Etikettering en visualisatie van Mitochondriale genoomexpressieproducten in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondriën zijn essentiële organellen van eukaryotische cellen die in staat zijn tot aerobe ademhaling. Hun disfunctie is een bekende bron van menselijke ziekten. Baker's gist mitochondriën bevat circulair genoom dat codeert voor acht eiwitten.

In deze video beschreven we het protocol dat wordt gebruikt om eiwitbiosynthese in gist mitochondriën te analyseren door middel van radioactieve etikettering van translationele producten en daaropvolgende scheiding door gel-elektroforese. De procedure omvat verschillende belangrijke stappen. Streep gist uit bevroren stamculturen op verse borden met geschikt medium.

Zet de platen 24 tot 48 uur op 30 graden in de kweekincubator. Ent deze culturen in twee milliliter medium uit de verse streep in een buis van 15 milliliter en incubeer ze 's nachts roeren bij 200 RPM bij 30 graden. Meet de optische dichtheid van de cultuur op de golflengte van 600 nanometer.

Neem het volume dat overeenkomt met 0,2 absorptie-eenheden in steriele buizen Palet gistcellen op 9,000 G gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Gooi dit supernatant weg. Was de cellen met 0,5 milliliter steriel water door vijf seconden te vortexen.

Pallette gistcellen op 9,000 G gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg. Verdun cellen in twee milliliter vers veeg agar medium.

Incubeer de rand bij 200 RPM en 30 graden totdat de optische dichtheid van 1,5 tot 1,9 van 1,5 tot 1,9 waarden bereikt. Breng het kweekvolume gelijk aan één optische eenheid in microcentrifugebuis over. Draai de buizen een minuut op 3000 G.

Gooi het supernatant weg. Was de cellen met 0,5 milliliter steriel water door vijf seconden te vortexen. Pallette gistcellen op 9,000 G gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur Gooi het supernatant weg.

Schors gistcellen opnieuw in 0,5 milliliter steriele vertaalbuffer. Plaats de ophanging in een buis van 15 milliliter. Voeg cycloheximide toe aan celsuspensie tot de uiteindelijke concentratie van 0,2 milligram per milliliter Incubeer gedurende vijf minuten rand genomen bij 200 RPM en 30 graden om cytosolische vertaling te remmen.

Voeg van 25 tot 30 Voeg van 25 tot 30 microcurie S35 methionine van S35 methionine toe aan celsuspensie en incubeer gedurende 30 minuten bij 200 RPM en 30 graden. Voeg ongelabelde koude methionine en borymycine toe om de etikettering te stoppen Incubeer gedurende 10 minuten rand genomen bij 200 RPM en 30 graden. Verzamel gistcellen door centrifugeren bij 9.000 G gedurende 30 seconden.

Was de cellen met 0,5 milliliter steriel water door vijf seconden te vortexen. Pallette gistcellen op 9,000 G gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg.

Voeg 75 microliters lysisbuffer toe aan het palet en vortex gedurende vijf tot 10 seconden. Voeg 500 microliters van 0,5 molaire tris buffer van 0,5 molaire tris buffer met pH 6,8 toe. Met een pH van 6,8.

Vortex kort. Voeg 600 microliter methanol toe aan het monster. Vortex gedurende vijf seconden.

Voeg 150 microliter chloroform toe aan het monster. Vortex gedurende vijf seconden. Centrifugeer de monsters gedurende twee minuten op 12,000 G.Gooi opaface voorzichtig weg met een sampler.

Voeg 600 microliter methanol toe aan het monster. Meng voorzichtig door de buis meerdere keren om te keren. Centrifugeer monsters gedurende twee minuten op 12,000 G.Discard supernatant.

Droog de pallette twee minuten aan de lucht op 80 graden. Los neergeslagen eiwitten op in 60 microliters Laemmli-monsterbuffer. Verwarm de monsters gedurende 10 minuten op 14 graden.

Oorzaak van de 17,5%Laemmli SDS polyacrylamide gel. Steek 15 microliters van elk monster in de zakken. Voer de gel in de koude kamer totdat de blauwe kleurstof ongeveer 65% van de gellymfe bereikt.

Beits de gel met Kumasi briljant blauw en maak een scan of foto die nodig is als laadcontrole. Droog de gel in de geldroger. Bewaar het drie tot vijf dagen in de cassette met opslagfosforscherm.

Scan het scherm op phosphor imager. Volgens het hierboven beschreven protocol hebben we mitochondriale vertaalproducten toegewezen van twee Saccharomyces cerevisiae stammen. Het wilde type en de mutante variant deletie van het Aim23 gen dat codeert voor mitochondriale vertaling initiatie factor drie.

Mitochondriale vertaalproducten werden al actief geëtiketteerd en gescheiden in de denatureren polyacrylamide gel. De monsters werden om de twee en een halve minuut voor verzadiging verzameld om de tijdsverloop op te bouwen. De gel werd bevlekt, gedroogd en gescreend na de vijfdaagse expositie.

In het geval van een succesvol experiment toont het beeld acht banden die zijn toegewezen volgens het standaardpatroon. De intensiteiten van individuele banden kunnen echter zeer variabel zijn, afhankelijk van de stam en experimentele omstandigheden. Elke band komt overeen met één vertaalproduct.

De gegevens suggereren dat de mutante stam in staat is tot mitochondriale eiwitsynthese omdat alle producten die in het wilde type verschijnen zichtbaar zijn in deze mutant. De intensiteiten van de banden verschillen echter van het wilde type, wat betekent dat deze deletie van Aim23 de mitochondriale genexpressie beïnvloedt. Kumasi gebrouwen in blauwe vlek en dient als laadcontrole.

Hun resultaat in gegevens kan worden gekwantificeerd om verschillen tussen stammen of experimentele omstandigheden te identificeren met behulp van Image G- of Image Quan-software. Hiervoor wordt de verhouding van het signaal dat overeenkomt met elk product berekend op het totale signaal. Gemiddelde waarden en standaardafwijkingen worden berekend in ten minste drie onafhankelijke experimenten.

De kinetiek van gesynthetiseerd eiwit wordt bestudeerd in een experiment van het afgelopen jaar. Monsters worden verzameld op de aangegeven tijdstippen nadat de etiketteringsreactie is gestopt door koude methionine en borymycine. Deze controle is nodig om de stabiliteit van het product te schatten.

Immuno-kleuring met Anti-Porine één antilichamen is een ladingscontrole. We beschreven de methode, die vaak wordt gebruikt om eiwitbiosynthese in gist mitochondriën te bestuderen. Dit protocol is relatief eenvoudig en snel uit te voeren.

Tegelijkertijd maakt het het mogelijk om waardevolle informatie te krijgen over de vertaalsnelheid van vier gist mitochondriale mRNAs, wat zeer voordelig is. Het heeft echter verschillende beperkingen die aanvullende experimenten vereisen en ligt in deze interstatelijke niveaus van eiwitten en mRNAs. Het kan de informatie over deze functies in mitochondriaal vertaalsysteem verstrekken, maar meer geavanceerde technieken moeten worden gebruikt om het mechanisme te ontdekken.