Immunofluorescentie gebruiken om PM2.5-geïnduceerdeDNA-schade in zebravisembryoharten te detecteren
15 februari 2021
Dit protocol maakt gebruik van een immunofluorescentietest om PM2,5-geïnduceerdeDNA-schade in de ontlede harten van zebravisembryo's te detecteren.
Deze methode kan worden gebruikt om de expressie van doeleiwitten in het hart van de zebravis nauwkeurig en gemakkelijk te detecteren. De verandering in het doeleiwit wordt direct gedetecteerd door immunofluorescentie te meten. Voer het verzamelen en behandelen van zebravisembryo's uit, zoals beschreven in het tekstmanuscript.
Breng 72 uur na de bevruchting de embryo's over in glazen dia's en observeer ze onder een stereomicroscoop. Registreer hartmisvormingen, zoals pericardiaal oedeem, veranderde looping en verminderde grootte. Bereken misvormingspercentages en analyseer verschillen tussen groepen met behulp van ANOVA op één manier, gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Turkije.
Na het verdoven van de embryo's met 0,6 milligram per milliliter MS222, registreert u hartslagen gedurende 30 seconden en kwantificeert u de hartslag met behulp van Image J-software. Ontleed harten van de embryo's van de zebravis zorgvuldig met een wegwerpspuitnaald onder een stereomicroscoop. Gebruik een hydrofobe barrièrepen om een cirkel te tekenen op een schone glazen dia.
Voeg 50 microliter 4% paraformaldehyde toe aan 1,25 microliter PBS om een fixatieve oplossing te maken, plaats vervolgens drie ontlede harten in één hydrofobe barrièrecirkel en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Decanteer de oplossing onder de microscoop en droog de monsters gedurende ten minste vijf minuten bij kamertemperatuur. Was de dia's driemaal in PBST gedurende vijf minuten per wasbeurt.
Voeg 50 microliter BSA toe aan 1.000 microliter PBST om een 5% BSA-oplossing te verkrijgen en incubeer de dia's gedurende een uur in een vochtige kamer om niet-specifieke antilichaambinding te blokkeren. Decanteer de oplossing en was de monsters driemaal met PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt. Verdun twee microliter monoklonaal antilichaam van muizen tegen 8-hydroxydeoxyguanosine en twee microliter konijnenpolyklonaal antilichaam tegen gamma-H2AX in 296 microliter PBST om een werkende primaire antilichaamcocktailoplossing te verkrijgen.
Incubeer de hartmonsters met 50 microliter van de primaire antilichaamcocktailoplossing in een bevochtigde kamer gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij vier graden Celsius. Decanteer de oplossing en was de monsters driemaal met PBST gedurende vijf minuten per wasbeurt. Verdun één microliter FITC-gelabeld geit anti-muis secundair antilichaam en één microliter psy-3 geiten anti-konijn secundair antilichaam in 500 microliter PBST om een werkende secundaire antilichaam cocktail oplossing te verkrijgen.
Incubeer de monsters met de secundaire antilichamen gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker. Decanteer de oplossing en was de monsters driemaal met PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt. Voeg 20 microliter DAPI toe aan de monsters voor nucleaire kleuring en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
Breng een afdekslip aan op de dia en sluit deze af met nagellak om uitdroging en beweging te voorkomen. Stel de monsters in beeld onder een fluorescentiemicroscoop en kwantificeer het fluorescerende signaal van het hartgebied met behulp van ImageJ-software. Bereken de relatieve veranderingen met behulp van het gemiddelde van de DMSO-controlemonsters en bepaal de statistische significantie van de gegevens.
Embryo's blootgesteld aan PM 2,5 in afwezigheid of aanwezigheid van de antioxidant, N-acetyl-L-cysteïne, of NAC, werden geëvalueerd op de aanwezigheid van hartmisvormingen. EOM vanaf PM 2,5 kostte een significante toename van cardiale teratogenese, zoals pericardoedeem, veranderde looping en verminderde grootte, in vergelijking met met DMSO-controle behandelde harten. De hartslag was ook significant verlaagd bij embryo's die werden blootgesteld aan EOM.
Toevoeging van NAC verzwakte EOM-geïnduceerde hartafwijkingen. Een immunofluorescentietest werd gebruikt om de mate van DNA-schade in met EOM behandelde weefsels te evalueren. De niveaus van 8-hydroxydeoxyguanosine en gamma-H2AX-expressie waren significant verhoogd in de harten van zebravisembryo's behandeld met EOM, wat wijst op een toename van oxidatieve DNA-schade en DNA-dubbelstrengsbreuken, respectievelijk.
De door EOM geïnduceerde DNA-schade werd gedeeltelijk tegengegaan door NAC-suppletie. Let bij het proberen van dit protocol op bij het wassen van de monsters met PBS, omdat het hart van de zebravis van de dia kan afbladderen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol maakt gebruik van een immunofluorescentie-assay om PM 2.5-geïnduceerde DNA-schade aan te tonen in de gedissecteerde harten van zebravissenembryo's. De methode maakt een nauwkeurige detectie van de expressie van het doeleiwit in het hart van de zebravis mogelijk.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Toxicologie
Achtergrond
- Immunofluorescentie is een krachtige techniek voor het visualiseren van eiwitexpressie.
- Zebravisembryo's zijn een waardevol model voor het bestuderen van ontwikkelingsprocessen.
- Blootstelling aan PM 2.5 staat erom bekend diverse gezondheidsproblemen te veroorzaken, waaronder DNA-schade.
- Het begrijpen van de effecten van omgevingsgifstoffen op de ontwikkeling is cruciaal voor de volksgezondheid.
Doel van de studie
- Om de impact van PM 2.5 op de DNA-integriteit in harten van zebravissen te beoordelen.
- Om immunofluorescentie te gebruiken voor het detecteren van veranderingen in eiwitexpressie.
- Om een betrouwbare methode vast te stellen voor het evalueren van hartmisvormingen in zebravissenembryo's.
Gebruikte methoden
- Verzameling en behandeling van zebravisembryo's.
- Immunofluorescentie-assay voor de detectie van doeleiwitten.
- Observatie van embryo's onder een stereomicroscoop 72 uur na bevruchting.
- Statistische analyse met behulp van een eenweg-ANOVA en de Tukey-test voor meervoudige vergelijkingen.
Belangrijkste resultaten
- Detectie van DNA-schade in harten van zebravis als gevolg van blootstelling aan PM 2.5.
- Identificatie van hartmisvormingen zoals pericardiaal oedeem en afwijkige looping.
- Kwantificering van de percentages misvormingen over verschillende behandelingsgroepen.
- Statistische significantie van de bevindingen bevestigd via analyse.
Conclusies
- Blootstelling aan PM 2.5 leidt tot aanzienlijke DNA-schade in de harten van zebravissen.
- De immunofluorescentie-assay is effectief voor het bestuderen van veranderingen in de eiwitexpressie.
- Dit model kan worden gebruikt voor verder onderzoek naar milieutoxinen en ontwikkelingsbiologie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit immunofluorescentieprotocol maakt mechanische risicoreductie van milieutoxische stoffen mogelijk door DNA-schadebiomarkers te kwantificeren in de harten van zebravisembryo's, een voorspellend model voor ontwikkelingscardiotoxiciteit. De assay ondersteunt workflows voor targetvalidatie en fenotypische screening door PM2.5-blootstelling te koppelen aan oxidatieve stress en pathways van DNA-dubbelstrengsbreuken. Het levert translationele biomarkergegevens voor risicobeoordeling in vroege discovery-fasen, wat helpt bij de prioritering van chemische bibliotheken in de portfolio.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door 8-OHdG en γH2AX te detecteren als mechanistische uitkomaten voor oxidatieve DNA-schade en dubbelstrengsbreuken.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk via kwantitatieve immunofluorescentie-metingen die de activering van signaalpaden in hartweefsel verduidelijken.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het vertrouwen in het target door PM2.5-geïnduceerde biomarkerwijzigingen te correleren met fenotypes van hartmisvormingen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerd zebravishartweefsel voor op downstream screening van genotoxische verbindingen met behulp van immunofluorescentie-gebaseerde detectie van eiwitexpressie.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare kwantitatieve resultaten via ImageJ-analyse van fluorescentiesignalen in gedisseceerde harten.
- Schaalbaarheidswaarde: Maakt hergebruik van het platform mogelijk voor het beoordelen van door chemische omgevingsfactoren geïnduceerde veranderingen in eiwitexpressie in een ziekterelevant systeem.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Demonstreert de relevantie voor ziekten door DNA-schade te detecteren in de harten van zebravissenembryo's, een model met geconserveerde cardiale ontwikkelingspaden.
- Operationele waarde: Waarborgt translationele continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door mechanistisch inzicht te verschaffen in PM2.5-geïnduceerde cardiotoxiciteit.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Informeert go/no-go-beslissingen door de attenuatie van DNA-schade via co-behandeling met antioxidanten (bijv. NAC) te kwantificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van target-validatie tot lead-identificatie en biedt mechanistische resultaten die het voorspellend vertrouwen in screeningscampagnes in een vroeg stadium ondersteunen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen en het verduidelijken van pathways door DNA-schadebiomarkers te kwantificeren als reactie op blootstelling aan milieutoxicanten.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid en kwantitatieve output via gestandaardiseerde immunofluorescentiekleuring en ImageJ-gebaseerde fluorescentiekwantificatie in zebravisharten.
- Analytics: Genereert statistische output (bijv. relatieve fluorescentieveranderingen, ANOVA-afgeleide significantie) die vergelijking tussen condities en hit-validatie mogelijk maakt.
- Translationeel Onderzoek: Legt een verbinding met preklinische continuïteit door gebruik te maken van een zebravismodel met ontwikkelingspaden die relevant zijn voor de beoordeling van cardiotoxiciteit bij mensen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor het screenen van diverse chemische bibliotheken op genotoxisch potentieel in een gewerveld hartmodel.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende zekerheid door mechanistische risicoreductie van DNA-schadepaden bij screening op ontwikkelingstoxiciteit.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid via vaste protocollen voor dissectie, kleuring en beeldvorming met gebruik van hydrofobe barrières en fluorescentiemicroscopie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door biomarkerwijzigingen te koppelen aan fenotypische uitkomsten, waardoor het biologische risico in een laat stadium in toxicologieprogramma's wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van het DNA-schadepotentieel in een model van een ontwikkelend hart.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de omgang met zebravissenembryo's, hartdissectie en immunofluorescentietechnieken.
- Afhankelijk van fluorescentiemicroscopie en ImageJ-software voor signalkwantificering en statistische analyse.
- Vereist standaardisatie tussen teams wat betreft de timing van de dissectie, antilichaamincubatie en wasprocedures om weefselverlies te voorkomen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het uitbreiden van de assay naar andere weefsels van de zebravissen of ziektemodellen.
- Omvat praktische beperkingen zoals het loslaten van hartweefsel tijdens het wassen, wat een zorgvuldige omgang met PBS vereist zoals vermeld in het bronmateriaal.
