In vitro modellering voor neurologische ziekten met behulp van directe conversie van fibroblasten naar neuronale voorlopercellen en differentiatie in astrocyten

We gebruiken dit protocol om neurale voorlopercellen te maken van huidfibroblasten van patiënten en neurologische en neurodegeneratieve ziekten te bestuderen. We hebben het gevoel dat dit protocol veel voordelen heeft ten opzichte van klassieke IPS-technologie, waaronder de snelheid, maar in bepaalde gevallen ook een ernstiger ziektefenotype krijgt. We bestuderen neurologische en neurodegeneratieve ziekten en met behulp van huidmonsters kunnen we ook de diversiteit van de patiënten echt evalueren.

Mijn lab is vooral geïnteresseerd in de rol van astrocyten bij ziekten en we gebruiken de astrocyten die we maken van de NPC's om medicijnen te testen en ook om ziektemechanismen te bestuderen, maar ook in co-culturen met menselijke en muisneuronen. We hopen dat dit protocol informatief zal zijn en neem contact op als u vragen heeft. Bedankt.

Gebruik primaire menselijke huidfibroblasten die kunnen worden verkregen uit celbanken of huidbiopten. Kweekcellen bij 37 graden Celsius in een co2-weefselkweek-incubator van 5%. Passagecellen voor ten minste één tot twee passages na ontdooiing voorafgaand aan gebruik in het experiment.

Zodra de cellen klaar zijn, bekleedt u een put van een zes-put plaat met menselijke fibronectine in een concentratie van 1:200 verdund in PBS bij kamertemperatuur gedurende 15 tot 20 minuten. Bereid fibroblastmedia voor zoals weergegeven in tabel één. Wanneer de cellen klaar zijn om te worden geplateerd, verwijdert u de fibronectine uit de schaal en voegt u onmiddellijk celoplossing of twee mils fibroblastmedia toe.

Laat de schaal niet uitdrogen voordat u media toevoegt. Afhankelijk van hoe snel de cellen groeien, plaat 150, 000 tot 200, 000 fibroblasten in twee putten van een menselijke fibronectine-gecoate zes-put plaat. Kweekcellen bij 37 graden Celsius in een co2-weefselkweek-incubator van 5%.

Controleer de dag na het zaaien de fibroblasten onder de microscoop en controleer of de celdichtheid tussen 70 en 85% ligt Transduceer één put met alle vier retrovirale vectoren: Oct3/4, Klf4, Sox2 en c-Myc. Gebruik een veelvoud aan infecties van 10 voor snelgroeiende of 15 voor langzaam groeiende fibroblasten. De transductie-efficiëntie moet meer dan 70% of meer positieve cellen voor elke vector bedragen.

Voeg regelmatig fibroblastmedium toe aan virale mix voor een totaal volume van één mil per put. Laat de tweede goed onbehandeld en breng cellen terug naar de weefselkweek-incubator om 's nachts te incuberen. De dag na transductie, was cellen een keer met PBS en voeg een mil verse fibroblast media.

Kweekcellen bij 37 graden Celsius in een co2-weefselkweek-incubator van 5%. Bereid de volgende dag conversiemedia voor zoals weergegeven in tabel één en was cellen één keer met PBS om de resterende fibroblastmedia te verwijderen en voeg vervolgens een mil conversiemedium toe. Verander de media van de onbehandelde put ook in conversiemedia.

Observeer cellen onder de microscoop en let op veranderingen in de morfologie. Celmedia moeten dagelijks tijdens het conversieproces worden vervangen door één tot twee miljoen conversiemedia en voor de daaropvolgende iNPC-cultuur. Verander media door voorzichtig 70% media uit de put te verwijderen en ervoor te zorgen dat de cellen bedekt blijven met de resterende 30% van de media.

Blijf de cellen observeren en verander dagelijks van medium met één tot twee miljoen conversiemedia. Na ongeveer vijf tot zes dagen in conversiemedia of wanneer cellen erg dicht worden, breng je ze één tot twee of maximaal één tot drie door. Warm Accutase op en bedek een geschikt aantal putten in een plaat met zes putten met één mil totaal fibronectine verdund 1:200 in PBS gedurende 15 tot 20 minuten bij kamertemperatuur.

Was cellen zorgvuldig met PBS zonder cellen los te maken. Gebruik de wand van de put om PBS voorzichtig op de cellen aan te brengen. Verwijder PBS voorzichtig met pipetten of door te aspireren.

Voeg 500 microliters Accutase toe en incubeer twee tot drie minuten bij 37 graden Celsius in een weefselkweek-incubator. Controleer onder de microscoop of de meeste cellen zijn losgeraakt. Als cellen zijn losgekomen, voeg dan twee mils verse conversiemedia toe en pipetteer voorzichtig twee tot drie keer op en neer om klonten te dissocieren.

Verzamel de cellen in een buis van 15 mil en voeg drie mils media toe om de Accutase verder te verdunnen. Centrifugeer gedurende vier minuten bij 200 G bij kamertemperatuur. Verwijder supernatant uit de celkorrel en resuspend de cellen in een mil van vers medium.

Pipetteer twee tot drie keer zachtjes op en neer om celklompen op te lossen. Verwijder fibronectine uit gecoate zes putten en voeg onmiddellijk een mil verse media toe aan elke put. Voeg voor een split ratio van 1:2 500 microliters van de celsuspensie toe in de ene put en de andere 500 in een tweede put.

Verdeel de cellen door de zes goed voorzichtig in noord-zuid oost-west richting te schudden en in 37 graden weefselkweek incubator te plaatsen. Observeer de cellen de volgende dag onder de microscoop en verander media met één tot twee mils. Verander elke dag van medium totdat de cellen weer kunnen worden gesplitst.

Bereid NPC-media voor die FGF bevatten in verhoogde concentratie zonder EFG of heparine, zoals te zien is in tabel één. Bij deze nieuwe splitsing zaait u een put met cellen in conversiemedia en de andere goed in NPC-media. Blijf dagelijks van media van iNPC's veranderen met één tot twee miljoen NPC-media.

Bereid astrocytmedia voor volgens tabel één. Om astrocyten te maken van verse iNPC's, zaai iNPC's rechtstreeks in 10 mils astrocyt media in 10 centimeter fibronectine-gecoate platen zodat ze de volgende dag ongeveer 10% samenvloeien. Kweekcellen bij 37 graden Celsius in een co2-weefselkweek-incubator van 5%.

Verander medium met 10 mils astrocyt media drie dagen na plating. Laat de cellen vijf tot zeven dagen differentiëren. Om te zaaien voor experimenten, splits de astrocyten met trypsine of Accutase zoals beschreven in stap 2 tot en met 2.6.

Aanbevolen zaaidichtheden zijn opgenomen in tabel twee. Instructies voor het portioneren van iNPC's om geïnduceerde astrocyten te genereren bevinden zich in tabel drie. Om astrocyten uit bevroren iNPC-voorraden te maken, verwijdert u het voorraadbestand van de portie uit de opslagtank voor vloeibare stikstof en ontdooit u snel bij 37 graden Celsius.

Zodra cellen zijn ontdooid, pipetceloplossing in een buis van 15 mil met vijf mils astrocytmedia. Centrifugeer gedurende vier minuten op kamertemperatuur van 200 G. Verwijder supernatant en resuspend in een mil verse astrocyt medium.

Voeg negen mils verse astrocyt medium toe aan een met fibronectine bedekte schaal van 10 centimeter en voeg een mil celoplossing toe, waarbij cellen voorzichtig worden verdeeld in noord-zuidoost-west beweging. Kweekcellen bij 37 graden Celsius in een co2-weefselkweek-incubator van 5%. Dit protocol maakt het mogelijk om iNPC's rechtstreeks rechtstreeks van menselijke huidfibrose te genereren met behulp van retrovirussen die de Yamanaka-factoren bevatten.

Deze methode maakt het mogelijk om de stamceltoestand en de behoefte aan klonale selectie te omzeilen, waardoor klonale variatie wordt vermeden. Belangrijke stappen om in gedachten te houden tijdens het conversieproces zijn de fibroblast zaaidichtheid, media pH en het houden van de cellen op een optimale samenvloeiing. Voorbeelden van optimale confluency- en morfologische veranderingen tijdens het conversieproces zijn te vinden in figuur één.

Nadat het conversieproces is voltooid, vertonen de NPC's sterk verminderde expressie of geen expressie van fibroblastmarkers en morfologie en drukken ze NPC-specifieke celmarkers uit. Bovendien kunnen ze ook worden gebruikt voor het genereren van verschillende cellijnen zoals geïnduceerde neuronen, oligodendrocyten en astrocyten. Onze ervaring is dat geïnduceerde astrocyten in het bijzonder zeer waardevol zijn voor het testen van geneesmiddelen en ziektemechanismen, omdat ze in zuivere populaties in reproduceerbare grote aantallen kunnen worden gegenereerd.

Geïnduceerde astrocyten kunnen worden onderscheiden van iNPC's door een klein aantal cellen te nemen tijdens het splitsen of een eerder bevroren iNPC-gedeelte en direct te plateren in astrocytmedia. Belangrijke overwegingen tijdens dit proces zijn het handhaven van de initiële zaaidichtheid van de iNPC's, omdat is aangetoond dat een hoge seedingdichtheid het differentiatieproces belemmert, en extra aandacht besteden aan de media-pH omdat verzuring zelfs gezonde astrocyten kan activeren. Kortom, het directe conversieprotocol is een zeer snelle methode om neurale voorlopercellen te kunnen maken van huidmonsters van patiënten.

Dit maakt het mogelijk om een groter aantal celmonsters tegelijkertijd te bestuderen en echt te kijken naar diversiteit in de ziektecontext. We vinden dit een zeer sterke test die je kunt gebruiken om neurale voorlopercellen, neuronen, maar ook astrocyten te maken die vervolgens kunnen worden gebruikt in co-cultuur of alleen voor drugstests of mechanistische studies.