Name: Immunofluorescentie gebruiken om PM2.5-geïnduceerdeDNA-schade in zebravisembryoharten te detecteren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Leer immunofluorescentie toepassen om DNA-schade door PM 2.5 in zebravisembryoharten te detecteren. Deze methode maakt nauwkeurige kwantificering van eiwitexpressie en hartafwijkingen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Nature Sciences Foundation of China (subsidienummer: 81870239, 81741005, 81972999) en The Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.

Wild type zebravissen (AB) die in deze studie werden gebruikt, werden verkregen van het National Zebrafish Resource Center in Wuhan, China. Alle dierprocedures die hier worden beschreven, zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Care Institution van de ethische commissie van Soochow University.
1. PM2,5-bemonstering en extractie van organische verbindingen
OPMERKING: PM2.5 werd verzameld in een stedelijk gebied in Suzhou, China, 1-7 augustus 2015, zoals eerder beschreven5.
<ol><li>Bak 47 mm kwartsmembraanfilters gedurende 2 uur in een 500 °C dempingsoven om de organische componenten te verwijderen.</li>
	<li>Plaats een filter in een PM2.5 sampler voor 24 uur ononderbroken bemonstering.</li>
	<li>Verwijder het filter en droog gedurende 24 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Kwantificeer het filter met een analytische balans.</li>
	<li>Extraheer organische componenten uit het filter door Soxhlet-extractie met dichloormethaan als oplosmiddel19.</li>
	<li>Droog de EOM door een roterende verdamping in een waterbad van 60 °C en stikstofstroom. Los EOM op in DMSO en bewaar bij -20 °C.</li>
</ol>2. Embryoverzameling en behandeling van zebravissen
<ol><li>Houd de zebravis op 28,5 ± 0,5 °C in een recircerend aquacultuursysteem met een 14 uur lichte en 10 uur donkere fotoperiodecyclus.</li>
	<li>Plaats gezonde volwassen zebravissen in een aquarium met een verhouding van 2: 1 tussen mannen en vrouwen.</li>
	<li>Verzamel de volgende dag de embryo's en was ze met systeemwater (d.w.z. zebravisbroedwater).</li>
	<li>Selecteer en verdeel willekeurig zebravisembryo's die een normale ontwikkeling vertonen (uniforme grootte, volle korrels en geen eiercoagulatie) in 4 groepen in individuele glazen petrischalen met een diameter van 7 cm (ongeveer 50 embryo's per schotel).</li>
	<li>Behandel de embryo's met PM2,5 (5 mg/L) in aanwezigheid of afwezigheid van NAC bij 0,25 μM van 2 hpf tot 72 hpf. Gebruik DMSO als voertuigbesturing tot een eindconcentratie van 0,1% (v/v).</li>
</ol>3. Morfologische observatie van zebravisembryo's en hartdissectie
<ol><li>Breng bij 72 hpf embryo's over in glazen dia's en observeer onder een stereomicroscoop. Registreer hartmisvormingen, zoals pericardoedeem, veranderde looping en verminderde grootte.</li>
	<li>Bereken misvormingspercentages (het percentage embryo's met hartafwijkingen van de totale levende embryo's) en analyseer verschillen tussen groepen met behulp van eenrichtings-ANOVA gevolgd door de Meervoudige Vergelijkingstest van Turkije (p < 0,05 = statistisch significant).</li>
	<li>Verdoof de embryo's met 0,6 mg / ml MS-222 om ze op glazen dia's te immobiliseren.</li>
	<li>Neem hartslagen op gedurende 30 s en kwantificeer hartslagen met behulp van ImageJ-software5,20.</li>
	<li>Ontleed harten van zebravisembryo's met een wegwerpspuitnaald onder een stereomicroscoop. Let op: Vermijd het vernietigen van de hartvorm.</li>
</ol>4. Immunofluorescentietest
<ol><li>Om een immunofluorescentietest te gebruiken om PM2.5 geïnduceerde DNA-schade in het hart van zebravisembryo's te detecteren, gebruikt u een hydrofobe barrièrepen om een cirkel aan een schone glazen kant te tekenen.</li>
	<li>Voeg 50 μL 4% paraformaldehyde toe aan 1,25 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om een fixatieve oplossing te maken.</li>
	<li>Plaats 3 ontleedde harten in een hydrofobe barrièrepencirkel en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Decanteer de oplossing onder de microscoop en droog de monsters bij kamertemperatuur gedurende ten minste 5 minuten, zodat de harten volledig aan de glasdia's hechten.</li>
	<li>Was de dia's driemaal in PBS met 0,1% Tween 20 (PBST) gedurende 5 minuten per wasbeurt.</li>
	<li>Voeg 50 μL runderserumalbumine (BSA) toe aan 1000 μL PBST om een 5% BSA-oplossing te verkrijgen en incubeer de dia's gedurende 1 uur in een vochtige kamer om niet-specifieke antilichaambinding te blokkeren.</li>
	<li>Decanteer de oplossing en was de monsters driemaal met PBST gedurende 5 minuten per wasbeurt.</li>
	<li>Verdun 2 μL monoklonaal antilichaam van muizen tegen 8-OHdG en 2 μL konijnpolyklonaal antilichaam tegen γH2AX in 296 μL PBST om een werkende primaire antilichaamcocktailoplossing te verkrijgen.</li>
	<li>Incubeer de hartmonsters met 50 μL van de primaire antilichaamcocktailoplossing tegen 8-OHdG en γH2AX in een bevochtigde kamer gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C (nachtelijke incubatie kan de signaalintensiteit verhogen).</li>
	<li>Decanteer de oplossing en was de monsters driemaal met PBST gedurende 5 minuten per wasbeurt.</li>
	<li>Verdun 1 μL FITC-gelabeld geitenantimuisantilichaam en 1 μL cy3 geitenantia-antikonijn in 498 μL PBST om een werkende secundaire antilichaamcocktailoplossing te verkrijgen en incubateer de monsters met de secundaire antilichamen (1:500 in PBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.</li>
	<li>Decanteer de oplossing en was de monsters driemaal met PBS gedurende 5 minuten per wasbeurt beschermd tegen licht.</li>
	<li>Voeg 20 μL DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindool) toe aan de monsters voor nucleaire kleuring gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Breng een coverslip aan om te schuiven en af te sluiten met nagellak om uitdroging en beweging te voorkomen. Stel vervolgens de monsters in beeld onder een fluorescentiemicroscoop en kwantificeer het fluorescentiesignaal van het hartgebied met behulp van ImageJ-software. Bereken de relatieve veranderingen met het gemiddelde van dmso-controlemonsters. Bepaal de statistische significantie van de gegevens zoals in stap 3.2.</li>
</ol>

<ol><li>WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/">http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/</a> (2018).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Exposure+to+Air+Pollution+and+Risk+of+Congenital+Heart+Defects%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects.</a> European Journal of Pediatrics. 175, 1520(2016).</li>
<li>Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+exposure+to+PM2.5+and+Congenital+Heart+Diseases+in+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan.</a> The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).</li>
<li>Mesquita, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+assessment+of+urban+atmospheric+particle-bound+PAHs%3A+relevance+of+composition+and+particle+size+in+Barcelona+%28Spain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain).</a> Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+AhR+and+wnt%2Fbeta-catenin+signal+pathways+in+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-organ+toxicity+induced+by+fine+particulate+matter+PM2.5+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+model%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model.</a> Chemosphere. 180, 24-32 (2017).</li>
<li>Lorda-Diez, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+senescence%2C+apoptosis+and+DNA+damage+cooperate+in+the+remodeling+processes+accounting+for+heart+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis.</a> Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).</li>
<li>Kouassi, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+induced+in+A549+cells+by+physically+and+chemically+characterized+air+particulate+matter+%28PM2.5%29+collected+in+Abidjan%2C+Cote+d%27Ivoire%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire.</a> Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).</li>
<li>Gualtieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+A549+cells+exposed+to+Milan+PM2.5%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5.</a> Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).</li>
<li>Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+glycation+endproduct+induces+ROS+accumulation%2C+apoptosis%2C+MAP+kinase+activation+and+nuclear+O-GlcNAcylation+in+human+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes.</a> Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).</li>
<li>Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+biochemistry+and+physiology.+Part+B%2C+Biochemistry+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in zebrafish development.</a> Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).</li>
<li>Moazzen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acetylcysteine+prevents+congenital+heart+defects+induced+by+pregestational+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Diabetology%22%5BJournal%5D)">N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes.</a> Cardiovascular Diabetology. 13, 46(2014).</li>
<li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylcysteine%2C+reactive+oxygen+species+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond.</a> Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).</li>
<li>Tu, S., Chi, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+in+cardiac+development+and+congenital+heart+birth+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.</a> Differentiation. 84, 4-16 (2012).</li>
<li>Asnani, A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+tool+to+identify+novel+therapies+for+human+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease.</a> Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+effects+of+polychlorinated+biphenyls+on+cardiac+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish.</a> Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).</li>
<li>Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+particulate+matter+from+cigarette+smoke+disrupts+vascular+development+in+zebrafish+brain+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio).</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).</li>
<li>Ren, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHR-mediated+ROS+production+contributes+to+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> The Science of the Total Environment. 719, 135097(2020).</li>
<li>van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+consensus+on+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An emerging consensus on cardiac regeneration.</a> Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).</li>
<li>Yue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+folic+acid+on+PM2.5-induced+cardiac+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos+by+targeting+AhR+and+Wnt%2Fbeta-catenin+signal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways.</a> Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).</li>
<li>Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+oxide+nanoparticles+induce+oxidative+DNA+damage+and+ROS-triggered+mitochondria-mediated+apoptosis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos.</a> Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).</li>
<li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity%2C+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+effects+on+glutathione-S-transferase+activity+induced+by+atrazine+exposure+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoewel zebravis een uitstekend gewerveld model is voor het bestuderen van de cardiale ontwikkelingstoxiciteit van milieuchemicaliën, is het vanwege de kleine omvang van het embryohart moeilijk om voldoende eiwit te verkrijgen voor western blot-analyse. Daarom presenteren we een gevoelige immunofluorescentiemethode voor het kwantificeren van de eiwitexpressieniveaus van DNA-schadebiomarkers in de harten van zebravisembryo's die zijn blootgesteld aan PM2.5.
Tijdens dissectie is het be...

Luchtvervuiling is nu een ernstig milieuprobleem waarmee de wereld wordt geconfronteerd. Fijnstof in de omgeving (PM2,5), een van de belangrijkste indicatoren van de luchtkwaliteit, kan een groot aantal schadelijke stoffen vervoeren en de bloedsomloop binnendringen, waardoor de menselijke gezondheid ernstig wordt geschaad1. Epidemiologische studies hebben aangetoond dat blootstelling aan PM2,5 kan leiden tot een verhoogd risico op aangeboren hartafwijkingen (CHD's)2,3. Bewijs uit dierproeven toonde ook aan dat PM2,5 abnormale cardiale ontwikkeling kan veroorzaken bij zebravisembryo's en de nakomelingen van muizen, maar de moleculaire mechanismen van de cardiale ontwikkelingstoxiciteit van PM2,5 zijn nog grotendeels onbekend4,5,6.
DNA-schade kan celcyclusstilstand veroorzaken en apoptose veroorzaken, die het potentieel van voorlopercellen op grote schaal kan vernietigen en bijgevolg de hartontwikkeling kan schaden7). Het is goed gedocumenteerd dat milieuverontreinigende stoffen, waaronder PM2.5, het potentieel hebben om DNA aan te vallen via oxidatieve stressmechanismen8,9. Zowel de hartontwikkeling van mens als zebravis zijn gevoelig voor oxidatieve stress10,11,12. 8-OHdG is een oxidatieve DNA-schademarker en het γH2AX-signaal is een marker van DNA-dubbelstrengsbreuken. N-acetyl-L-cysteïne (NAC), een synthetische voorloper van intracellulaire cysteïne en glutathion, wordt veel gebruikt als een anti-oxidatieve verbinding. In deze studie gebruiken we NAC om de rol van oxidatieve stress in PM2.5- geïnduceerde DNA-schade13te onderzoeken.
Zebravis als modelgewerveld dier is op grote schaal gebruikt om cardiale ontwikkeling en menselijke hart- en vaatziekten te bestuderen, omdat mechanismen van cardiale ontwikkeling zeer geconserveerd zijn bij gewervelde dieren14,15. De voordelen van het gebruik van zebravissen als model zijn hun kleine formaat, sterk voortplantingsvermogen en lage voedingskosten. Van bijzonder belang voor deze studies, zebravisembryo's zijn niet afhankelijk van de bloedsomloop tijdens de vroege ontwikkeling en kunnen ernstige hartmisvorming overleven14. Bovendien maakt hun transparantie het mogelijk om het hele lichaam direct onder een microscoop te observeren. Zebravisembryo's bieden dus een uitstekende gelegenheid voor het beoordelen van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de inductie van cardiale ontwikkelingstoxiciteit als gevolg van blootstelling aan verschillende milieuchemicaliën5,16,17. We hebben eerder gemeld dat PM2.5-geïnduceerde oxidatieve stress leidt tot DNA-schade en apoptose, wat resulteert in hartmisvormingen bij zebravissen18. In deze studie bieden we een gedetailleerd protocol voor het onderzoeken van PM2.5-geïnduceerdeDNA-schade in het hart van zebravisembryo's.

<table><tbody><tr><td>8-OHdG Antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology, USA</td><td>sc-66036</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>Analytische balans</td><td>Sartorius, China</td><td>BSA124S</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Solarbio, Beijing, China</td><td>SW3015</td><td>Voor blokkering</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abcam, USA</td><td>ab104139</td><td>Voor nucleaire tegenkleuring.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Solarbio, Beijing, China</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Olympus, Japan</td><td>IX73</td><td>Voor het beeldvormen van fluorescentiesignalen/</td></tr><tr><td>Geit Anti-Konijn IgG Cy3</td><td>Carlsbad, USA</td><td>CW0159</td><td>Secundair antilichaam</td></tr><tr><td>Geit Anti-Konijn IgG FITC</td><td>Carlsbad, USA</td><td>RS0003</td><td>Secundair antilichaam</td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-cysteïne (NAC)</td><td>Adamas-Beta, Shanghai, China</td><td>616-91-1</td><td></td></tr><tr><td>Orbitale shaker</td><td>QILINBEIER, China</td><td>TS-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma, China</td><td>P6148</td><td>Maak 4% paraformaldehyde voor fixatie.</td></tr><tr><td>Fosfaat Buffered Saline</td><td>HyClone, USA</td><td>SH30256.01</td><td>Bereid 0,1% Tween in PBS voor wassen.</td></tr><tr><td>PM2.5 sampler</td><td>TianHong, Wuhan, China</td><td>TH-150C</td><td>Voor 24-uur ononderbroken PM2.5 bemonstering.</td></tr><tr><td>Re-circulerend aquacultuursysteem</td><td>HaiSheng, Shanghai, China</td><td></td><td>De zebravis werd erin onderhouden.</td></tr><tr><td>Soxhlet extractor</td><td>ZhengQiao, Shanghai, China</td><td>BSXT-02</td><td>Voor extractie van organische componenten.</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Nikon, Canada</td><td>SMZ645</td><td>Voor hartdissectie van zebravisembryo's.</td></tr><tr><td>Tricaine methaansulfonaat (MS222)</td><td>Sigma, China</td><td>E10521</td><td>Om zebravisembryo's te verdoven</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, China</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;H2AX Antilichaam</td><td>Abcam, USA</td><td>ab26350</td><td>Primair antilichaam</td></tr></tbody></table>

immunofluorescentie gebruiken om pm2.5-geïnduceerdedna-schade in zebravisembryoharten te detecteren

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

Blootstelling aan fijnstof in de omgeving (PM2,5)kan leiden tot cardiale ontwikkelingstoxiciteit, maar de onderliggende moleculaire mechanismen zijn nog onduidelijk. 8-hydroxy-2'deoxygenase (8-OHdG) is een marker van oxidatieve DNA-schade en γH2AX is een gevoelige marker voor DNA-dubbelstrengsbreuken. In deze studie wilden we PM2,5-geïnduceerde8-OHdG- en γH2AX-veranderingen in het hart van zebravisembryo's detecteren met behulp van een immunofluorescentietest. Zebravisembryo's werden behandeld met extraheerbare organische stoffen (EOM) van PM2,5 bij 5 μg / ml in de aan- of afwezigheid van antioxidant N-acetyl-L-cysteïne (NAC, 0,25 μM) 2 uur na bevruchting (hpf). DMSO werd gebruikt als voertuigbesturing. Bij 72 hpf werden harten met behulp van een spuitnaald van embryo's ontleed en gefixeerd en gepermeabiliseerd. Na te zijn geblokkeerd, werden monsters onderzocht met primaire antilichamen tegen 8-OHdG en γH2AX. Monsters werden vervolgens gewassen en geïncubeerd met secundaire antilichamen. De resulterende beelden werden waargenomen onder fluorescentiemicroscopie en gekwantificeerd met behulp van ImageJ. De resultaten tonen aan dat EOM van PM2.5 8-OHdG- en γH2AX-signalen in het hart van zebravisembryo's aanzienlijk verbeterde. NAC, dat optrad als een reactieve zuurstofsoort (ROS) aaseter, ging de door EOM geïnduceerde DNA-schade echter gedeeltelijk tegen. Hier presenteren we een immunofluorescentieprotocol voor het onderzoeken van de rol van DNA-schade in PM2.5-geïnduceerdehartafwijkingen die kunnen worden toegepast op de detectie van door chemicaliën geïnduceerde eiwitexpressieveranderingen in de harten van zebravisembryo's.

Deze immunofluorescentietest is een gevoelige en specifieke methode voor het meten van eiwitexpressieveranderingen in de harten van zebravisembryo's die zijn blootgesteld aan milieuchemicaliën.
In deze representatieve analyse werden embryo's blootgesteld aan PM2,5 in afwezigheid of aanwezigheid van de antioxidant NAC geëvalueerd op de aanwezigheid van hartmisvormingen(figuur 1). Zoals waa...

Dit protocol maakt gebruik van een immunofluorescentietest om PM2,5-geïnduceerdeDNA-schade in de ontlede harten van zebravisembryo's te detecteren.

Immunofluorescentie gebruiken om PM2.5-geïnduceerdeDNA-schade in zebravisembryoharten te detecteren

Ambient fine particulate matter (PM2.5) exposure can lead to cardiac developmental toxicity but the underlying molecular mechanisms are still unclear. ...

Deze methode kan worden gebruikt om de expressie van doeleiwitten in het hart van de zebravis nauwkeurig en gemakkelijk te detecteren. De verandering in het doeleiwit wordt direct gedetecteerd door immunofluorescentie te meten. Voer het verzamelen en behandelen van zebravisembryo's uit, zoals beschreven in het tekstmanuscript.Breng 72 uur na de bevruchting de embryo's over in glazen dia's en observeer ze onder een stereomicroscoop. Registreer hartmisvormingen, zoals pericardiaal oedeem, veranderde looping en verminderde grootte. Bereken misvormingspercentages en analyseer verschillen tussen groepen met behulp van ANOVA op één manier, gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Turkije.Na het verdoven van de embryo's met 0,6 milligram per milliliter MS222, registreert u hartslagen gedurende 30 seconden en kwantificeert u de hartslag met behulp van Image J-software. Ontleed harten van de embryo's van de zebravis zorgvuldig met een wegwerpspuitnaald onder een stereomicroscoop. Gebruik een hydrofobe barrièrepen om een cirkel te tekenen op een schone glazen dia.Voeg 50 microliter 4% paraformaldehyde toe aan 1,25 microliter PBS om een fixatieve oplossing te maken, plaats vervolgens drie ontlede harten in één hydrofobe barrièrecirkel en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Decanteer de oplossing onder de microscoop en droog de monsters gedurende ten minste vijf minuten bij kamertemperatuur. Was de dia's driemaal in PBST gedurende vijf minuten per wasbeurt.Voeg 50 microliter BSA toe aan 1.000 microliter PBST om een 5% BSA-oplossing te verkrijgen en incubeer de dia's gedurende een uur in een vochtige kamer om niet-specifieke antilichaambinding te blokkeren. Decanteer de oplossing en was de monsters driemaal met PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt. Verdun twee microliter monoklonaal antilichaam van muizen tegen 8-hydroxydeoxyguanosine en twee microliter konijnenpolyklonaal antilichaam tegen gamma-H2AX in 296 microliter PBST om een werkende primaire antilichaamcocktailoplossing te verkrijgen.Incubeer de hartmonsters met 50 microliter van de primaire antilichaamcocktailoplossing in een bevochtigde kamer gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij vier graden Celsius. Decanteer de oplossing en was de monsters driemaal met PBST gedurende vijf minuten per wasbeurt. Verdun één microliter FITC-gelabeld geit anti-muis secundair antilichaam en één microliter psy-3 geiten anti-konijn secundair antilichaam in 500 microliter PBST om een werkende secundaire antilichaam cocktail oplossing te verkrijgen.Incubeer de monsters met de secundaire antilichamen gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker. Decanteer de oplossing en was de monsters driemaal met PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt. Voeg 20 microliter DAPI toe aan de monsters voor nucleaire kleuring en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Breng een afdekslip aan op de dia en sluit deze af met nagellak om uitdroging en beweging te voorkomen. Stel de monsters in beeld onder een fluorescentiemicroscoop en kwantificeer het fluorescerende signaal van het hartgebied met behulp van ImageJ-software. Bereken de relatieve veranderingen met behulp van het gemiddelde van de DMSO-controlemonsters en bepaal de statistische significantie van de gegevens.Embryo's blootgesteld aan PM 2,5 in afwezigheid of aanwezigheid van de antioxidant, N-acetyl-L-cysteïne, of NAC, werden geëvalueerd op de aanwezigheid van hartmisvormingen. EOM vanaf PM 2,5 kostte een significante toename van cardiale teratogenese, zoals pericardoedeem, veranderde looping en verminderde grootte, in vergelijking met met DMSO-controle behandelde harten. De hartslag was ook significant verlaagd bij embryo's die werden blootgesteld aan EOM.Toevoeging van NAC verzwakte EOM-geïnduceerde hartafwijkingen. Een immunofluorescentietest werd gebruikt om de mate van DNA-schade in met EOM behandelde weefsels te evalueren. De niveaus van 8-hydroxydeoxyguanosine en gamma-H2AX-expressie waren significant verhoogd in de harten van zebravisembryo's behandeld met EOM, wat wijst op een toename van oxidatieve DNA-schade en DNA-dubbelstrengsbreuken, respectievelijk.De door EOM geïnduceerde DNA-schade werd gedeeltelijk tegengegaan door NAC-suppletie. Let bij het proberen van dit protocol op bij het wassen van de monsters met PBS, omdat het hart van de zebravis van de dia kan afbladderen.

using-immunofluorescence-to-detect-pm25-induced-dna-damage-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een snelle manier om immunokleuring van zebravis embryonale hart gedrag wordt beschreven. In vergelijking met de ganse berg immunokleuring aanpak, deze methode verhoogt dramatisch de penetratie van de antilichamen, die het mogelijk maakt het verkrijgen van een hoge resolutie beelden, die cellulaire / subcellulaire structuren openbaren in het hart in een veel lagere verwerkingstijd.

Immunokleuring van ontleed zebravis embryonale hart

This video demonstrates a highly sensitive immunofluorescence-based assay for detecting PM2.5-induced oxidative damage in the hearts of zebrafish embryos by measuring the levels of 8-OHdG and γH2AX, which indicate DNA damage and double-strand DNA breaks, respectively.

Immunofluorescence Assay to Detect PM2.5-Mediated DNA Damage in Fish Embryos

Bepaalde genetische verstoringen of blootstelling aan toxines kunnen normale ontwikkelingsprocessen verstoren, wat leidt tot de dood van specifieke celtypen. De analyse van geactiveerde Caspase 3 door middel van immunofluorescence in zijn geheel in zebrafish embryo's onthult een stadium- en weefselspecifieke lokalisatie van cellen die specifiek apoptose ondergaan.

Analyse van Apoptose in Zebravis Embryo's door middel van Whole-mount Immunofluorescentie om Geactiveerd Caspase 3 te Detecteren

Hier beschreven is een protocol voor de semi-geautomatiseerde beeldvorming van weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's.

Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo&#39;s

Cardiale genexpressie profielen te analyseren tijdens zebravis ontwikkeling van het hart, heeft totaal RNA worden geëxtraheerd uit geïsoleerde harten. Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van functionele / kloppende harten door snelle handmatige dissectie van de zebravis embryo's tot cardiale-specifieke mRNA te verkrijgen.

Grootschalige de zebravis embryonale Hart Dissection voor Transcriptionele Analyse

Eiwitniveaus in cellen en weefsels vaak zijn gereguleerd door het evenwicht van eiwitproductie en klaring. Met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP), kan de klaringskinetiek van eiwitten experimenteel worden gemeten in vivo.

Meten Eiwit Stabiliteit in Living zebravis embryo&#39;s met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP)

Het doel van dit protocol is om een nieuwe methode voor de beoordeling van de segmentale cardiale functie bij embryonale zebravissen onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden te beschrijven.

Verplaatsinganalyse van Myocardiale mechanische vervorming (DIAMOND) onthult segmentale heterogeniteit van cardiale functie bij embryonale zebravis

We beschrijven geoptimaliseerde hulpmiddelen om het hart van de zebravis in vivo te bestuderen met fluorescentiemicroscopie van lichtplaten. In het bijzonder stellen we heldere cardiale transgene lijnen voor en presenteren we nieuwe zachte inbeddings- en immobilisatietechnieken die ontwikkelings- en hartafwijkingen voorkomen. Een mogelijke data-acquisitie- en analysepijplijn aangepast aan cardiale beeldvorming wordt ook verstrekt.

Light Sheet Microscopie van snelle hartdynamica in zebravisembryo's

Optogenetische manipulatie van signaalroutes kan een krachtige strategie zijn om te onderzoeken hoe signalering wordt gedecodeerd bij ontwikkeling, regeneratie, homeostase en ziekte. Dit protocol biedt praktische richtlijnen voor het gebruik van licht-zuurstof-spanningsgevoelige domeingebaseerde Nodale en botmorfogene proteïne (BMP) signaleringsactivatoren in het vroege zebravisembryo.

Optogenetische signaleringsactivering in zebravisembryo's

Deze studie stelt een op gevoelige immunofluorescentie gebaseerde beeldvormingsmethode vast om globale DNA-methylering in individuele zebravisembryonale harten te kwantificeren. Deze aanpak overwint de uitdaging van beperkt weefselmateriaal en omzeilt de noodzaak van bisulfietconversie.

Detectie van wereldwijde DNA-methylering in het hart van zebravislarven

Leer immunofluorescentie toepassen om DNA-schade door PM 2.5 in zebravisembryoharten te detecteren. Deze methode maakt nauwkeurige kwantificering van eiwitexpressie en hartafwijkingen mogelijk.

Immunofluorescentie gebruiken om PM_{2.5-geïnduceerde}DNA-schade in zebravisembryoharten te detecteren

Meer video's verkennen