Fabricage van magnetische platforms voor micronschaalorganisatie van onderling verbonden neuronen

Onze aanpak maakt het mogelijk om neurale netwerkvorming te beheersen met behulp van magnetische manipulaties. Dit is een effectief instrument voor in vitro studies van netwerken en biedt nieuwe therapeutische richting voor biointerfacing-apparaten. Met deze techniek kunnen we zowel de locatie van de cel als de groei op micronschaal regelen, waardoor flexibel ontwerp van het magnetische patroon en dus de netwerkorganisatie mogelijk is.

Een efficiënte en niet-toxische magnetische nanodeeltjes sterilopticum is cruciaal. Om te slagen zijn geschikte magnetische nanodeeltjes nodig. De belangrijke kenmerken zijn de grootte, coating en situatiemagnetisatiewaarde.

Reut Plen en Dafna Levenberg, masterstudenten voor mijn lab, demonstreren de procedures. Om te beginnen schuift het glas in stukken van twee bij twee centimeter met behulp van een schrijfpen. Reinig de glazen dia's in aceton en vervolgens isopropanol gedurende elk vijf minuten in een ultrasoonbad.

Droog ze vervolgens met ultra hoge zuiverheidsstikstof. Bedek het glas met fotoresist met behulp van spincoating bij 6.000 rpm gedurende 60 seconden om een dikte van 1,5 micrometer te bereiken en bak 60 seconden 100 graden Celsius. Stel het monster bloot aan een lichtbron met behulp van een fotomasker of maskerloze lithografie om het gewenste patroon te bereiken.

Ontwikkel het monster gedurende 40 seconden in een ontwikkelaar verdund in gedestilleerd water volgens de instructies van de fabrikant. Was het vervolgens 45 seconden in water en droog het af met UHP-stikstofgas. Inspecteer het patroon onder een optische microscoop.

Plaats het monster in de belastingsvergrendelingskamer van het depositiesysteem en wacht op de basisdruk. Breng het monster over in de hoofdkamer en stel het monster in op de juiste hoogte voor depositie. Verhoog het vermogen op elk doel totdat de gewenste snelheid is bereikt.

Schakel rotatie in en deponeer vervolgens de ferromagnetische meerlaag, afwisselend tussen de kobalt-, ijzer- en palladiumdoelen door respectievelijk de doelluiken te openen en te sluiten. Deponeer 14 tweelagen kobaltijzer palladium en werk af met een extra palladium afdeklaag. Nadat de depositie is voltooid, lost u het monster uit het depositiesysteem.

Week het monster 30 minuten in aceton en spoel het af met isopropanol. Droog het vervolgens met UHP-stikstof en onderzoek het onder de microscoop. Bewaar het in een schone en droge omgeving tot gebruik.

Gebruik een glazen glijbaan met een kruisvormige magneetbalk van 100 micrometer breed afgezet met ferromagnetische meerlagen. Bevestig het monster aan de houder met dubbelzijdige tape. Gebruik een draadverlijmer om vier draden aan het monster te binden, één op elk been van de kruiselektrode.

Stel de monsterhouder en het monster in het transportmeetsysteem in met een magnetisch veld, zodat het magnetische veld loodrecht op het monster staat. Voer transversale spanningsmetingen uit zoals beschreven in het teksthandschrift. Veeg het magnetisch veld en meet de transversale spanning als functie van het veld.

Plot de dwarsweerstand als functie van het magnetisch veld om het afwijkende Hall-signaal te bepalen, dat evenredig is met de loodrechte magnetisatie in de film. Bereid basisgroeimedium en differentiatiemedium voor pc12-celcultuur voor zoals beschreven in het teksthandschrift. Kweek cellen in een niet-behandelde kweekkolf met 10 milliliter basisgroeimedium en voeg elke twee tot drie dagen 10 milliliter medium toe aan de kolf.

Subcultuur de cellen na acht dagen. Voor cellulaire opname centrifugeert u de celsuspensie gedurende acht minuten bij 200 G en kamertemperatuur en gooit u het supernatant weg. Resuspend de cellen in drie milliliter verse basisgroeimedium.

Centrifugeer de cellen opnieuw gedurende vijf minuten, gooi vervolgens het supernatant weg en resuspend de cellen in drie milliliter vers differentiatiemedium. Aspireer de cellen 10 keer met behulp van een spuit en naald om de celclusters op te breken, tel vervolgens de cellen met behulp van een hemocytometer en zaai een miljoen cellen in een gewone, ongecoate schaal van 35 millimeter. Voeg het berekende volume MNP-suspensie en differentiatiemedium toe aan de schaal om de gewenste MNP-concentratie te bereiken.

Meng de cellen, MNPs en differentiatiemedium en incubeer het gerecht vervolgens gedurende 24 uur in een 5% koolstofdioxide bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius. Reinig het substraat met patroon met 70% ethanol en plaats het in een 35 millimeter kweekschaal in de kap. Plaats een grote magneet gedurende één minuut onder het substraat met patroon, verwijder deze vervolgens door de schaal op en af te bewegen en de magneet uit de kap te halen.

Schakel het ultraviolette licht gedurende 15 minuten in. Om een met collageen bedekt glassubstraat te bereiden, verdun collageen type één in een verhouding van één tot 50 in 30% ethanol. Bedek het glas met de oplossing.

Laat de schaal vier uur onbedekt in de kap totdat alle oplossing verdampt en was het vervolgens drie keer in steriel PBS. Verwijder de cellen uit de incubator, centrifugeer de celsuspensie gedurende vijf minuten op 200 G en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de cellen in één milliliter vers differentiatiemedium en tel de cellen met behulp van een hemocytometer.

Zaai 10 aan de vijf cellen bovenop het substraat in een kweekschaal van 35 millimeter en voeg twee milliliter differentiatiemedium toe. Incubeer de cultuur in een 5% kooldioxide bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius. Voeg na 24 uur een tot 100 verse muriene bèta-NGF toe aan de cellen.

Vernieuw het differentiatiemedium en voeg elke twee dagen verse bèta-NGF toe. Beeld de cellen om de twee dagen met behulp van lichte microscopie en voer immunostaining uit op de cellen na netwerkvorming. Magnetische platforms met verschillende geometrische vormen werden gefabriceerd en fluorescerende ijzeroxide MNPs werden gesynthetiseerd door nucleatie.

Magnetometrische metingen van de MNP's tonen aan dat de magnetisatiecurve geen hysterese, een laag verzadigingsveld en een relatief hoge magnetisatieverzadiging had. PC12-cellen werden geïncubeerd in medium gemengd met de ijzeroxide fluorescerende MNPs, waardoor ze werden omgezet in magnetische eenheden. De parlementsleden werden geïnternaliseerd in de cellen,.maar niet in de kernen.

De ijzerconcentratie in de cellen nam toe met de toename van de MNP-concentratie in het medium. De levensvatbaarheid van MNP-geladen PC12-cellen voor verschillende concentraties MNP's werd geëvalueerd door morfologische parameters van MNP-geladen cellen te vergelijken met behulp van Shoal-analyse, waaruit geen verschil met controlecellen bleek. XTT- en Resazurin-gebaseerde assays bevestigden dat de geëvalueerde concentraties van MNP's geen significante cytotoxiciteit ten opzichte van de cellen vertoonden.

PC12-cellen met en zonder MNP-behandeling werden gekweekt en gedifferentieerd op een magnetisch substraat. De gemagnetiseerde cellen bleken zich aan de magnetische patronen te hechten en vertakkingen te laten groeien volgens de patronen, terwijl cellen zonder MNP-behandeling groeiden zonder affiniteit met de magnetische apparaten. De positionering van cellen op een substraat met zeshoekige geometrie wordt hier weergegeven.

75% van de MNP geladen cellichamen waren in contact met de magnetische strepen, terwijl slechts 35% van de niet-gemagnetiseerde cellen zich op de strepen bevonden. Naast het celpositioneringseffect bleken deze magnetische platforms de directionaliteit van de groeiende neurieten te controleren. Om het magnetische effect op de neuronale groeirichting te evalueren, werd de hoek tussen de neurieten en de magnetische strepen gemeten, wat een significante correlatie met de oriëntatie van de magnetische strepen aantoont.

Deze procedure is gemakkelijk aangepast voor het richten van actieve verbindingen, zoals geneesmiddelen, na het vervoegen ervan tot magnetische nanodeeltjes. De kan worden vertaald naar high throughput drug screening assays of lokale behandeling binnen weefsels. Deze nieuwe aanpak opent nieuwe mogelijkheden voor het functionaliseren van andere substraten of apparaten door het toevoegen van magnetische aantrekkelijke structuren.

Momenteel ontwikkelen we verbeterde biocompatibele neuron chip interfaces.