijwhoek te bereiken. En snijd het weefsel totdat het gebied van belang is onthuld. Wanneer het gewenste gebied is bereikt, verkrijgt u secties van 10 tot 12 micron dik, met behulp van een voorgekoelde borstel om elke sectie zorgvuldig maar snel op de gelabelde kant van elke dia te verzamelen zodra ze worden verkregen.

Plaats een vinger onder de dia's om de secties te verwarmen, om een veilige montage op de dia te garanderen. De secties worden binnen 5 tot 10 seconden transparant en worden na ongeveer 30 tot 60 seconden ondoorzichtig. Wanneer alle secties zijn verzameld, plaatst u de dia's in de diahouder en draagt u deze op droogg ijs naar een ontdozer.

Alternatief kunnen dia's in een vacuümdoos worden vervoerd. Plaats de dia's in een ontdozer met droogmiddel en droog de dia's 45 tot 60 minuten vacuüm. Na het drogen, als u deze niet onmiddellijk gebruikt, plaatst u de dia's in de diatransporteur en vult u de transporteur met stikstof.

Versluit de houder met parafilm en plaats de houder in een tweede gelabelde ritssluiting. Plaats vervolgens de eerste ritssluiting in een tweede gelabelde ritssluiting die droogmiddel bevat voor opslag bij min 80 graden Celsius voor maximaal zes maanden. Na dehydratatie, gebruikt u een dik punten zilveren marker om X-tekens op de lege ruimtes van de dia's buiten de weefselsecties te plaatsen en gebruikt u een zwarte fijne punt marker om een tweede zwarte X bovenop elke zilveren X te plaatsen. Laad een dia in het MALDI-schuifmetaaldoel en plaats een plastic deksel over de dia.

Schetst de locatie van het monster op het plastic deksel en plaats de dia en MALDI-doel op het oppervlak van een flatbed scanner. Bekijk vervolgens de dia en selecteer het gewenste gebied. Scan de dia in 16-bits grijstinten, in 2, 400 dots per inch en sla het beeld op voor later gebruik.

Om matrix op de dia's aan te brengen, zet u een automatische matrixspuiter in, zorg ervoor dat de klep op laad staat en start u de spuitersoftware. Controleer of de afzuigventilator goed werkt en bevestig onder het tab communicatie dat het systeem correct communiceert. Start de oplosmiddelpomp op 100 microliter per minuut met een tegendruk van ongeveer 500 pond per vierkante inch.

En stel de stikstoftank in op 30 pond per vierkante inch om de persluchtstroom naar de matrixspuiter te starten. Stel de drukregeling aan de voorkant van de spuiter in op 10 pond per vierkante inch en stel de temperatuur van de spuiterpijp op het gewenste niveau in. Met de klep en de laadpositie gebruikt u de spuit om de lus te spoelen met zeven milliliter 70% methanol voordat u de lus vult met zes milliliter matrix.

Plaats een lege glazen dia in de houder en de spuiter, plak beide uiteinden vast om beweging te voorkomen en controleer of de stroomsnelheid en temperatuur stabiel zijn. Druk op start om de mondstuktemperatuur in te stellen en om de pompstroomsnelheid aan te passen, om overeen te komen met de geselecteerde methode. Schakel de klep van laad naar spuit en klik op doorgaan.

Sta het systeem toe om de volledige cyclus te doorlopen. Wanneer de depositie is voltooid, schakel de klep van spuiten naar laden en klik op doorgaan. Bekijk het patroon van matrixcodering onder een microscoop.

Als een gelijkmatige laag fijne matrixkristal wordt waargenomen, deponeer dan de matrix op de geschikte steekproefdia's zoals net is aangetoond. Wanneer alle dia's zijn behandeld, reinigt u het systeem volgens de instructies van de fabrikant om verstopping van de spuiterpijp te voorkomen. Hier worden outputafbeeldingen weergegeven vanuit MALDI MS-beeldvormingsgegevensanalyse van massaontlaadspectra geselecteerd uit elk interval van 100 Dalton, waarbij duidelijk de nuttigheid voor de identificatie van spectra van kleine molecuulmetabolieten tot lipiden met een hoog molecuulgewicht wordt weergegeven.

Elke weg bevat respectievelijk ionenhittekaarten die zowel ruimtelijke als spectrale informatie bevatten van een specifieke metabolietensoort in drie weefsels verzameld op postnatale dagen 1, 21 en 60