Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - een veelzijdige techniek om cellulaire kinetiek te kwantificeren

Live-Cell Imaging van Single-Cell Arrays genaamd LISCA zijn ook een geautomatiseerde uitlezing van de fluorescerende tijdscursussen van honderden individuele cellen. Het voordeel van de aanpak is dat individuele celresponsen worden geregistreerd van ruimtelijk geïsoleerde cellen in identieke microomgevingen, waardoor een efficiënte emissieanalyse met geweldige statistieken mogelijk is. Om een eencellige array te fabriceren, gebruikt u een scalpel om een enkel MEESTERWERK van PDMs met zes micropoederstrepen uit de PDMs-laag te snijden en plaatst u het meesterwerk op de labbank met het micropatroon naar boven gericht.

Gebruik een scheermesje om elk van de zes micropatternstrepen in een PDMs-stempel te snijden en snijd enkele van de gevormde gebieden af om ervoor te zorgen dat de randen van de stempel open zijn. Krab vervolgens voorzichtig de beschermfolie van de afdekstrip van een zeskamerschuif om de kanaalposities van de glijbaan te markeren en plaats de afdekslip op de bank met de beschermfolie naar beneden gericht. Gebruik een pincet om de stempels op de afdekstrook op de gemarkeerde kanaalposities te plaatsen, met de micropatronen naar beneden gericht, en controleer de bevestiging van de stempels onder een microscoop.

De vierkanten die in contact komen met de dia lijken donkerder dan de interruimte. De patroonkwaliteit wordt verminderd door vierkanten die niet goed aan de dia zijn bevestigd. Als de stempels stevig zijn bevestigd, behandel dan de afdekstrook en de stempels met zuurstofplasma bij 0,2 millibar druk en ongeveer 40 Watt gedurende drie minuten om de oppervlakken tussen de PDMs-stempels en de afdekstrip hydrofiel te maken.

Plaats aan het einde van de plasmareiniging de afdeklip in een bioveiligheidskast en voeg 15 microliter gepegyleerde poly-l-lysineoplossing toe aan elke stempel, zodat de oplossing wordt geabsorbeerd in het hydrofiele patroon van de stempel. Spoel de stempels na 20 minuten af met een milliliter ultrapure water. Gebruik een pincet om de stempels van de glijbaan te verwijderen en spoel de afdekstrip een tweede keer af met een tweede milliliter ultrapure water.

Wanneer de afdekstrook volledig is opgedroogd, bevestigt u een kleverige schuif met zes kanalen aan de afdekstrook en zorgt u ervoor dat de micro-patroongebieden uitlijnen met de onderkant van de kanalen. En voeg 40 microliters PBS en 40 microliters fibronectine-oplossing toe aan elk kanaal. Om de twee oplossingen te mengen, verwijdert u 40 microliters uit één reservoir en voegt u deze drie keer toe aan het tegenoverliggende reservoir van hetzelfde kanaal om een homogene oplossing te genereren.

Wanneer alle kanalen zijn gemengd, incubeer de glijbaan gedurende 45 minuten op kamertemperatuur voordat u elk kanaal drie keer wast met 120 microliter PBS per wasbeurt. Wissel de PBS om naar 37 graden Celsius, volledig aangevuld celgroeimedium in de kanalen door 120 microliter medium aan één reservoir toe te voegen en verwijder het uit het tegenoverliggende reservoir. Voeg 40 microliter van een 400.000 cellen per milliliter celsuspensie van belang en 40 microliter celgroeimedium toe aan elk kanaal en meng de celoplossing met het medium zoals aangetoond.

Verwijder na het mengen 40 microliters suspensie uit elk kanaal, zodat alleen de kanalen worden gevuld met celsuspensie, en plaats de dia in een celkweek-incubator. Controleer na een uur op celadhesie door fasecontrastmicroscopie en voeg 120 microliters van 37 graden Celsius celgroeimedium toe aan elk kanaal en breng de dia vervolgens nog drie uur terug naar de celkweek-incubator. Om een perfusiesysteem op te zetten, sluit u een spuit van één milliliter gevuld met 37 graden Celsius celgroeimedium aan op de inlaatbuis van het systeem en gebruikt u de klep om de buis met medium te vullen.

Sluit de inlaatbuis aan op het reservoir van één kanaal, zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden opgesloten en sluit een seriële connector aan op het reservoir tegenover de inlaatbuis van het huidige kanaal. Sluit de rest van de kanalen aan zoals aangetoond totdat het vereiste aantal kanalen in serie is aangesloten. En sluit de uitlaatbuis direct aan op het vrije reservoir van het laatste kanaal.

Vul vervolgens de aangesloten buis met medium om te bevestigen dat het perfusiesysteem niet lekt. Voor timelapse-beeldvorming van de cellen, om een timelapseprotocol in te stellen voor het opnemen van een fasecontrastbeeld en een fluorescentiebeeld, stelt u de optische configuratie in voor fasecontrastbeeldvorming en fluorescentiebeeldvorming. Gebruik een 10-voudig objectief, de juiste fluorescentiefilters en een geautomatiseerd scherpstelcorrectiesysteem om een betere beeldkwaliteit voor de langetermijnmetingen te garanderen.

Selecteer een belichtingstijd van 10 milliseconden voor de fasecontrastbeeldvorming en een belichtingstijd van 750 milliseconden voor het opnemen van de EGFP-fluorescentie-intensiteit. Stel een tijdsschema in met een tijdsinterval van 10 minuten tussen de opeenvolgende lussen door de positielijst en een observatietijd van 30 uur. Plaats vervolgens de zes kanalenschuif op de enkele kelderverhoging in de monsterhouder van de verwarmingskamer van 37 graden Celsius van de microscoop en plak de buis van het perfusiesysteem op het podium.

Steek de vrije uiteinden van de uitlaatbuizen in een conische buis van 15 milliliter om het vloeibare afval op te halen. En stel de positielijst in voor de scantijdvervalmeting, waarbij ervoor wordt gezorgd dat het aantal posities binnen het gedefinieerde tijdsinterval tussen opeenvolgende lussen door de positielijst kan worden gescand. Start vervolgens de timelapsemeting.

Voor transfectie van de cellen met een fluorescerende marker, gebruik een spuit om het slangsysteem door te spoelen met een milliliter van 37 graden Celsius PBS, waarbij u ervoor zorgt dat het microscoopstadium niet beweegt. Vul na het spoelen het systeem met 300 microliter serum gereduceerd medium aangevuld met het mRNA van belang, tot een uiteindelijke concentratie van 0,5 nanogram mRNA per microliter, en laat de lipoplexen een uur incuberen. Spoel aan het einde van de incubatie het systeem door met een milliliter van 37 graden Celsius volledig celgroeimedium om ongebonden mRNA te verwijderen.

Bekijk aan het einde van de analyse de kanalen in het kanaalmenu en blader door de tijdframes om die vooraf geselecteerde cellen en hun geïntegreerde fluorescerende signalen te inspecteren. Klik op een cel van belang om de fluorescentietijdcursus te markeren, of klik op een tijdcursus om de bijbehorende cel te vinden. Druk op shift terwijl u op een cel klikt om deze te selecteren of uit te schakelen.

Selecteer cellen die niet levensvatbaar zijn of niet beperkt zijn tot een hechtingsvlek of die aan een andere cel zijn bevestigd om ze uit te sluiten van verdere analyse. Wanneer alle cellen op de juiste manier zijn geselecteerd of gedeselecteerd, slaat u de tijdvakken voor één cel voor het celgebied en de geïntegreerde fluorescentie op in een geschikte map. Om het begintijd van de vertaling na de transfectie en de sterkte van de cellulaire EGFP-expressie te kwantificeren, kan een drietrapsvertalingsmodel worden gebruikt.

De modeloplossing voor EGFP kan worden gemonteerd op eencellige tijdcursussen zoals geïllustreerd. Hier kunnen histogrammen van de begintijd van de vertaling en de expressiesnelheid van lipoplextransfecteerde cellen worden waargenomen. Aangezien beide parameters voor elke cel worden geschat, kan de correlatie van deze parameters worden geanalyseerd zoals aangetoond in de spreidingsplot en vergeleken met cellen die zijn getransfecteerd met lipide nanodeeltjes.

Zoals geïllustreerd, vertonen cellen die zijn getransfecteerd met lipide nanodeeltjes minder cel-cel variabiliteit in vergelijking met cellen die zijn getransfecteerd met lipoplexen. En het bevolkingsgemiddelde toont een sneller begin van vertaling, evenals een hogere expressiesnelheid. Onze aanpak kan ook worden aangepast aan alternatieve micropatronen.

Het belangrijkste voor LISCA is een goede celopsluiting en een combinatie van geautomatiseerde beeldanalyse met een handige gebruikersbegeleiding. Zoals je hebt gezien, is celgedrag heterogeen. En single-cell time lapse films bieden toegang tot onbevooroordeede dynamiek van de inherente biochemische netwerken.

Bijvoorbeeld in groene expressie, apoptose of cel dodende assays.