Name: Fluorescentie in situ hybridisatie op DNA-halopreparaten om hele chromosomen, telomeren en genloci te onthullen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Leer fluorescentie in situ hybridisatie op DNA-halopreparaten om chromosoomterritoria en telomeren te visualiseren. Deze kosteneffectieve methode analyseert nucleoskelet-bijlagen in kanker- en progeriacellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen prof. Michael Bittner bedanken voor het vriendelijke geschenk van chromosoomarmschildersondes. LG werd ondersteund door het door de EU gefinancierde EURO-Laminopathieën-project en het Brunel Progeria Research Fund.

<ol><li>Berezney, R., Coffey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+nuclear+protein+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a nuclear protein matrix.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 60 (4), 1410-1417 (1974).</li>
<li>Haaf, T., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+ordering+of+YAC+contigs+using+extended+chromatin+and+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">High resolution ordering of YAC contigs using extended chromatin and chromosomes.</a> Human Molecular Genetics. 3 (4), 629-633 (1994).</li>
<li>Parra, I., Windle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+visual+mapping+of+stretched+DNA+by+fluorescent+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">High resolution visual mapping of stretched DNA by fluorescent hybridization.</a> Nature Genetics. 5 (1), 17-21 (1993).</li>
<li>Senger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Released+chromatin%3A+linearized+DNA+for+high+resolution+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Released chromatin: linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization.</a> Human Molecular Genetics. 3 (8), 1275-1280 (1994).</li>
<li>Florijn, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+DNA+Fiber-FISH+for+genomic+DNA+mapping+and+colour+bar-coding+of+large+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes.</a> Human Molecular Genetics. 4 (5), 831-836 (1995).</li>
<li>Elcock, L. S., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+on+DNA+halo+preparations+and+extended+chromatin+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization on DNA halo preparations and extended chromatin fibres.</a> Methods Molecular Biology. 659, 21-31 (2010).</li>
<li>Heiskanen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+mapping+by+fiber-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Visual mapping by fiber-FISH.</a> Genomics. 30 (1), 31-36 (1995).</li>
<li>Bensimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+and+sensitive+detection+of+DNA+by+a+moving+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alignment and sensitive detection of DNA by a moving interface.</a> Science. 265 (5181), 2096-2098 (1994).</li>
<li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+combing%3A+stretching+the+whole+human+genome+for+high-resolution+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular combing: stretching the whole human genome for high-resolution studies.</a> Science. 277 (5331), 1518-1523 (1997).</li>
<li>Wilson, R. H., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+DNA+replication+and+the+nuclear+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Relationship between DNA replication and the nuclear matrix.</a> Genes Cells. 18 (1), 17-31 (2013).</li>
<li>Wilson, R. H. C., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation-induced+changes+in+the+DNA-nuclear+matrix+interface%2C+revealed+by+high-throughput+analysis+of+DNA+halos%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Transformation-induced changes in the DNA-nuclear matrix interface, revealed by high-throughput analysis of DNA halos.</a> Science Reports. 7 (1), 6475(2017).</li>
<li>Iarovaia, O. V., Akopov, S. B., Nikolaev, L. G., Sverdlov, E. D., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+transcription+within+chromosomal+DNA+loops+flanked+by+MAR+elements+causes+an+association+of+loop+DNA+with+the+nuclear+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of transcription within chromosomal DNA loops flanked by MAR elements causes an association of loop DNA with the nuclear matrix.</a> Nucleic Acids Research. 33 (13), 4157-4163 (2005).</li>
<li>Tandara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+DNA+integrity+testing%3A+big+halo+is+a+good+predictor+of+embryo+quality+and+pregnancy+after+conventional+IVF%5BTitle%5D)+AND+%22Andrology%22%5BJournal%5D)">Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF.</a> Andrology. 2 (5), 678-686 (2014).</li>
<li>Repping, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+spermHALO-FISH+to+determine+DAZ+gene+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The use of spermHALO-FISH to determine DAZ gene copy number.</a> Mol Human Reproduction. 9 (4), 183-188 (2003).</li>
<li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Farnesyltransferase+inhibitor+and+rapamycin+correct+aberrant+genome+organisation+and+decrease+DNA+damage+respectively%2C+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Farnesyltransferase inhibitor and rapamycin correct aberrant genome organisation and decrease DNA damage respectively, in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts.</a> Biogerontology. 19 (6), 579-602 (2018).</li>
<li>Telenius, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degenerate+oligonucleotide-primed+PCR%3A+general+amplification+of+target+DNA+by+a+single+degenerate+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer.</a> Genomics. 13 (3), 718-725 (1992).</li>
<li>Bridger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+pKi-67+with+satellite+DNA+of+the+human+genome+in+early+G1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Association of pKi-67 with satellite DNA of the human genome in early G1 cells.</a> Chromosome Research. 6, 13-24 (1998).</li>
<li>Sales Gil, R., Vagnarelli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67%3A+More+Hidden+behind+a+%27Classic+Proliferation+Marker%27%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ki-67: More Hidden behind a 'Classic Proliferation Marker'.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 747-748 (2018).</li>
<li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+elongation+through+hTERT+immortalization+leads+to+chromosome+repositioning+in+control+cells+and+genomic+instability+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts%2C+expressing+a+novel+SUN1+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">Telomere elongation through hTERT immortalization leads to chromosome repositioning in control cells and genomic instability in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts, expressing a novel SUN1 isoform.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (6), 341-356 (2019).</li>
<li>Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+a+filamentous+nucleoskeleton+with+a+23+nm+axial+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Visualization of a filamentous nucleoskeleton with a 23 nm axial repeat.</a> EMBO Journal. 7, 3667-3677 (1988).</li>
<li>Albrethsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+nuclear+matrix+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unravelling the nuclear matrix proteome.</a> Journal of Proteomics. 72, 71-81 (2009).</li>
<li>Mika, S., Rost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMPdb%3A+Database+of+nuclear+matrix+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">NMPdb: Database of nuclear matrix proteins.</a> Nucleic Acids Research. 33, 160-163 (2005).</li>
<li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((of+the+nuclear+matrix-bound+chromatin+hubs+by+a+new+M3C+experimental+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure.</a> Nucleic Acids Research. 38, 8051-8060 (2010).</li>
<li>Sjakste, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+nuclear+matrix+proteins+in+malignant+transformation+and+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Oncology%22%5BJournal%5D)">Role of the nuclear matrix proteins in malignant transformation and cancer diagnosis.</a> Experimental Oncology. 26 (3), 170-178 (2004).</li>
<li>Leman, E. S., Getzenberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+structure+as+a+source+of+cancer+specific+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear structure as a source of cancer specific biomarkers.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 104 (6), 1988-1993 (2008).</li>
<li>Volpi, E. V., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+glossary%3A+an+overview+of+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique.</a> Biotechniques. 45 (4), 385-386 (2008).</li>
<li>Bridger, J. M., Foster, H. A. Senescence and the Genome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBridger%2C+JM+%22Human+Interphase+Chromosomes%22">Human Interphase Chromosomes</a>. , Springer. New York. Ed. Ivan Iourov (2021).</li>
<li>Foster, H. A., Griffin, D. K., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interphase+chromosome+positioning+in+in+vitro+porcine+cells+and+ex+vivo+porcine+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Interphase chromosome positioning in in vitro porcine cells and ex vivo porcine tissues.</a> BMC Cell Biology. 13 (1), 30(2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De DNA-halo-methode is een uitstekende methode bij het analyseren van interacties tussen het nucleoskelet en het genoom, maar er zijn ook enkele kritieke stappen die moeten worden gevolgd. Een van de belangrijkste parameters is de optimalisatie van de celzaaidichtheid. Als cellen overconfluent worden, zullen de DNA-halo's overlappen met naburige cellen, waardoor het onmogelijk wordt om de analyse uit te voeren. De CSK- en extractiebuffers moeten altijd vers worden gemaakt op de dag van gebruik, waarbij spermine, spermidine en digitonine aan het einde van het bereidingsproces aan de extractiebuffer worden toegevoegd om hun biologische activiteit te behouden. Bij het uitvoeren van Halo-FISH is het uiterst belangrijk om de juiste denaturatietemperatuur van de DNA-halo's te gebruiken om de sonde of verf vervolgens te laten hybridiseren.
Elektronenmicroscopie is gebruikt om de nucleaire matrix te visualiseren, waarbij filamenteuze structuren worden geïdentificeerd20. Elektronenmicroscopie is echter beperkt omdat matrixassociaties met chromatine niet gemakkelijk kunnen worden afgeleid. Inderdaad, de DNA Halo-methode is veelzijdiger in vergelijking met elektronenmicroscopie, omdat specifieke genen, chromosomen en celtoestanden allemaal kunnen worden onderzocht. Verder wordt proteomische analyse van nucleaire matrixeiwitten bestudeerd21,22. Deze methode is goed voor het vergelijken van nucleaire matrixcomponenten, vooral bij het vergelijken van zieke cellen, maar het biedt niet de ruimtelijke verdeling en bijlagen die worden gemarkeerd door de standaard DNA Halo-techniek.
DNA Halo-testen hebben beperkingen. Ten eerste, omdat de matrix wordt geëxtraheerd, kan dit alleen worden uitgevoerd op vaste cellen, dus live beeldvorming is niet mogelijk. Hoewel de DNA Halo-methode relatief snel en gemakkelijk uit te voeren is, kan het algehele proces tijdrovend zijn wanneer celkweek, sondegeneratie, Halo-FISH en analyse allemaal in aanmerking worden genomen.
Beeldopname van DNA Halo's en HALO-FISH met behulp van superresolutiemicroscopie zou de resolutie van DNA-specifieke sondes en antilichamen aanzienlijk verbeteren. Omdat fluorochromen gemakkelijker spectraal kunnen worden opgelost, kan het bovendien mogelijk zijn om een aantal DNA-sondes in één experiment te gebruiken, wat nog meer informatie oplevert. Verbeteringen in moleculair biologische technieken zoals chromosoomconformatievangst (3C) zijn gebruikt om interacties van genloci te bepalen en de ruimtelijke organisatie op chromatine in de cel te analyseren. DNA Halo-assays en 3C kunnen worden gecombineerd, een term die bekend staat als M3C23, wat opnieuw het aanpassingsvermogen van de DNA Halo-techniek aantoont.
De oorspronkelijke gegevens die hier worden gepresenteerd, zijn bedoeld om de mogelijkheden voor genoomgedragsondervraging aan te tonen en hoe die gegevens moeten worden gepresenteerd. Met deze gegevens hebben we aangetoond dat het mogelijk is om significante verschillen in genoomaanhechtheid te bepalen met behulp van (1) chromosoomschildersondes, in deze studie blijkt dat chromosoom 18 het minst gehechte chromosoom is van de geanalyseerde (figuur 3); (2) Genloci met significante verschillen tussen twee genloci en (figuur 4) (3) telomeren, die minder sterk gehecht zijn in rustige cellen in vergelijking met prolifererende en senescente cellen (figuur 5). We zijn in staat om onderscheid te maken tussen prolifererende en niet-prolifererende cellen via de aanwezigheid van de proliferatiemarker Ki67-antigeen, een onoplosbaar eiwit dat dus bij de resterende kernen blijft, of met behulp van de opname van nucleotiden om cellen te markeren die binnen een bepaalde periode de S-fase hebben doorlopen (figuur 2). Deze techniek heeft ons ook in staat gesteld om genoomgedrag te analyseren in cellen die zijn aangetast in hun nucleoskeletten, d.w.z. laminopathiecellen en hier en in Bikkul et al., 2018 onthullen we dat het genoom minder strak kan worden bevestigd in vergelijking met controlecellen en kan worden hersteld bij behandeling met specifieke geneesmiddelen die het effect van de lamin A-mutatie in klassieke HGPS-cellen verbeteren15. We tonen hier echter nieuwe gegevens voor de atypische HGPS AGO8466-cellen, die geen lamin A-mutatie hebben, maar een ongebruikelijke vorm van het LINC-complexeiwit SUN1 19 bevatten waar chromosoom13 minder strak in vastzit (figuur 6).
HALO-FISH is een unieke methode die de studie van genomische interacties met het nucleoskeleton in combinatie met indirecte immunofluorescentie mogelijk maakt om eiwitten op te lossen die niet uit de extractieprocedure zijn verwijderd. Het is aangetoond dat het nucleoskelet is gemodificeerd bij verschillende ziekten zoals bepaalde kankertypes19 en het belang van sommige nucleoskeleton-geassocieerde eiwitten als diagnostische biomarkers24,25. Deze techniek speelt dus een belangrijke rol bij het onderzoeken van het effect van het nucleoskeleton op chromatine-organisatie/-desorganisatie bij ziekte 15,24,25,27 en is niet beperkt tot menselijke cellen, met chromosomale schildersondes van andere dieren zou hetzelfde DNA-haloprotocol kunnen worden gebruikt 28.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated from:
Lauren S. Godwin1 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire
to:
Lauren S. Godwin1 
Emily Roberts2 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

De "nucleaire matrix" werd voor het eerst beschreven door Berezney en Coffey in 19741. Na het uitvoeren van extracties met hoge zoutkiezen en nucleasebehandeling op leverkernen van ratten, identificeerden ze een eiwitachtig structureel raamwerk. De DNA-haloprocedure werd vervolgens aangepast van deze methode en omvat de verwijdering van oplosbare eiwitten, zodat alleen de nucleaire matrix (NM) en NM-geassocieerde eiwitten en chromosomen blijven bestaan. DNA-aanhechtingsgebieden bevinden zich aan de basis van DNA-lussen en worden matrix attached regions (MARs) of scaffold attachment regions (SAR's) genoemd, die resistent zijn tegen extractie met hoge zoutconcentraties en respectievelijk ionisch wasmiddel lithium-3,5-diiodosalicylaat (LIS). In DNA-halo's wordt DNA geassocieerd met MARs / SAR's gebonden binnen de resterende kern, terwijl de DNA-lussen zich uitstrekken van deze plaatsen en de DNA-halo vormen. We weten nu dat het genoom via lamina-geassocieerde domeinen (LADs) is verankerd aan de nucleaire lamina en via nucleolaire geassocieerde regio's (NADs) en mogelijk via andere nucleaire structuren zoals specifieke nucleaire lichamen.
De DNA-halo-methode kan worden gebruikt voor het fysiek in kaart brengen van DNA, genen en chromosomale regio's, omdat het uitgebreide DNA en chromatine een grotere resolutie bieden omdat het chromatine is ontdaan van histonen en het DNA 2,3,4,5,6 is uitgerekt. Er zijn echter enkele beperkingen bij het gebruik van DNA-halo's voor deze toepassing. DNA dat nauw verbonden is met restkernen van DNA-halo's kan bijvoorbeeld ontoegankelijk zijn voor sondes, waardoor het wordt uitgesloten van analyse en fysieke kartering6. Andere technieken zoals fiber-FISH 2,4,5,7 en moleculair kammen8 maken ook fysieke mapping mogelijk en hebben het voordeel dat ze relatief snel en gemakkelijk uit te voeren zijn. Beide worden bij voorkeur gebruikt voor DNA-mapping van genen boven DNA-halo's. Deze methoden extraheren chromatinevezels via het gebruik van oplosmiddel- of zoutextracties uit de kern, maar moleculair kammen heeft meestal een betere reproduceerbaarheid 8,9.
Er is een toenemend bewijs dat het nucleoskelet een rol speelt bij het ondersteunen van belangrijke nucleaire processen, zoals hechtingsplaatsen voor DNA, chromatine-remodellering, DNA-transcriptie, DNA-reparatie en DNA-replicatie11,12. Als zodanig is de DNA-halotechniek ontwikkeld om de interacties tussen het nucleoskelet en het genoom tijdens deze cellulaire activiteiten te onderzoeken en is routinematig gebruikt en gerapporteerd in onderzoek. Deze techniek is ook gebruikt om interacties tussen het genoom en het nucleoskeleton te onderzoeken in relatie tot ziekteprogressie waarbij maligniteit-geassocieerde veranderingen in de nucleaire structuur worden geïdentificeerd11.
De DNA-halotechniek is ook gebruikt om de relatie tussen het genoom en het nucleoskelet tijdens de ontwikkeling en differentiatie te onderzoeken12. Een aantal studies hebben een variatie van de DNA-halotechniek gebruikt die bekend staat als halosperm13 of SpermHalo-FISH indien gekoppeld aan FISH14. Spermatozoa chromatine is nauw gebonden aan eiwitten die bekend staan als protamines en deze techniek is ontwikkeld om de toegang tot het sperma-DNA te verbeteren. Halosperm is gebruikt om de integriteit van spermatozoa DNA te onderzoeken en te bepalen of DNA-schade aanwezig is. Spermatozoa met minder DNA-schade correleren met een grotere DNA-halogrootte, terwijl spermatozoa met verhoogde niveaus van gefragmenteerd en beschadigd DNA kleine halo's of helemaal geen halo's hadden. Halosperm kan dus worden gebruikt als een potentiële prognostische marker van embryokwaliteit en succesvolle zwangerschap met IVF13. Dit voorbeeld benadrukt de mogelijke klinische toepassingen van deze techniek. In ons werk hebben we HALO-FISH gebruikt om veranderingen in genoomgedrag en het effect van specifieke medicamenteuze behandelingen bij de vroegtijdige verouderingsziekte Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome (HGPS) te beoordelen15.
Samen benadrukken deze, en andere studies, de breedte van processen / toepassingen die de DNA-halo-techniek kan worden gebruikt om te bestuderen en het nut van de techniek.

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10388739</td><td>Gebruikt om DNA-halo's te creëren</td></tr><tr><td>5-bromo-2&prime;-deoxy-uridine&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5002-100MG</td><td>Gelabeld nucleotide</td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&prime;-deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100MG</td><td>Gelabeld nucleotide</td></tr><tr><td>Agar Technical</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15562141</td><td>DNA-isolatie van BAC-klonen</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A939-50G</td><td>Controleer productgrootte van DOP-PCR en nick-translatie</td></tr><tr><td>Atypische type 2 HGPS-fibroblasten (AG08466)</td><td>Coriell Institute</td><td>AG08466</td><td>Cellijn</td></tr><tr><td>Bacto trypton</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16269751</td><td>DNA-isolatie van BAC-klonen</td></tr><tr><td>Biotin-16-dUTP</td><td>Roche Diagnostics&nbsp;</td><td>11093711103</td><td>Gelabelde nucleotiden</td></tr><tr><td>Chloramfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378-25G</td><td>DNA-isolatie van BAC-klonen</td></tr><tr><td>Klassieke Hutchinson-Gilford progeria-syndroom (HGPS) fibroblasten (AG06297)&nbsp;</td><td>Coriell Institute</td><td>AG0297</td><td>Cellijn</td></tr><tr><td>Coplin-pot</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12608596</td><td>Houdt 5 dia's of 8 dia's rug aan rug</td></tr><tr><td>Cot-1 DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15279011</td><td>Blokkeer niet-specifieke hybridisatie in HALO FISH</td></tr><tr><td>DEPC-behandeld water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>693520-1L</td><td>DNA-isolatie van BAC-klonen</td></tr><tr><td>Dextraansulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4030</td><td>Hybridisatiemengsel</td></tr><tr><td>Digitonine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td>Onderdeel van extractiebuffer</td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-dUTP&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11093088910</td><td>Gelabelde nucleotiden</td></tr><tr><td>Donkey anti-muis Cy3</td><td>Jackson Laboratory</td><td>715-165-150</td><td>Secundair antilichaam</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>Onderdeel van extractiebuffer</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>Onderdeel van extractiebuffer</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>443611</td><td>Probe precipitatie en HALO FISH</td></tr><tr><td>Fetaal bovien systeem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td>Celcultuurserum</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10523525</td><td>2D FISH van DNA-halo's</td></tr><tr><td>Glaswol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18421</td><td>Spinkolom</td></tr><tr><td>Haringsperma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7290</td><td>Probe precipitatie</td></tr><tr><td>HXP&trade; Lamp (metaalhalogenide microscooplamp)</td><td>OSRAM</td><td>HXP-R120W45C VIS</td><td>Beeldvastlegging van DNA-halo's</td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313680</td><td>Reiniging van microscoopglazen</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516-25ML</td><td>DNA-isolatie van BAC-klonen</td></tr><tr><td>KAPA HiFi PCR Kit</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2103</td><td>PCR-kit</td></tr><tr><td>Leica DM4000 fluorescente microscoop met DFC365 FX-camera en LAS AF (Versie: 4.5.0) beeldvastlegsoftware.</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Beeldvastlegging van DNA-halo's</td></tr><tr><td>Luria-Bertani-agar&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13274843</td><td>DNA-isolatie van BAC-klonen</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Onderdeel van CSK-buffer</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10284580</td><td>Reiniging en sterilisatie van microscoopglazen</td></tr><tr><td>Muis anti-BrdU-antilichaam</td><td>BD Pharmingen</td><td>B2531-100UL</td><td>BrdU-visualisatie</td></tr><tr><td>Newborn calf serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16010159</td><td>Celcultuurserum en blokkeringsreagens</td></tr><tr><td>Nick translatie kit</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR-kwaliteitswater</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>693520-1L</td><td>PCR en DNA-isolatie van BAC-klonen</td></tr><tr><td>PCR-primers</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1851</td><td>Onderdeel van CSK- en extractiebuffers</td></tr><tr><td>Kaliumacetaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190-100G</td><td>DNA-isolatie van BAC-klonen</td></tr><tr><td>QuadriPERM&reg; 4 X 12</td><td>SARSTEDT</td><td>94.6077.307</td><td>Vierkante celcultuurschaal, polystyreen met vier compartimenten.&nbsp; Deze heeft een hydrofobe oppervlakte, is steriel, niet-pyrogeen/endotoxine-vrij en niet-cytotoxisch.</td></tr><tr><td>Konijn anti-Ki67-antilichaam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ZRB1007-25UL</td><td>Proliferatiemarker</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>DNA-isolatie van BAC-klonen</td></tr><tr><td>Rubbercement</td><td>Halford's</td><td>101836</td><td>2D FISH van DNA-halo's</td></tr><tr><td>Sephadex G-50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6022-25G</td><td>Spinkolom</td></tr><tr><td>Natriumacetaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>Probe precipitatie</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>Onderdeel van CSK-, extractie- en SSC-buffers</td></tr><tr><td>Natriumcitraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8532</td><td>Onderdeel van SSC-buffer</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat&nbsp;</td><td></td><td>L3771-100G</td><td>DNA-isolatie van BAC-klonen</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td>DNA-isolatie van BAC-klonen</td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td>Onderdeel van extractiebuffer</td></tr><tr><td>Spermine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4264</td><td>Onderdeel van extractiebuffer</td></tr><tr><td>Streptavidine-Cy3&nbsp;</td><td>Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies</td><td>pa43001</td><td>Probe antilichaam</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>Onderdeel van CSK-buffer</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>CSK-buffer+A66:D68</td></tr><tr><td>SuperFrost&trade; microscoopglazen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>

fluorescentie in situ hybridisatie op dna-halopreparaten om hele chromosomen, telomeren en genloci te onthullen

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

Het genoom is geassocieerd met verschillende structuren in celkernen, om de activiteit ervan te reguleren en op specifieke locaties te verankeren. Deze structuren staan gezamenlijk bekend als het nucleoskelet en omvatten de nucleaire lamina, de nucleoli en nucleaire lichamen. Hoewel er veel varianten van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) bestaan om het genoom en zijn organisatie te bestuderen, zijn deze vaak beperkt door resolutie en bieden ze onvoldoende informatie over de associatie van het genoom met nucleaire structuren. De DNA-halo-methode maakt gebruik van hoge zoutconcentraties en niet-ionische detergentia om DNA-lussen te genereren die verankerd blijven aan structuren in kernen via hechtingsgebieden in het genoom. Hier worden oplosbare nucleaire eiwitten, zoals histonen, lipiden en DNA dat niet nauw gebonden is aan de kernmatrix, geëxtraheerd. Dit leidt tot de vorming van een halo van ongebonden DNA rond een restkern die zelf DNA bevat dat nauw verbonden is met interne nucleaire structuren en extractieresistente eiwitten. Deze uitgebreide DNA-strengen maken een hogere resolutie mogelijk en kunnen fysieke mapping vergemakkelijken. In combinatie met FISH heeft deze methode het extra voordeel dat het genomische interacties bestudeert met alle structuren waarmee het genoom is verankerd. Deze techniek, halo-fish genaamd, is zeer veelzijdig waarbij DNA-halo's kunnen worden gekoppeld aan nucleïnezuursondes om genloci, hele chromosomen, alfasatellieten, telomeren en zelfs RNA te onthullen. Deze techniek geeft inzicht in nucleaire organisatie en functie in normale cellen en in ziekteprogressie zoals bij kanker.

Deze methode van DNA-halovoorbereiding heeft ons geholpen bij onze inspanningen om verschillen in genoomgedrag te bepalen in jonge en oude cellen, maar ook in cellen die zijn afgeleid van vroegtijdige verouderingsziekten met afwijkende nucleoskeletale eiwitten15. Figuur 1 toont voorbeelden van DNA-halo's waarbij het mogelijk is om de rand van een restkern te zien, het DNA dat in de restkern achterblijft en het niet-vastgemaakte DNA dat in de omgeving is uitgespoeld, waardoor een DNA-halo ontstaat. Het toont ook de analyse die laat zien hoe de restkern wordt verkregen en de NE- en CTE-metingen. Het is mogelijk om onderscheid te maken tussen prolifererende en niet-prolifererende cellen door ofwel een gelabeld nucleotide zoals BrdU op te nemen wanneer cellen zich in de S-fase bevinden of door gebruik te maken van de diagnostische proliferatiemarker anti-pKi67, die nucleoli onthult, en regio's van heterochromatine in G1-cellen17,18. Primaire cellen die in hoog serum worden gekweekt zonder confluentie te bereiken, die negatief zijn voor de proliferatiemarkers, worden verondersteld senescent te zijn. Primaire cellen die in een laag serum zijn gekweekt of confluent zijn geworden, d.w.z. contactremmend die negatief zijn voor de proliferatiemarkers, worden als rustig beschouwd en zouden in staat zijn om de proliferatieve celcyclus opnieuw in te voeren gezien de juiste voedingsstoffen en situatie. Het kunnen onderscheiden van Ki67 positieve en negatieve cellen heeft ons in staat gesteld om verschillen te bepalen tussen prolifererende, rustige en senescente menselijke dermale fibroblasten. Figuur 2 toont DNA-halo's van prolifererende menselijke dermale fibroblasten gemaakt van cellen waar BrdU in is opgenomen tijdens DNA-replicatie, een mechanisme dat niet voorkomt in niet-prolifererende cellen, en vervolgens gekleurd met anti-BrdU-antilichaam. Kleuring met de proliferatieve marker anti-pKi67 antilichaam is ook zichtbaar in figuur 2. Dit is een robuust antigeen en overleeft het FISH-protocol en kan dus worden gekleurd voor post-FISH en voormontage. Prolifererende cellen zijn dus positief (rood) voor BrdU en anti-pKi67 (rood) in de linkerkolom en niet-prolifererende cellen, inderdaad senescente cellen in figuur 2, worden weergegeven in de rechterkolom. De groene signalen zijn individuele telomeren die worden onthuld met een telomeer-PNA FISH / FITC-kit. Het combineren van immunofluorescentie met DNA-halo's maakt analyse tijdens verschillende celtoestanden mogelijk, zoals weergegeven in figuur 2 bij het onderzoeken van prolifererende, rustige en senescente cellen. Afhankelijk van het gekozen antilichaam kunnen andere aandoeningen worden onderzocht, zoals differentiatie, DNA-schade via bestraling etc.
Chromosoomgebieden kunnen ook worden gevisualiseerd in DNA-halo's met behulp van FISH. Vanwege de voorbereiding die het mogelijk maakt om DNA uit de kernen te spoelen, kan de vorm van het chromosoomgebied worden verstoord, met kleinere of grotere hoeveelheden van het chromosoom in de DNA-halo, afhankelijk van de verankering van het genoom in de resterende kern en zijn structuren. Figuur 3 toont een panel van DNA-halo's waarbij individuele chromosomen zijn onthuld met specifieke chromosoom-schildersondes (rood) voor chromosomen 1, 13, 17 en 18. Anti-pKi67 (groen) is gebruikt om prolifererende cellen en de afwezigheid ervan binnen dezelfde cultuur te markeren, op dezelfde dia, wat senescente cellen aanduidt. Het is heel duidelijk uit de afbeeldingen en de gegevens gepresenteerd als CTE / NE dat het kleine genarme chromosoom 18 een chromosoom is dat weinig aanhechtingen heeft en verder naar buiten spoelt in de DNA-halo, weg van de resterende kernen en aanzienlijk verder van het centrum van de resterende kernen ligt dan de andere chromosomen. Dit geldt echter ook voor chromosoom 1. Met behulp van de proliferatieve marker anti-pKi67 is het ook mogelijk geweest om proliferatie te vergelijken met senescente cellen, binnen dezelfde cultuur en op dezelfde dia, en deze analyse heeft aangetoond dat chromosomen binnen deze twee zeer verschillende celstatussen niet significant van elkaar verschillen, met betrekking tot hechting aan de resterende nucleaire structuren.
Interessant is dat genen ook statistisch significante verschillen vertonen tussen prolifererende en senescente cellen met betrekking tot het blijven in een restkern of zich in de DNA-halo bevinden. Figuur 4 laat dit zien met genloci afgebakend door gelabelde BAC-sondes in rood en anti-Ki67 in groen. Er zijn geen significante verschillen tussen genlocaties in de prolifererende versus de senescente cellen, na een DNA Halo-preparaat. Er zijn echter significant meer catenine alfa 1 CTNNA1 loci in de DNA halo dan cycline D1 CNDD1 loci, waar er zeer weinig zijn. Figuur 5 toont DNA-halopreparaten met telomeren in het groen. De achtergrond wordt opzettelijk hoog gelaten om telomeersignalen in de DNA-halo te kunnen visualiseren. In deze set van gegevens zijn rustige cellen, d.w.z. cellen die 7 dagen lang serumhonger hebben gehad, opgenomen en interessant genoeg zijn er aanzienlijk meer telomeren losgemaakt en gelegen in de DNA-halo's in rustige cellen dan voor prolifererende en senescente cellen. In figuur 5a is het aandeel telomeren in de DNA-halo te zien, met name voor de afbeelding 'Experiment 2'. Dit komt overeen met figuur 5b waar het gemiddelde percentage telomeren in DNA-halo ongeveer 17% is in rustige cellen. Er zijn aanwijzingen dat niet alle telomeren in senescente cellen kunnen worden gezien, omdat sommige misschien erg kort zijn.
Deze methode van DNA-halo is succesvol geweest voor ons om genoominteractieveranderingen binnen kernen in zieke cellen te onderzoeken15. Figuur 6 toont verschillen in chromosoomaanhechting in primaire controlefibroblasten en in zieke cellen met typische (lamin A-mutatie) en atypische Hutchinson-Gilford Progeria-syndroom, waarbij een andere SUN1-isovorm en geen lamin A-mutatie tot expressie komt19. Chromosomen 1 en 13 vertonen statistisch significante verschillen in hun aanhechting binnen de restkernen in vergelijking met controle-DNA-halo's. Figuur 6b correleert de positie van het hele chromosoomgebied met de restkern en DNA Halo. Waarden van 1 of minder geven aan dat het chromosoom zich binnen de restkern bevindt en waarden boven 1 tonen chromosomen of delen van chromosomen binnen de DNA-halo.
Over het algemeen benadrukt dit het nut van HALO-FISH bij het onderzoeken van genomische interacties van hele chromosomen, specifieke genen en telomeren onder verschillende omstandigheden die de celcyclus beïnvloeden (proliferatie, rust en senescentie) of in ziektecellen, bijvoorbeeld progeria en kankercellijnen. Inderdaad, de verschillen in interacties tussen deze toestanden impliceert dat het nucleoskeleton een belangrijke rol speelt bij het reguleren van belangrijke processen binnen de kern.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig01.jpg"> Figuur 1: HDF geëxtraheerde kern met de resterende kern en DNA-halo en overzicht van de analysemethode. a) Een HDF-kern bereid via DNA-halo-assay en tegengekleurd met DAPI. De felgekleurde restkern toont DNA verankerd aan het nucleoskeleton en dit is omgeven door het niet-gehechte DNA dat een halo van DNA vormt. Vergroting = x 100; schaalbalk 10 μm. (b) Het blauwe kanaal vangt de met DAPI gekleurde kern en het omringende DNA op. De restkern wordt geselecteerd en verwijderd met ImageJ. De pijl geeft de afstand weer van het kerncentrum tot de resterende nucleaire rand (NE). c) Het rode kanaal toont het sondesignaal. d) De afbeelding met de aanduiding "Resultaat" is het resultaat van het over elkaar leggen van het rode kanaal op het blauwe kanaalbeeld; dit maakt de afstand van het nucleaire centrum tot de verste chromosoomterritoriumrand (CTE) mogelijk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig02.jpg"> Figuur 2: DNA-halopreparaat met telomeer PNA FISH op prolifererende en senescente HDF's. Telomere PNA FISH op HDF's onderworpen aan DNA-halo-assay. Telomeersignalen worden gevisualiseerd in groen (FITC), rest- en halo-DNA werd tegengekleurd met behulp van DAPI (blauw) en prolifererende kernen werden gedetecteerd met behulp van anti-BrdU- of anti-pKi67-antilichamen via indirecte immunofluorescentie in rood (TRITC). Vergroting = x 100; schaalbalk 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig03.jpg"> Figuur 3: Nucleoskeleton-chromosoom interacties en analyse met behulp van DNA halo assay. a) 2D-FISH met sondes specifiek voor chromosomen 1, 13, 15, 17 en 18 werd uitgevoerd op HDF's die werden onderworpen aan DNA-halopreparatie. Hele chromosomen werden rood geschilderd (Cy3) en kernen werden onderzocht met pKi67 om te bepalen of ze prolifereerden of senescent. Prolifererende cellen (pKi67+) werden in het groen afgebakend (FITC), terwijl senescente cellen onbevlekt bleven (pKi67-) d.w.z. geen groen signaal gedetecteerd. Vergroting = x 100; schaalbalk 10 μm. (b) Chromosoomverankering door het nucleoskelet in prolifererende en senescente HDF's die HALO-FISH hadden ondergaan. Metingen tonen de verhouding van de verste chromosoomterritoriumrand (CTE) tot de respectievelijke nucleaire rand (NE) voor chromosomen 1, 13, 15, 17 en 18 in prolifererende (pKi67+) en senescente (pKi67-) cellen. Foutbalken vertegenwoordigen ± SEM. (c) Gewijzigde box plot representatie van chromosoom territoriumrand (CTE) tot respectievelijke nucleaire rand (NE) van specifieke chromosomen in pKi67+ en pKi67-kernen. Q1 = lager kwartiel; Min = laagste geregistreerde waarde; Med = mediaan; Max = maximaal geregistreerde waarde; Q3 = bovenste kwartiel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig04.jpg"> Figuur 4: Genspecifieke interacties in HDF's met behulp van HALO-FISH. (a) DNA halo geëxtraheerde kernen werden onderzocht met genspecifieke sondes (CCND1 en CTNNA1) om hun verankering aan de NM op prolifererende en senescente cellen te onderzoeken. De gensignalen worden weergegeven in rood (Cy3) en anti-pKi67 toont prolifererende cellen en het signaal wordt gevisualiseerd in groen (FITC). Voor de prolifererende CCND1-afbeelding is de resterende kern ingesloten in de witte cirkel en de ruimte tussen de witte en groene cirkel toont de DNA-halo. Vergroting = x 100; schaalbalk 10 μm. (b) Genspecifieke signalen voor CCND1 en CTNNA1 worden vergeleken tussen de restkern en DNA-halo, en ook tussen prolifererende en senescente cellen. Foutbalken vertegenwoordigen ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig05.jpg"> Figuur 5: DNA-halotest op rustige HDF's onderzocht met telomeer PNA-FISH. (a) Rust van HDF's werd geïnduceerd door kweek in laag serummedium gedurende 7 dagen. De DNA-halo-assay werd uitgevoerd en PNA-FISH maakte visualisatie van telomeren mogelijk door FITC-signaal (groen) en de resterende kern en de omringende DNA-halo werd gecounterd met DAPI (blauw). Cellen werden ook gekleurd met anti-pKi67-antilichamen om ervoor te zorgen dat kernen niet-prolifereerden. Dit werd bij twee verschillende gelegenheden herhaald. Vergroting = x 100; schaalbalk 10 μm. (b) Vergelijking van het gemiddelde percentage telomeren gelokaliseerd in de DNA-halo in prolifererende, senescente en rustige HDF-cellen. Foutbalken vertegenwoordigen ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig06.jpg"> Figuur 6: Onderzoek van de verankering van het hele chromosoom naar het nucleoskelet in HGPS-cellen met behulp van HALO-FISH26. (a) Controle HDF (2DD), klassieke HGPS (AG06297) en atypische type 2 HGPS (AG08466) kernen ondergingen DNA-halovoorbereiding en vervolgens 2D-FISH met behulp van hele chromosoomverven voor chromosoom 1, 13, 15 en 17. Hele chromosomen zijn in het groen afgebeeld (FITC) en DNA werd tegengekleurd met DAPI (blauw). Vergroting = x 100; schaalbalk 10 μm. (b) De positionering van chromosomen in geëxtraheerde kernen werd bepaald door de verhouding van de gemiddelde chromosoomterritoriumrand (CTE) tot de nucleaire rand (NE) te meten. Een verhouding boven 1 toont aan dat de verste CTE buiten het corresponderende NE binnen de DNA-halo ligt, terwijl een verhouding onder 1 betekent dat de verste CTE binnen het NE binnen de restkern ligt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Kiezers</td>
			<td>Volume (μL)</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5XDOP-PCRbuffer</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>dNTPmix (zonderTTP) (2mM)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>dTTP (2mM)</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Biotine-16-dUTPorDigoxigenine-11-dUTP</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>DOPprimer (20μM)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>TaqDNAPolymerase(1U/μL)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>PCRgradewater</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>Sjabloon</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Tabel met de DOP-PCR componenten en volumes voor een 1x reactie
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Stap</td>
			<td>Cycli</td>
			<td>Temp (graad Celsius)</td>
			<td>Tijd</td>
		</tr><tr><td>Initiële denaturatie</td>
			<td>1</td>
			<td>95</td>
			<td>3 min</td>
		</tr><tr><td>Denaturatie</td>
			<td rowspan="3">34</td>
			<td>98</td>
			<td>20 s</td>
		</tr><tr><td>Primer gloeien</td>
			<td>62</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>Extensie</td>
			<td>72</td>
			<td>30 s</td>
		</tr><tr><td>Definitieve uitbreiding</td>
			<td>1</td>
			<td>72</td>
			<td>5 min</td>
		</tr><tr><td>Verkoeling</td>
			<td></td>
			<td>4</td>
			<td>Houden</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Tabel met de DOP-PCR-cyclus, temperatuur en tijdprofiel.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bestanddeel</td>
			<td>Volume (μL)</td>
		</tr><tr><td>10x NT buffer (0.5M Tris-HCl pH 8,50 mM MgCl2, 0.5 mg/ml BSA)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>0,1 M bèta-mercaptoethanol</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>10X Nucleotide voorraad (0,5 mM dATP, 0,5 mM dCTP, 0,5 mM dGTP, 0,5 mM dTTP, 0,5 mg/ml biotine-16-dUTP)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Dnase I (1 ng/ml)</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>DNApolymerase I</td>
			<td>5U per μg DNA</td>
		</tr><tr><td>DNAtemplate (1 μg)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>DEPC-behandeld water</td>
			<td>Tot 50 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 3: Tabel met de nick translatiecomponenten en volumes voor een enkele sonde.

Het combineren van DNA-halopreparaten met fluorescentie in situ hybridisatie maakt een analyse met hoge resolutie van genomische interacties met het nucleoskelet mogelijk. Bijgevoegd genoom leidt tot gehybridiseerde fluorescerende signalen die zich in de resterende geëxtraheerde kernen bevinden, terwijl het niet-gehechte genoom zich in de halo van DNA rond de resterende kernen bevindt.

Fluorescentie in situ hybridisatie op DNA-halopreparaten om hele chromosomen, telomeren en genloci te onthullen

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These ...

Dit protocol kan worden gebruikt voor het beoordelen van aanhechtingen aan het nucleoskeleton in plaats van DamID-sequencing te gebruiken, en het is een test met één cel. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze methode is dat het kosteneffectief en gemakkelijk toegankelijk is. Het kan functionele verschillen tussen genen en chromosomen benadrukken die normaal gesproken niet voorkomen met andere visualisatietechnieken.Ruimtelijke en functionele organisaties binnen het genoom in behandelde kanker- en progeriacellen en genomische gedragsverschillen in senescente cellen kunnen met behulp van dit protocol worden beoordeeld. Deze methode kan worden toegepast op elk cel- of weefseltype gedurende de levensduur en van elke ziekte. Het kan ook worden gebruikt in modelorganismen waar sondes beschikbaar zijn.Bereid om te beginnen 500 milliliter 10% zoutzuur voor en giet het in een groot bekerglas. Laat de microscoop afzonderlijk in het zuur glijden en incuber ze gedurende een uur bij kamertemperatuur op een shaker die is ingesteld op twee G.Decanteer het zuur uit het bekerglas en was de dia's 10 keer in kraanwater. Daarna nog eens 10 keer in gedeïoniseerd water.Spoel de glaasjes twee keer in methanol en bewaar ze in methanol tot sterilisatie. Leg de dia's op een papieren handdoek om te drogen en wikkel ze in folie voor sterilisatie in een autoclaaf of hete oven. Kweek cellen in het juiste medium met serum gedurende ten minste 48 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide totdat 60 tot 70% confluentie is bereikt.Oogst elk celtype en tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Zaai één maal 10 tot de vijf cellen in 10 milliliter medium per glaasje. Verwijder de kweekschaal met de dia's en de aangehechte cellen uit de incubator.Gooi het medium weg en label de dia's met een potlood. Doe ze vervolgens in een coplinepot met 50 milliliter ijskoude cytoskeletbuffer. Incubeer de pot gedurende 15 minuten op ijs of bij vier graden Celsius.Gooi de cytoskeletbuffer weg en spoel de glaasjes snel drie keer in 50 milliliter eenmalige DNA-halobuffer door ze in een koppot met de buffer te dopen. Breng de dia's over in een coplinpot met 50 milliliter extractiebuffer en incubeer gedurende vier minuten bij kamertemperatuur. Incubeer vervolgens achtereenvolgens de dia's in 50 milliliter van 10 keer, vijf keer, twee keer en één keer DNA-halobuffer gedurende één minuut elk.Als u klaar bent, dompelt u de dia's door een opeenvolgende ethanolreeks van 10, 30, 70 en 95% ethanol. Neem de dia's door een opeenvolgende 50 milliliter ethanolserie van elk 70, 90 en 100% ethanol gedurende vijf minuten. Droog ze aan de lucht op een verwarmende plaat.Bak vervolgens vijf minuten in een oven van 70 graden Celsius. Denatureer de dia's door ze gedurende twee minuten bij 70 graden Celsius twee keer in 70% formamide te plaatsen. Plaats de gedenatureerde glaasjes vijf minuten in 50 milliliter ijskoude 70% ethanol.Beweeg ze vervolgens door een ethanolreeks van 90, 95 en 100% bij kamertemperatuur gedurende elk vijf minuten. Als u klaar bent, droogt u de dia's aan de lucht op een warmhoudplaat. Denatureer de DNA-sondes bij 75 graden Celsius gedurende 10 minuten in een warm blok of waterbad.Incubeer ze vervolgens gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius voordat je 10 microliter op de juiste dia pipetteert. Bedek de sonde met een coverslip van 21 bij 21 millimeter en sluit deze af met rubbercement. Incubeer de dia's minimaal 18 uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde hybridisatiekamer.Verwijder na de incubatie voorzichtig het rubbercement met een tang. Incubeer vervolgens de dia's in 50 milliliter 50% formamide twee keer SSC-oplossing bij pH zeven die is voorverwarmd tot 45 graden Celsius gedurende drie incubaties van vijf minuten. Plaats vervolgens de dia's in 50 milliliter 0,1 keer SSC-oplossing die is voorverwarmd tot 60 graden Celsius, maar in een waterbad van 45 graden Celsius is geplaatst.Incubeer gedurende vijf minuten en vervang de buffer twee keer voor incubaties van vijf minuten. Plaats de dia's in een coplin pot met 50 milliliter van vier keer SSC-oplossing bij kamertemperatuur en incubeer gedurende 15 minuten met drie veranderingen van buffer. Om niet-specifieke antilichaambinding te voorkomen, brengt u 100 microliter 4% BSA vier keer SSC-oplossing aan op elke dia en bedekt u deze met een stuk paraffinefilm.Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Incubeer vervolgens de dia's met 100 microliter streptavidin Cy3 verdund één op de 200 gedurende één uur bij kamertemperatuur om de gelabelde sonde te detecteren. Plaats de dia's in een coplin pot met 50 milliliter van vier keer SSC-oplossing bij kamertemperatuur en incubeer gedurende 15 minuten met drie veranderingen van buffer.Monteer de dia's in 20 microliter van een montageoplossing met DAPI en overlay met een coverslip van 22 bij 50 millimeter. Visualiseer DNA-halo's en chromosoomgebieden met behulp van een epifluorescentiemicroscoop met een olieobjectief van 100X. DNA-halovoorbereiding maakt het mogelijk om de rand van een restkern te zien, het DNA dat in de restkern achterblijft en het niet-vastgemaakte DNA dat in de omgeving is uitgespoeld.DNA-halo's van prolifererende menselijke dermale fibroblasten werden gemaakt van cellen met opgenomen BRDU en vervolgens gekleurd met anti-BRDU-antilichaam. Prolifererende cellen waren positief voor BRDU en anti-pKi-67. Dit protocol werd gebruikt om chromosoomgebieden binnen DNA-halo's te visualiseren.Individuele chromosomen werden gelabeld met specifieke chromosoomen van de hele arm voor chromosomen 1, 13, 17 en 18. Anti-pKi-67 werd gebruikt om prolifererende cellen en de afwezigheid ervan binnen dezelfde cultuur te markeren. DNA-halopreparaten met telomeren in het groen worden hier getoond.Het is mogelijk om de verhouding van telomeren in de DNA-halo waar te nemen, met name in het experiment twee-afbeelding. Het gemiddelde percentage telomeren was ongeveer 17% in rustige cellen. Verschillen in chromosoomaanhechting werden gedetecteerd in primaire controlefibroblasten en in zieke cellen met typisch en atypisch Hutchinson-Gilford progeriasyndroom, waarbij een andere Sun1-isovorm en geen Lamin A-mutatie tot expressie kwamen.Chromosomen één en 13 vertonen statistisch significante verschillen in hun aanhechting binnen de restkernen in vergelijking met gecontroleerde DNA-halo's. De positie van het hele chromosoomgebied was gecorreleerd aan de restkern en DNA-halo. Wanneer u dit protocol probeert, moet u ervoor zorgen dat cellen met de juiste dichtheid worden gezaaid en op het juiste moment worden geëxtraheerd.Na deze procedure kunnen indirecte immunofluorescentie en RNA FISH worden uitgevoerd.

fluorescence-situ-hybridization-on-dna-halo-preparations-to-reveal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een kwantitatieve methode voor de analyse van chromosoom replicatie timing beschreven. De werkwijze gebruikt BrdU opname in combinatie met...

Chromosoom repliceren Timing In combinatie met TL-<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige detectie van histonmodificaties door immunofluorescentie en DNA-sequenties van DNA FISH gevolgd door 3D microscopie en analyses (3D-immuno DNA FISH).

Gecombineerd Immunofluorescentie en DNA FISH op 3D-bewaarde interfase kernen aan veranderingen in 3D Nuclear Organisatie Studie

Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) maakt de detectie van nucleïnezuren in hun eigen omgeving binnen cellen. We beschrijven hier een protocol voor gecombineerde, gelijktijdige detectie van RNA en DNA door middel van FISH, die kan worden gebruikt om X-chromosoom inactivatie in muis embryonale stamcellen.

Gecombineerde DNA-RNA-TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) aan X-chromosoom inactivatie studeren in Gedifferentieerde vrouwelijke muis embryonale stamcellen

Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het uitvoeren van fluorescentie DNA in situ hybridisatie (DNA ISH) om repetitieve heterochromatische sequenties op op glaasjes gemonteerde chromosomen te visualiseren. De methode vereist minimale reagentia en is veelzijdig voor gebruik met korte of lange sondes, verschillende weefsels en detectie met fluorescentie of niet-fluorescentie gebaseerde signalen.

Eenvoudige methode voor fluorescentie DNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie aan Geplette Chromosomen

We rapporteren een beknopte procedure van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) in de geslachtsklieren en embryo's van Caenorhabditis elegans voor het observeren en kwantificeren van repetitieve sequenties. We hebben met succes twee verschillende repetitieve sequenties waargenomen en gekwantificeerd, telomeer herhalingen en sjabloon van alternatieve verlenging van telomeren (TALT).

Observatie en kwantificering van telomeren en repetitieve sequenties met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) met PNA Probes in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dit manuscript presenteert een gedetailleerde methode voor het genereren van X-chromosoom arm sondes en presterende fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) te onderzoeken van de Braziliaanse deelstaat zus chromatide cohesie in prometaphase en metafase ik gearresteerd  Drosophila eicellen. Dit protocol is geschikt om te bepalen of cohesie Meiotische arm intact of verstoord in verschillende genotypen is.

Met behulp van fluorescentie In Situ hybridisatie (FISH) te controleren van de toestand van Arm cohesie in Prometaphase en metafase ik Drosophila eicellen

Dit protocol illustreert een chemisch geïnduceerd eiwitdimeerisatiesysteem om condensaten op chromatine te maken.  De vorming van promyelocytaire leukemie (PML) nucleair lichaam op telomeren met chemische dimerizers is aangetoond. Druppelgroei, oplossing, lokalisatie en samenstelling worden gemonitord met live cell imaging, immunofluorescentie (IF) en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH).

Chemische dimerisatie-geïnduceerde eiwitcondensaten op telomeren

We rapporteren een DNA-FISH metafaseverspreidingsprotocol dat visueel het aantal locuskopieën en locatie binnen het genoom detecteert. Deze aanpak maakt enkelcelresolutie van amplificatietoestanden mogelijk, specifiek in kankercellijnen die extrachromosomaal DNA bevatten en gebieden homogeen kleuren.

DNA-FISH-metafase verspreidt zich om extrachromosomaal DNA te onderscheiden van homogene kleuringsgebieden in menselijke kankercellijnen

Deze video toont twee-kleuren ganse berg in situ hybridisatie, een methode waarmee de ruimtelijke en temporele expressie patroon van twee verschillende genen kunnen worden gevisualiseerd in jonge kippenembryo's. Deze methode werd oorspronkelijk geïntroduceerd door David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham en David Ish-Horowicz.

Dubbele Hele Mount in situ hybridisatie van het vroege embryo&#39;s Chick

Hele monteren in situ hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. We nemen een propidiumjodide nucleair anti-vlek weefsel organisatie te markeren.

Zebravis hele Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridisatie

Leer fluorescentie in situ hybridisatie op DNA-halopreparaten om chromosoomterritoria en telomeren te visualiseren. Deze kosteneffectieve methode analyseert nucleoskelet-bijlagen in kanker- en progeriacellen.

Fluorescentie in situ hybridisatie op DNA-halopreparaten om hele chromosomen, telomeren en genloci te onthullen

Meer video's verkennen