Name: Etikettering en visualisatie van Mitochondriale genoomexpressieproducten in Baker and apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Leer de etikettering en visualisatie van mitochondriale genoomexpressieproducten in Saccharomyces cerevisiae. Deze methode met radioactieve labeltechnieken en gelelektroforese helpt onderzoekers eiwitbiosynthese te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gefinancierd door de Russische Stichting voor Fundamenteel Onderzoek, subsidienummer 18-29-07002. P.K. werd ondersteund door staatsopdracht van het Ministerie van Wetenschappen en Hoger Onderwijs van de Russische Federatie, subsidienummer AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. werd ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Hoger Onderwijs van de Russische Federatie, subsidienummer 075-15-2019-1659 (Programma van Kurchatov Center of Genome Research). Het werk werd gedeeltelijk gedaan aan de apparatuur die werd gekocht in het kader van het Moscow State University Program of Development. I.C., S.L., en M.V.B. werden bovendien ondersteund door moscow state university grant "Leading Scientific School Noah's Ark".

1. Gistkweekbereiding
<ol><li>Streepgist uit de bevroren stamculturen op verse borden met het juiste medium. Doe de platen 24-48 uur in een kweekincubator bij 30 °C. OPMERKING: Laat de temperatuurgevoelige mutanten groeien bij de toegestane temperatuur.</li>
	<li>Ent gistculturen in 2 ml YPGal medium (2% pepton, 1% gistextract, 2% galactose) uit de verse streep in 15 ml buizen en incubeer ze 's nachts roeren bij 200 tpm bij 30 °C.</li>
	<li>Meet de optische dichtheid van de cultuur bij een golflengte van 600 nm (OD600).</li>
	<li>Neem het volume dat overeenkomt met 0,2 absorptie-eenheden in steriele buizen, pelletgistcellen bij 9.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Was cellen met 0,5 ml steriel water door 5 s te vortexen. Pelletgistcellen bij 9.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Verdun cellen in 2 ml vers YPGal medium.</li>
	<li>Incubeer roeren bij 200 tpm en 30 °C tot OD600 1,5–1,9 waarden bereikt. OPMERKING: De groeipercentages van gist variëren, dus wees voorbereid om te wachten. Het is redelijk om vroeg in de ochtend stappen 1.3-1.6 te maken. Het duurt meestal 4-5 uur, maar kan langer duren.</li>
</ol>2. Radioactieve isotoop-integratie
<ol><li>Breng het kweekvolume gelijk aan één optische eenheid over in een microcentrifugebuis. Draai de buizen 1 minuut op 3.000 x g en gooi de supernatant weg. Was met 0,5 ml steriel water door 5 s te vortexen.<ol>
<li>Pelletgistcellen bij 9.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Resuspend gistcellen in 0,5 ml steriele vertaalbuffer. Plaats de suspensie in een buis van 15 ml. OPMERKING: Vertaalbuffer is een oplossing die 2% galactose (w/v) en 50 mM kaliumfosfaat met pH 6,0 bevat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg cycloheximide toe aan celsuspensie tot een uiteindelijke concentratie van 0,2 mg/ml. Incubeer gedurende 5 minuten roeren bij 200 tpm en 30 °C om cytosolische vertaling te remmen. OPMERKING: Cycloheximide-oplossing (20 mg/ml, in ethanol) moet vóór het experiment vers worden bereid. Chlooramfenicol kan met succes worden vervangen door anisomycine in dezelfde concentratie7.</li>
	<li>Voeg 25–30 μCi 35S-methionine toe aan de celsuspensie en incubeer gedurende 30 minuten roeren bij 200 tpm en 30 °C. OPMERKING: Het mengsel van 35S-methionine en 35S-cysteïne kan ook worden gebruikt. Pure 35S-methionine resulteert in het sterkste signaal en de beste signaal-ruisverhouding. Over het algemeen is methionine effectiever dan cysteïne omdat het gehalte aan dit aminozuur in mitochondriale eiwitten hoger is. Het EasyTag-mengsel van 35S-methionine en cysteïne is echter goedkoper en geeft vergelijkbare resultaten7. LET OP: 35S-methionine is radioactief. Volg de gebruikelijke veiligheidspraktijken voor het omgaan met radioactieve materialen. OPMERKING: Het is algemeen bekend dat de integratie van radioactiviteit een limiet bereikt waardoor het totale signaal in de loop van de tijd afvlakt. Zodra deze limiet is bereikt, is het bijna onmogelijk om de snelheid te bepalen waarmee de verschillende vertaalproducten worden gesynthetiseerd. Om de snelheid van mitochondriale vertaling te analyseren, is het noodzakelijk om in een toestand te verkeren waarin de signaalintensiteit toeneemt met de tijd van incubatie met 35S-methionine op een lineaire manier. Voor gewone wildstammen in het laboratorium is het signaal al verzadigd voor incubatietijden die veel korter zijn dan de 30 minuten. Translationele mutanten kunnen zich heel anders gedragen. Er moet een tijdscursus worden gevolgd om de kinetiek van radioactiviteitsing en dus de vertaalsnelheid vast te stellen, althans bij het werken met een nieuwe stam. Hiervoor raden we aan monsters te nemen met een interval van enkele minuten (bijv. 2,5, 5,0, 7,5, 10 en 20 minuten).</li>
	<li>Voeg ongelabelde "koude" methionine (eindconcentratie moet 20 mM zijn) en puromycine (eindconcentratie moet 1–10 μg/ml zijn) toe om de etikettering te stoppen. Incubeer gedurende 10 minuten roeren bij 200 tpm en 30 °C. OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang om ribosomen de tijd te geven om de peptiden te vertalen. Anders worden alle polypeptiden korter dan de volledige lengte gedetecteerd op een andere grootte. Een tijdcursusexperiment (pulse-chase) kan in deze stap worden gedaan om de stabiliteit van mitochondriale vertaalproducten te bepalen. Ga hiervoor verder met het nemen van incubatiemonsters met een interval van 30 minuten (bijv. 30, 60, 90 en 120 min).</li>
</ol>3. Gistcellyse en extractie van eiwitten
<ol><li>Verzamel gistcellen door centrifugatie bij 9.000 x g gedurende 30 s. Was de cellen met 0,5 ml steriel water door 5 s te vortexen. Pelletgistcellen bij 9.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur. Gooi de supernatant weg. Opmerking. Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Bewaar de monsters bij -20 °C.</li>
	<li>Voeg 75 μL lysisbuffer toe aan de pellet en vortex gedurende 5-10 s. OPMERKING: Lysis buffer is een oplossing van 1,8 M NaOH, 1 M β-mercaptoethanol en 1 mM PMSF in water. Vermijd overmatige incubatie met lysisbuffer die leidt tot alkalische hydrolyse van eiwitten. Ga onmiddellijk verder met stap 3.3.</li>
	<li>Voeg 500 μL van 0,5 M Tris-HCl buffer met pH 6,8 toe. Vortex kort.</li>
</ol>4. Neerslag van eiwitten
LET OP: Methanol en chloroform zijn organische oplosmiddelen. Volg de gebruikelijke veiligheidspraktijken voor het omgaan met organische stoffen.
<ol><li>Voeg 600 μL methanol toe aan het monster. Vortex voor 5 s.</li>
	<li>Voeg 150 μL chloroform toe aan het monster. Vortex voor 5 s.</li>
	<li>Centrifugeer de monsters gedurende 2 minuten bij 12.000 x g. Gooi de bovenste fase voorzichtig weg met een sampler.</li>
	<li>Voeg 600 μL methanol toe aan het monster. Meng voorzichtig door de buis meerdere keren om te keren.</li>
	<li>Centrifugeer de monsters gedurende 2 minuten bij 12.000 x g. Gooi de supernatant weg.</li>
	<li>Droog de pellet 2 minuten aan de lucht bij 80 °C. OPMERKING: Alle vloeistof moet verdampen. Er bestaat een risico op een afwijkende scheiding van eiwitten in de gel als de pellet onvoldoende is gedroogd. Het is echter niet mogelijk om de pellet te drogen, dus het kan zelfs 's nachts bij 4 °C worden bewaard.</li>
	<li>Los neergeslagen eiwitten op in 60 μL 1x Laemmli monsterbuffer.</li>
	<li>Verwarm gedurende 10 min bij 40 °C. OPMERKING: Vermijd het koken van de monsters bij 95 °C, omdat dit aggregatie veroorzaakt. Als de aggregaten zich nog vormen, draait u de monsters gedurende 2 minuten op 12.000 x g en verzamelt u het supernatant. Monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 °C. Het protocol kan hier worden gepauzeerd.</li>
</ol>5. SDS-PAGINA
<ol><li>Giet de 17,5% Laemmli SDS-polyacrylamide gel. OPMERKING: 6 M ureum kan aan de gel worden toegevoegd om betere atp8 en atp9 op te lossen. Gradiënt 15%-20% gels kunnen ook een betere resolutie geven.</li>
	<li>Laad 15 μL (40–50 μg) van elk monster in de zakken. OPMERKING: Het is niet nodig om de eiwitconcentratie te meten als de OD600-waarden in stap 1.6 dicht bij elkaar lagen. Zo niet, meet dan de eiwitconcentraties met behulp van de test met wasmiddelcompatibele reagentia.</li>
	<li>Voer de gel in een koude ruimte uit tot de blauwe kleurstof ongeveer 65% van de gellengte bereikt. OPMERKING: Voor het gebruikte systeem (bijv. Protean II xi-cel) gebruiken we een van de twee modi: 16-17 uur bij 5 V/cm of 5 uur bij 15 V/cm. Geen eiwitten lopen sneller dan de bromophenol blauwe kleurstof, maar lange runs kunnen leiden tot vervaging van atp8- en atp9-signalen.</li>
	<li>Beits de gel met Coomassie briljant blauw en maak een scan of foto, die nodig is als laadcontrole. OPMERKING: Een alternatieve manier om een belastingsregeling te maken is immunoblotting met een antilichaam tegen mitochondriaal "huishouding" gen, bijvoorbeeld porine 1.</li>
</ol>6. Autoradiografie
<ol><li>Droog de gel in een geldroger. Bewaar het 3-5 dagen in de cassette met een opbergfosforscherm. OPMERKING: Een alternatief voor het screenen van de gedroogde gel is de overdracht van eiwitten naar een nitrocellulosemembraan door het daarna te elektrovlekken en te screenen. Het resulteert in sterkere signalen en scherpere banden.</li>
	<li>Scan het scherm op een fosforimager. OPMERKING: Als alternatief voor fosforbeeldvorming kan röntgenfilm ook worden gebruikt om de signalen te onthullen.</li>
</ol>

<ol><li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li>
<li>Park, C. B., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).</li>
<li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+with+6000+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-563 (1996).</li>
<li>Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+translation+products+in+vivo+and+in+organello+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast.</a> Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).</li>
<li>Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+sequence+of+the+mitochondrial+genome+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).</li>
<li>Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+yeast+mitochondrial+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the yeast mitochondrial ribosome.</a> Science. 355 (6324), 528-531 (2017).</li>
<li>Sasarman, F., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioactive+labeling+of+mitochondrial+translation+products+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).</li>
<li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aim-less+translation%3A+loss+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+translation+initiation+factor+mIF3%2FAim23+leads+to+unbalanced+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis.</a> Science Reports. 6, 18749(2016).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Keil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxa1-ribosome+complexes+coordinate+the+assembly+of+cytochrome+c+oxidase+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).</li>
<li>Singhal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coi1+is+a+novel+assembly+factor+of+the+yeast+complex+III-complex+IV+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).</li>
<li>Mick, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coa3+and+Cox14+are+essential+for+negative+feedback+regulation+of+COX1+translation+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).</li>
<li>Bietenhader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+relocation+of+the+mitochondrial+ATP9+gene+to+the+nucleus+reveals+forces+underlying+mitochondrial+genome+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution.</a> PLoS Genetics. 8 (8), e1002876(2012).</li>
<li>Couvillion, M. T., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ribosome+%28mitoribosome%29+profiling+for+monitoring+mitochondrial+translation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).</li>
<li>Suhm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+system+to+monitor+mitochondrial+translation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast.</a> Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Onderzoeken naar genexpressie spelen een centrale rol in de moderne levenswetenschappen. Er zijn tal van methoden ontwikkeld die inzicht geven in dit complexe proces. Hier beschreven we de methode die toegang geeft tot eiwitbiosynthese in bakkersgist S. cerevisiae mitochondriën. Het wordt meestal toegepast om vertaalefficiënties van de mRNA's in mitochondriën van mutante giststam versus wild type te vergelijken om toegang te krijgen tot de gevolgen van de bestudeerde mutatie. Dit is een van de basisexperimenten ...

Mitochondriën zijn de organellen die nauw betrokken zijn bij het metabolisme van een eukaryotische cel. Hun elektronenoverdrachtsketen voorziet de cel van ATP, de belangrijkste energetische valuta die wordt gebruikt in meerdere biochemische paden. Bovendien zijn ze betrokken bij apoptose, vetzuur- en heemsynthese en andere processen. Disfunctie van mitochondriën is een bekende bron van menselijke ziekte1. Het kan het gevolg zijn van mutaties in nucleaire of mitochondriale genen die coderen voor structurele of regulerende componenten van organellen2. Baker's gist Saccharomyces cerevisiae is om verschillende redenen een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van mitochondriale genexpressie. Ten eerste is hun genoom vollediggesequentieerd 3, goed geannoteerd, en een grote som gegevens is al beschikbaar in de literatuur dankzij de lange geschiedenis van onderzoeken uitgevoerd met dit organisme. Ten tweede zijn de manipulaties met hun nucleaire genoom relatief snel en gemakkelijk vanwege hun snelle groeisnelheid en zeer efficiënt homologe recombinatiesysteem. Ten derde is bakkersgist S. cerevisiae een van de weinige organismen waarvoor de manipulaties met mitochondriale genomen zijn ontwikkeld. Ten slotte is bakkersgist een aerobe-anaerobe facultatief organisme, dat isolatie en studie van respiratoire defecte mutanten mogelijk maakt, omdat ze kunnen groeien in media die fermenteerbare koolstofbronnen bevatten.
We beschrijven de methode om mitochondriale genexpressie van bakkersgist S. cerevisiae op translationeel niveau 4 tebestuderen. Het belangrijkste principe komt uit verschillende observaties. Ten eerste codeert het gist mitochondriale genoom slechts acht eiwitten: drie subeenheden van de cytochroom c oxidase (Cox1p, Cox2p, en Cox3p), drie subeenheden van de ATP-synthase (Atp6p, Atp8p en Atp9p), een subeenheid van het ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase-enzym, cytochroom b (Cytb) en mitochondriaal ribosomaal eiwit Var1p5. Dit aantal is klein en ze kunnen allemaal worden gescheiden door elektroforese op een enkele gel in de juiste omstandigheden. Ten tweede behoren mitochondriale ribosomen tot de prokaryotische klasse in plaats van eukaryotisch6, en daarom is de gevoeligheid voor antibiotica anders voor gistcytoplasmatische en mitochondriale ribosomen. Het maakt de remming van cytoplasmatische vertaling met cycloheximide mogelijk, op voorwaarde dat de omstandigheden waarin het gelabelde aminozuur (35S-methionine) alleen in mitochondriale vertaalproducten is opgenomen. Als gevolg hiervan geeft het experiment informatie over de snelheid van aminozuurincorporatie in mitochondriale eiwitten gesynthetiseerd de novo, wat de algehele efficiëntie van mitochondriale vertaling voor elk van de acht producten weerspiegelt

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9099</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriologische agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5306&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Biowave Cell Density Meter CO8000</td><td>BIOCHROM US BE</td><td>80-3000-45</td><td></td></tr><tr><td>BRAND standaard wegwerp cuvettes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z330361</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1988&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5388&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Digitale blok verwarmer</td><td>Thermo Scientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>EasyTag L-[35S]-Methionine, 500&micro;Ci (18.5MBq), Gestabiliseerde waterige oplossing</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG709A500UC</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5425</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-864-457</td><td></td></tr><tr><td>GE Storage Phosphor Screens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE29-0171-33</td><td></td></tr><tr><td>L-methionine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethylethyleendiamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime;-Methylenebisacrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepton van vlees, bacteriologisch</td><td>Millipore</td><td>91249&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fenylmethanesulfonyl fluoride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660nm Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>22662</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi cel</td><td>Bio-Rad</td><td>1651802</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride van Streptomyces alboniger</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Storm 865 fosfor imager</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum verwarmde geldroger</td><td>Cleaver Scientific</td><td>CSL-GDVH</td><td></td></tr><tr><td>Gist extract</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

etikettering en visualisatie van mitochondriale genoomexpressieproducten in baker&apos;s yeast saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondriën zijn essentiële organellen van eukaryotische cellen die in staat zijn tot aërobe ademhaling. Ze bevatten cirkelvormige genoom- en genexpressieapparatuur. Een mitochondriaal genoom van bakkersgist codeert voor acht eiwitten: drie subeenheden van de cytochroom c oxidase (Cox1p, Cox2p, en Cox3p), drie subeenheden van de ATP-synthase (Atp6p, Atp8p en Atp9p), een subeenheid van het ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase-enzym, cytochroom b (Cytb) en mitochondriaal ribosomaal eiwit Var1p. Het doel van de hier beschreven methode is om deze eiwitten specifiek te labelen met 35S methionine, ze te scheiden door elektroforese en de signalen te visualiseren als discrete banden op het scherm. De procedure omvat verschillende stappen. Ten eerste worden gistcellen gekweekt in een galactosebevattend medium totdat ze de late logaritmische groeifase bereiken. Vervolgens blokkeert cycloheximidebehandeling cytoplasmatische vertaling en staat 35S methionine-integratie alleen toe in mitochondriale vertaalproducten. Vervolgens worden alle eiwitten geëxtraheerd uit gistcellen en gescheiden door polyacrylamide gelelektroforese. Ten slotte wordt de gel gedroogd en geïncubeerd met het opslagfosforscherm. Het scherm wordt gescand op een fosforimager die de banden onthult. De methode kan worden toegepast om de biosynthesesnelheid van een enkel polypeptide in de mitochondriën van een mutante giststam te vergelijken met het wilde type, wat nuttig is voor het bestuderen van mitochondriale genexpressiedefecten. Dit protocol geeft waardevolle informatie over de vertaalsnelheid van alle gist mitochondriale mRNA's. Het vereist echter verschillende controles en aanvullende experimenten om goede conclusies te trekken.

Volgens het hierboven beschreven protocol hebben we mitochondriale vertaalproducten toegewezen van twee S. cerevisiae stammen: het wilde type (WT) en een mutante dragende deletie van het AIM23-gen (AIM23Δ), dat codeert voor mitochondriale vertalingsinitiatiefactor 3 (tabel 1)8. Mitochondriale vertaalproducten werden radioactief geëtiketteerd en gescheiden in SDS-PAAG9. De monsters werden elke 2,5 minuut vóór verzadiging verzameld om een tijdscur...

Baker's gist mitochondriaal genoom codeert voor acht polypeptiden. Het doel van het huidige protocol is om ze allemaal te labelen en ze vervolgens als afzonderlijke banden te visualiseren.

Etikettering en visualisatie van Mitochondriale genoomexpressieproducten in Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Mitochondriën zijn essentiële organellen van eukaryotische cellen die in staat zijn tot aerobe ademhaling. Hun disfunctie is een bekende bron van menselijke ziekten. Baker's gist mitochondriën bevat circulair genoom dat codeert voor acht eiwitten.In deze video beschreven we het protocol dat wordt gebruikt om eiwitbiosynthese in gist mitochondriën te analyseren door middel van radioactieve etikettering van translationele producten en daaropvolgende scheiding door gel-elektroforese. De procedure omvat verschillende belangrijke stappen. Streep gist uit bevroren stamculturen op verse borden met geschikt medium.Zet de platen 24 tot 48 uur op 30 graden in de kweekincubator. Ent deze culturen in twee milliliter medium uit de verse streep in een buis van 15 milliliter en incubeer ze 's nachts roeren bij 200 RPM bij 30 graden. Meet de optische dichtheid van de cultuur op de golflengte van 600 nanometer.Neem het volume dat overeenkomt met 0,2 absorptie-eenheden in steriele buizen Palet gistcellen op 9,000 G gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Gooi dit supernatant weg. Was de cellen met 0,5 milliliter steriel water door vijf seconden te vortexen.Pallette gistcellen op 9,000 G gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg. Verdun cellen in twee milliliter vers veeg agar medium.Incubeer de rand bij 200 RPM en 30 graden totdat de optische dichtheid van 1,5 tot 1,9 van 1,5 tot 1,9 waarden bereikt. Breng het kweekvolume gelijk aan één optische eenheid in microcentrifugebuis over. Draai de buizen een minuut op 3000 G.Gooi het supernatant weg. Was de cellen met 0,5 milliliter steriel water door vijf seconden te vortexen. Pallette gistcellen op 9,000 G gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur Gooi het supernatant weg.Schors gistcellen opnieuw in 0,5 milliliter steriele vertaalbuffer. Plaats de ophanging in een buis van 15 milliliter. Voeg cycloheximide toe aan celsuspensie tot de uiteindelijke concentratie van 0,2 milligram per milliliter Incubeer gedurende vijf minuten rand genomen bij 200 RPM en 30 graden om cytosolische vertaling te remmen.Voeg van 25 tot 30 Voeg van 25 tot 30 microcurie S35 methionine van S35 methionine toe aan celsuspensie en incubeer gedurende 30 minuten bij 200 RPM en 30 graden. Voeg ongelabelde koude methionine en borymycine toe om de etikettering te stoppen Incubeer gedurende 10 minuten rand genomen bij 200 RPM en 30 graden. Verzamel gistcellen door centrifugeren bij 9.000 G gedurende 30 seconden.Was de cellen met 0,5 milliliter steriel water door vijf seconden te vortexen. Pallette gistcellen op 9,000 G gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg.Voeg 75 microliters lysisbuffer toe aan het palet en vortex gedurende vijf tot 10 seconden. Voeg 500 microliters van 0,5 molaire tris buffer van 0,5 molaire tris buffer met pH 6,8 toe. Met een pH van 6,8.Vortex kort. Voeg 600 microliter methanol toe aan het monster. Vortex gedurende vijf seconden.Voeg 150 microliter chloroform toe aan het monster. Vortex gedurende vijf seconden. Centrifugeer de monsters gedurende twee minuten op 12,000 G.Gooi opaface voorzichtig weg met een sampler.Voeg 600 microliter methanol toe aan het monster. Meng voorzichtig door de buis meerdere keren om te keren. Centrifugeer monsters gedurende twee minuten op 12,000 G.Discard supernatant.Droog de pallette twee minuten aan de lucht op 80 graden. Los neergeslagen eiwitten op in 60 microliters Laemmli-monsterbuffer. Verwarm de monsters gedurende 10 minuten op 14 graden.Oorzaak van de 17,5%Laemmli SDS polyacrylamide gel. Steek 15 microliters van elk monster in de zakken. Voer de gel in de koude kamer totdat de blauwe kleurstof ongeveer 65% van de gellymfe bereikt.Beits de gel met Kumasi briljant blauw en maak een scan of foto die nodig is als laadcontrole. Droog de gel in de geldroger. Bewaar het drie tot vijf dagen in de cassette met opslagfosforscherm.Scan het scherm op phosphor imager. Volgens het hierboven beschreven protocol hebben we mitochondriale vertaalproducten toegewezen van twee Saccharomyces cerevisiae stammen. Het wilde type en de mutante variant deletie van het Aim23 gen dat codeert voor mitochondriale vertaling initiatie factor drie.Mitochondriale vertaalproducten werden al actief geëtiketteerd en gescheiden in de denatureren polyacrylamide gel. De monsters werden om de twee en een halve minuut voor verzadiging verzameld om de tijdsverloop op te bouwen. De gel werd bevlekt, gedroogd en gescreend na de vijfdaagse expositie.In het geval van een succesvol experiment toont het beeld acht banden die zijn toegewezen volgens het standaardpatroon. De intensiteiten van individuele banden kunnen echter zeer variabel zijn, afhankelijk van de stam en experimentele omstandigheden. Elke band komt overeen met één vertaalproduct.De gegevens suggereren dat de mutante stam in staat is tot mitochondriale eiwitsynthese omdat alle producten die in het wilde type verschijnen zichtbaar zijn in deze mutant. De intensiteiten van de banden verschillen echter van het wilde type, wat betekent dat deze deletie van Aim23 de mitochondriale genexpressie beïnvloedt. Kumasi gebrouwen in blauwe vlek en dient als laadcontrole.Hun resultaat in gegevens kan worden gekwantificeerd om verschillen tussen stammen of experimentele omstandigheden te identificeren met behulp van Image G- of Image Quan-software. Hiervoor wordt de verhouding van het signaal dat overeenkomt met elk product berekend op het totale signaal. Gemiddelde waarden en standaardafwijkingen worden berekend in ten minste drie onafhankelijke experimenten.De kinetiek van gesynthetiseerd eiwit wordt bestudeerd in een experiment van het afgelopen jaar. Monsters worden verzameld op de aangegeven tijdstippen nadat de etiketteringsreactie is gestopt door koude methionine en borymycine. Deze controle is nodig om de stabiliteit van het product te schatten.Immuno-kleuring met Anti-Porine één antilichamen is een ladingscontrole. We beschreven de methode, die vaak wordt gebruikt om eiwitbiosynthese in gist mitochondriën te bestuderen. Dit protocol is relatief eenvoudig en snel uit te voeren.Tegelijkertijd maakt het het mogelijk om waardevolle informatie te krijgen over de vertaalsnelheid van vier gist mitochondriale mRNAs, wat zeer voordelig is. Het heeft echter verschillende beperkingen die aanvullende experimenten vereisen en ligt in deze interstatelijke niveaus van eiwitten en mRNAs. Het kan de informatie over deze functies in mitochondriaal vertaalsysteem verstrekken, maar meer geavanceerde technieken moeten worden gebruikt om het mechanisme te ontdekken.

labelling-visualization-mitochondrial-genome-expression-products

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

GFP-fusie-eiwitten worden op grote schaal gebruikt om de organellen visualiseren door confocale microscopie. Echter, screening voor mutaties die de morfologie van organellen invloed vereist in het algemeen individueel mutagenese en is tijdrovend. Hier tonen we een methode om simultaan te nemen organel-GFP markers in bijna 5.000 niet-essentiële genen in gist.

Een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in S. cerevisiae

Microarray analyse voor Saccharomyces cerevisiae</em

Een robuuste benadering van de levering van organellen monitor aan op de zure lumen van de gist vacuole voor afbraak en recycling wordt beschreven. De methode is gebaseerd op de specifieke etikettering van target organellen met een genetisch gecodeerd dual-emissie fluorescentie pH-biosensor, en visualisatie van individuele cellen met behulp van fluorescentie microscopie.

Een fluorescentie microscopie Assay voor de bewaking Mitophagy in de Gist Saccharomyces cerevisiae

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor het uitvoeren...

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Twee aanvullende methoden op basis van flowcytometrie en microscopie gepresenteerd die de kwantificering van de enkele cel, de dynamiek van genexpressie geïnduceerd door de activering van MAPK route in gist mogelijk.

Temporele Kwantificering van MAPK geïnduceerde expressie in Single gistcellen

Het protocol hier beschreven is gebaseerd op het genoom-brede kwantificeren van nieuw samengestelde mRNA gezuiverd van gistcellen aangeduid met 4-thiouracil. Deze methode maakt het mogelijk om het meten van de mRNA-synthese rekken van mRNA verval en biedt dus een nauwkeurige meting van RNA polymerase II transcriptie.

Saccharomyces cerevisiae Metabole labelen met 4-thiouracil en de kwantificering van gesynthetiseerd mRNA nieuw als een Proxy voor RNA Polymerase II activiteit

Het protocol beschrijft specifieke etikettering van mitochondriale nucleoïden met een commercieel verkrijgbare DNA-gel vlek, verwerving van time lapse-serie van live gelabelde cellen door super-resolutie gestructureerde verlichting microscopie (SR-SIM), en automatische tracking van nucleoïde beweging.

Specifieke etikettering van Mitochondriale nucleoïden voor time-lapse Structured Illumination Microscopie

Ondanks recente vooruitgang blijven veel mitochondriale gisteiwitten nog steeds met hun functies volledig onbekend. Dit protocol biedt een eenvoudige en betrouwbare methode om de submitchondriale lokalisatie van eiwitten te bepalen, wat fundamenteel is geweest voor de opheldering van hun moleculaire functies.

Beoordeling van submitchondrial protein localization in ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae

Waterstofperoxide (H2O2) is zowel een bron van oxidatieve schade als een signaalmolecuul. Dit protocol beschrijft hoe mitochondriale H 2 O2kan worden gemeten met behulp van mitochondriën-gerichte HyPer7 (mtHyPer7), een genetisch gecodeerde ratiometrische biosensor, in levende gist. Het beschrijft hoe beeldvormingsomstandigheden kunnen worden geoptimaliseerd en kwantitatieve cellulaire en subcellulaire analyses kunnen worden uitgevoerd met behulp van vrij beschikbare software.

Beeldvorming van mtHyPer7, een ratiometrische biosensor voor mitochondriaal peroxide, in levende gistcellen

Dit werk legt uit hoe gistmitochondriën kunnen worden getransformeerd met behulp van een biolistische methode. We laten ook zien hoe de transformanten kunnen worden geselecteerd en gezuiverd en hoe de gewenste mutatie in de doelpositie binnen het mitochondriale genoom kan worden geïntroduceerd.

Mitochondriale transformatie bij Baker

Leer de etikettering en visualisatie van mitochondriale genoomexpressieproducten in Saccharomyces cerevisiae. Deze methode met radioactieve labeltechnieken en gelelektroforese helpt onderzoekers eiwitbiosynthese te bestuderen.

Etikettering en visualisatie van Mitochondriale genoomexpressieproducten in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Meer video's verkennen