Laser Doppler Perfusion Imaging in de hindlimb van de muis

Huidzweren met onvoldoende wondgenezing is een belangrijke oorzaak van amputatie bij menselijke patiënten. Adequate wondgenezing vereist hogere niveaus van arteriële overvloed die nodig zijn om een intacte huid te behouden, wat wordt aangetast bij patiënten met perifere arteriële aandoeningen. Verschillende andere rheumatologische aandoeningen en diabetes kunnen ook leiden tot verstoorde en ontoereikende huidmicrocirculatie om wonden te genezen.

Veel diabetespatiënten hebben gelijktijdige perifere arteriële aandoeningen, waardoor ze een bijzonder hoog risico lopen op amputatie. Laser Doppler perfusie beeldvorming of LDPI wordt gebruikt in klinische situaties om de microcirculatie van de huid te evalueren, evenals in onderzoekssituaties om de bloedstroom en het herstel van de bloedstroom te evalueren na experimentele hindlimb ischemie, ischemie reperfusie en microchirurgische flaps. Het LDPI-systeem projecteert een low-power laserstraal die wordt afgebogen door een scanspiegel om zich over een interessant gebied te bewegen.

Dit verschilt van laser Doppler flowmetrie, die een perfusiemeting biedt voor het kleine weefselgebied dat in direct contact staat met de flowmetriesonde. Wanneer de laserstraal interageert met bewegend bloed in de microvasculatuur ondergaat het een Doppler-frequentieverschuiving die door de scanner wordt gedetecteerd en omgezet in willekeurige perfusie-eenheden. Omdat LDPI een op licht gebaseerde techniek is, is deze beperkt in termen van penetratiediepte tot 0,3 tot 1 millimeter, wat betekent dat voor het grootste deel dermale perfusie wordt beoordeeld.

De huidstroom kan worden gewijzigd door de huidtemperatuur en het sympathische zenuwstelsel, dat kan worden beïnvloed door verschillende verdovende middelen. Metingen van de optische laser worden ook beïnvloed door omgevingslichtomstandigheden, huidpigmentatie en kunnen worden geblokkeerd door een te hoge vacht of haar. LDPI is de meest gebruikte onderzoekstechniek om het herstel van overvloed na ischemie te monitoren, omdat het niet-invasief is, geen contrasttoediening vereist en snelle scantijden heeft waarmee gegevens over meerdere dieren kunnen wordenverzameling.

Dit maakt het ideaal om te helpen bepalen of behandelingen gericht op therapeutische arteriogenese of angiogenese effectief zijn in modellen voor kleine dieren. Bloedstroomherstel na hindlimb ischemie zoals gemeten door LDPI correleert goed met de ontwikkeling van de collaterale slagader wanneer beoordeeld met andere middelen zoals microfill casting of micro CT. Het doel van dit protocol is om de beoordeling van hindlimbperfusie met behulp van LDPI aan te tonen. Stel de scannerhoogte zo in dat de afstand tot het scanonderwerp ongeveer 30 centimeter is.

Schakel de imager in en start de bijbehorende software. Open het meetprogramma. Als de software correct communiceert met de scanner, verschijnt de infraroodlaserwaarschuwing.

Pas de scannerinstellingen aan op de achtergrondmateriaal- en verlichtingsinstellingen in de ruimte. Stel de achtergronddrempel in door de laserstraal op het zwarte achtergrondmateriaal te richten en druk op Auto BK Set. Stel de isofluraaninductiekamer in met de juiste afvoer van afvalgas.

Door de inductiekamer op een warmhoudkussen te plaatsen, voorkomt u temperatuurverlies van de muis tijdens anesthesie-inductie. Zet de homeothermische deken aan, die in het scangebied onder een niet-reflecterend oppervlak wordt geplaatst. In dit geval een zwarte neopreen stof.

De homeothermische deken is ingesteld om een lichaamstemperatuur van 37 graden Celsius te handhaven. Plaats de temperatuursonde en smeermiddelen zo dat ze klaar zijn voor plaatsing. Plaats ook het anesthesiemasker en het opruimsysteem in het scangebied.

Verdoof de muis met een isofluraan vaporizer. De zuurstofsnelheid is ingesteld op één liter per minuut stroom. En de isofluraan is aangepast naar 4% voor anesthesie inductie.

De stroom wordt ingeschakeld op de anesthesie-inductiekamer en de ademhalingssnelheid van de muis zal vertragen. Adequate anesthesie wordt bereikt wanneer de muis zijn juiste reflex verliest. Breng de muis over naar een verdovingsmasker neuskegel met bijgevoegde afvalgasafruimer en pas de isofluraan aan op 1,5%Dit anesthesieniveau is over het algemeen voldoende om de muis relatief stil te houden tijdens het scannen, maar is niet bedoeld om chirurgische anesthesieniveaus te bieden.

Dus de diepte van de anesthesie wordt niet gecontroleerd. Het veranderen van het isofluraanniveau veroorzaakt veranderingen in hartslag, ademhaling en huidprofusie. Er moet dus een consistent percentage worden gebruikt gedurende elk tijdscursusexperiment en voor alle experimentele proefpersonen.

Alternatieve verdovingstechnieken, zoals IP-injectie van ketamine xylazine, kunnen ook worden gebruikt, maar dezelfde verdovingstechniek moet tijdens elke cursusstudie worden gebruikt, omdat verschillende anesthetica de huidprofusie anders beïnvloeden. Als het te scannen plangebied bedekt is met bont, gebruik dan een kleine elektrische trimmer en/of ontharingscrème om het haar uit de interesseregio te verwijderen. De ontharingscrèmes moeten volledig worden verwijderd en de muishuid moet vóór het scannen worden gedroogd, omdat een natte huid reflecties van de laser kan veroorzaken Plaats de gesmeerde rectale temperatuursonde die is gekoppeld aan de homeothermische deken in het rectum van de muis.

Equilibreer de muistemperatuur naar wensscantemperatuur, 37 graden Celsius. Dit kan tot vijf tot 10 minuten duren. Selecteer Scanner setup die toegankelijk is via het bovenste menu of via het pictogram Scanner setup.

Het scangebied moet worden aangepast door de coördinaten X, Y te wijzigen om rekening te houden met het interessegebied. De scansnelheid is afhankelijk van de scanresolutie. Een hogere resolutie resulteert in langere scantijden.

Voor herhaalde scanning, gericht op wereldwijde overvloed, in tegenstelling tot een hogere resolutie gericht op anatomische perfusie, is de hoogste scansnelheid van vier milliseconden per pixel voldoende. Als u herhalingsscans uitvoert, selecteert u het tabblad Herhalen en Lijnscan. Het aantal scans kan worden gewijzigd.

In dit geval drie scans, evenals het herhalingsinterval. De minimale tijd voor het herhalingsinterval zijn de geschatte scantijden die worden weergegeven in het grijs weergegeven gebied aan de rechterkant van het vak, bepaald door het scangebied en de scanresolutie. Door een paar seconden toe te voegen, kan de gebruiker de muis pauzeren en indien nodig verplaatsen tussen scans.

De totale scantijd is in dit geval drie minuten en 21 seconden. Selecteer het tabblad Afbeeldingsscan en selecteer de knop Markeren. Dit zorgt ervoor dat de laser het scangebied omlijnt.

Pas de muispositie aan zodat het te scannen doel zich binnen het gemarkeerde gebied bevindt. Begin met herhaalde metingen door het pictogram Herhalen scannen te selecteren en op de afspeelknop te drukken om de scan te starten. Er verschijnt een pop-upvenster dat de scanafstand bevestigt.

Klik op OK om te beginnen met scannen. De eerste scan van een muis voorafgaand aan inductie van hindlimb ischemie wordt in realtime getoond. De tweede en derde herhalingsscans worden versneld tot 16x snelheid.

Het hoofdvenster toont de resultaten van de scan zoals deze door de software wordt gegenereerd. De inzet rechtsonder toont de laser die de muisvoetpads scant. Voor voetpad of voetpad en dorsale kuitscanning biedt een gevoelige positionering met de achterpoten naar de staart gericht een consistenter gebied van belang bij de positionering van de rug.

De femurslagader, sapheneuze slagader en collateralen bevinden zich zeer dicht bij het ventrale oppervlak van de dij en het kalf. Dus supine positionering heeft de voorkeur als het gebruik van deze regio's van belang. Bewaak de muis tijdens het scannen op muisbeweging.

Als de muis voldoende beweegt zodat de voetpads zich niet meer in het scangebied in het midden van een scan bevinden, start u de scan opnieuw. Kleine variaties in de positie van het muisvoetpad kunnen worden ondergebracht in analysesoftware. Controleer ook de muistemperatuur tijdens het scanproces, omdat deze zelfs met het gebruik van de homeothermische deken kan fluctueren.

Als er te veel variatie is in de muistemperatuur, kan dit leiden tot aanzienlijke variatie tussen scans. Over het algemeen zal een temperatuurbereik van 36,8 tot 37,2 resulteren in acceptabele gegevens. Sla de vastgelegde scan op onder het venster Opslaan als met een bestandsnaam met muisidentificatie en tijdspunt voor eenvoudigere gegevensanalyse.

Voer indien gewenst muis- en tijdpuntgegevens in het venster Onderwerpdetails in. Ventrale hindlimb scanning met de muis in de supine positie wordt hier getoond na het aanpassen van het scangebied. Merk op dat de propositie met de muisondersteuner resulteert in een variabel deel van de zijkant van de voet dat wordt gescand.

Verwijder de rectale temperatuursonde en desinfecteer deze met 70% ethanol zodat deze klaar is voor de volgende muis. Verminder isofluraan tot 0%De muis zal sneller herstellen als hij zuurstof blijft ontvangen, maar het kan ook worden teruggewonnen zonder extra zuurstof. Laat de muis herstellen van anesthesie tot het punt waar hij een rechtse reflex weergeeft door van de rugpositie naar de gevoelige positie te draaien voordat hij deze teruggeeft aan de kooi.

Herstel kan worden uitgevoerd op een verwarmende deken voor isofluraan, omdat het herstel zeer snel is of in een warme herstelkooi voor ketamine xylazine. Open het imaging review softwareprogramma. Er wordt een nieuw venster geopend om scans te bekijken.

Ga naar het menu Bestand, Open en zoek het opgeslagen bestand. Selecteer het ROI-pictogram op de werkbalk. Selecteer het pictogram Polygoon toevoegen.

Traceer een gebied rond de regio van belang met behulp van de muis. Wanneer u klaar bent, gaat u terug naar de werkbalk en selecteert u het pictogram Statistieken. Dit zal een venster openen met statistieken uit de regio van belang.

Bij gegevenscontrole variëren de gemiddelde profusie-eenheid of PU-waarden niet meer dan 100 tot 150 PUs over de herhaalde scans voor elk voetpad. Dit is een acceptabele scan en geeft aan dat de muis goed is geëquilibreerd tijdens de scan. Gemiddelde PU-waarden met variatie groter dan 100 tot 150 PUs, wat overeenkomt met meer dan 10% van de gemiddelde perfusie voor een niet-bediend muisvoetpad over de herhaalde scans, zou erop wijzen dat de muis niet goed is geëquilibreerd en een herhaalde scan wordt sterk gesuggereerd.

Het uitvoeren van een snelle analyse onmiddellijk nadat de scan is voltooid, maakt het mogelijk om een herhaalde scan uit te voeren terwijl de muis nog steeds verdoofd is en te voorkomen dat een gegevenspunt verloren gaat dat kan optreden als de scans op een later tijdstip worden geanalyseerd en een scan onaanvaardbaar wordt geacht vanwege aanzienlijke variatie tussen de herhaalde scans. Resultaten worden uitgedrukt als een verhouding van chirurgische hindlimb profusie over controle hindlimb perfusie als muizen aanvankelijk vasodilaat en vervolgens ontwikkelen hun intrinsieke zekerheden, bloedstroom herstel door LDPI moet worden gezien over een postoperatieve tijd cursus. De mate van herstel is afhankelijk van de muisbelasting en de ernst van het hindlimb ischemiemodel.

Deze figuur toont een voltooid tijdsverloopexperiment gedurende 28 dagen waarbij LDPI werd gebruikt om het herstel van de bloedstroom van het voetpad in de loop van de tijd te meten na femurslagaderlig ligatie en P27 knock-out en wilde type C57Bl/6 muizen. Beide P27 knock-out bij wilde type muizen had een verminderde bloedstroom herstel wanneer behandeld met orale doxycycline, een gegeneraliseerde matrix metalloproteinases remmer, wat suggereert dat MMP activiteit vergemakkelijkt arteriogenese. De versterkingsinstelling en achtergronddrempel moeten gedurende het hele tijdscursusexperiment constant worden gehouden.

Als de achtergronddrempel te laag is ingesteld, resulteert het scannen van het achtergrondmateriaal in lage overvloedswaarden. Dit zal ertoe leiden dat de achtergrondprofusiewaarden worden gemiddeld in het interessegebied tijdens de polygoonselectie. Om dit probleem op te lossen, kan de achtergronddrempel worden aangepast in het venster Scannerinstellingen onder het tabblad Algemeen.

In dit geval resulteert het verhogen van de achtergronddrempel naar 118 overvloedseenheden in de grijze achtergrond die niet in een analyse zal worden opgenomen. Het palet of de kleurschaal voor de fluxafbeelding kan zowel in de meetsoftware als in de beeldbeoordelingssoftware worden aangepast. Alle overvloedswaarden die groter zijn dan de maximale waarde op de schaal, worden weergegeven als de hoogste overvloedskleur.

In dit geval, rood. Door het dynamische bereik te vergroten, bijvoorbeeld door de schaal te wijzigen van nul naar 1500, wordt herhaalde scanvariatie duidelijker voor het oog, omdat gebieden met een lengte tussen 1000 en 1500 overvloedseenheden nu worden weergegeven met behulp van het kleurverloop in plaats van dat ze allemaal als rood worden weergegeven. De hier getoonde scan werd verkregen bij een muis waarvan de kernlichaamstemperatuur aanvankelijk lager was dan 36,8 aan het begin van de herhaalde scan en vervolgens steeg ten opzichte van de herhaalde scans.

Merk op dat de gemiddelde overvloed van het controlevoetkussen meer werd uitgevoerd door de koudere kernlichaamstemperatuur dan het ischemische voetpad. Een enkele scan van de koelere lichaamstemperatuur zou hebben geresulteerd in een hogere overvloedsverhouding voor dit gegevenspunt. Variatie in pigmentatie van de muishuid, zoals kan worden gezien bij C57Bl/6-muizen, kan ertoe leiden dat het scangebied onder de achtergronddrempelwaarde ligt, wat de analyse van interessegebieden met gepigmenteerde gebieden moeilijk zal maken.

De muisvoetpads hebben over het algemeen geen hyperpigmentatie, waardoor dit het handigste gebied is om te scannen op deze muisstam. Als de onderzoeker de ventrale hindlimb wil bestuderen, moet een witte muisstam worden geselecteerd. LDPI is een effectieve, gemakkelijk uit te voeren en herhaalbare methode voor het meten van hindlimb dermale profusie als een weerspiegeling van de algehele arteriële perfusie.

Consistente techniek is vereist bij het gebruik van LDPI om betrouwbare gegevens te verkrijgen.