Name: Fluorescerende lekkagetest om membraan destabilisatie door cel-penetrerend peptide te onderzoeken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Leer de fluorescerende lekkagetest om membraan destabilisatie door cel-penetrerende peptiden te onderzoeken met behulp van liposomen. Deze methode biedt inzicht in mechanismen van cellulaire opname en translocatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Emilie Josse bedanken voor de kritische beoordeling van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de stichting "La Ligue contre le Cancer", de "Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer" en het "Centre National de la Recherche Scientifique" (CNRS).

1. Bereiding van grote unilamellaire blaasjes (GAV's)
<ol><li>Bereid LUVs voor op hun gebruik als celmembraan nabootst voor fluorescentielekkage assay.</li>
	<li>Meng met een Hamilton glazen spuit fosfatidylcholine (DOPC, 786,11 g/mol), sfingomyeline (SM, 760,22 g/mol) en Cholesterol (Chol, 386,65 g/mol) in de molaire verhouding 4:4:2. De lipideoplossing wordt verkregen uit een stamoplossing van elk lipide opgelost in een methanol/chloroform (3/1; volume/volume) oplosmiddel bij 25 mg/ml in een glazen kolf met ronde bodem van 25 ml. Op basis van 4 μmol DOPC, 4 μmol SM en 2 μmol Chol wordt de lipideoplossing verkregen uit stamoplossing door respectievelijk 126 μL, 117 μL en 31 μL te mengen. LET OP: Methanol is een giftig en ontvlambaar oplosmiddel en chloroform is giftig en kankerverwekkend. Beide moeten worden behandeld met de juiste bescherming onder een motorkap.</li>
	<li>Verdamp methanol/chloroform met behulp van een roterende verdamper onder vacuüm gedurende 45-60 minuten bij 60 °C tot de vorming van een gedroogde lipidenfilm.</li>
	<li>Bereid twee voorraad HEPES-bufferoplossingen voor. Bereid HEPES-buffer 1 door 20 mM HEPES (238,3 g/mol) en 75 mM NaCl (58,44 g/mol) te mengen en de pH in te stellen op 7,4. Bereid HEPES-buffer 2 voor door 20 mM HEPES en 145 mM NaCl te mengen en de pH in te stellen op 7,4. HEPES buffers kunnen gedurende 1 maand bewaard worden bij 4 °C. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de osmolariteit van de buffers te controleren met behulp van een osmometer.</li>
	<li>Bereid lipidehydratatieoplossing door membraan ondoordringbaar fluorescerend kleurstof-quencher-paar, 8-aminonaftaleen-1, 3, 6-trisulfonzuur, disodiumzout op 12,5 mM (ANTS, 427,33 g / mol) en p-xyleen-bispyridiniumbromide bij 45 mM (DPX, 422,16 g / mol) in HEPES-bufferoplossing op te lossen. Het mengen van ANTS met DPX leidt tot een geelgekleurde oplossing. Om de concentraties van 12,5 mM ANTS en 45 mM DPX te bereiken, lost u respectievelijk 21,4 mg en 76 mg op in 4 ml HEPES-buffer 1. OPMERKING: Lipide hydratatie-oplossing kan 2 weken bij 4 °C worden bewaard door de buis in te pakken met aluminiumfolie.</li>
	<li>Reconstitueer multilamellaire blaasjes (MLV) door de gedroogde lipidenfilm opnieuw op te suspenderen met 1 ml van de lipidehydratatieoplossing en door vortexing totdat de gedroogde lipidenfilm is opgelost. Zorg ervoor dat de oplossing volledig is oplost, omdat kleine lipideaggregaten een negatieve invloed hebben op de voorgaande stappen. Controleer ook de wand van de glazen kolf met ronde bodem om er zeker van te zijn dat er geen lipidefilm overblijft. OPMERKING: De oplossing zal opaalachtig en lichtgeel lijken na de oplosbaarheid.</li>
	<li>Onderwerp de blaasjes aan vijf vries-/dooicycli om unilamellaire blaasjes te verkrijgen. Voer elke cyclus uit door de glazen kolf met ronde bodem gedurende 30 s in vloeibare stikstof te plaatsen voor de vriesstap en vervolgens 2 minuten in een waterbad te laten voor het ontdooien. OPMERKING: De temperatuur van het badwater moet 5-10 °C hoger zijn dan de smelttemperatuur van de lipiden.</li>
	<li>Bereid lipide-extruder voor door twee filtersteunen in te brengen die vooraf bevochtigd zijn met HEPES-buffer in elk polytetrafluorethyleen (PTFE) extruderstuk dat in de metalen extruderbus wordt geplaatst.</li>
	<li>Plaats een HEPES bevochtigd polycarbonaatmembraan (poriegrootte van 0,1 μm, diameter van 25 mm) op de bovenkant van één filtersteun.</li>
	<li>Monteer de twee metalen extruderbussen en schroef ze vast.</li>
	<li>Plaats de geassembleerde extruder in de houder en plaats een spuit van 1 ml in het juiste gat aan het uiteinde van elk stuk polytetrafluorethyleen extruder. Extrusie komt overeen met de passage van de geteste vloeistof van de ene spuit naar de andere door het polycarbonaatmembraan.</li>
	<li>Test de extruder met 1 ml HEPES-buffer geladen in een van de spuiten van 1 ml om er zeker van te zijn dat er geen lekken of problemen zijn.</li>
	<li>Vervang de HEPES-buffer van 1 ml door het MLV-monster.</li>
	<li>Voer extrusie uit door het MLV-monster ten minste 21 keer van de ene spuit naar de andere door het polycarbonaatmembraan te laten lopen om uniforme GVV's van dezelfde grootte te verkrijgen. OPMERKING: Extrusie moet worden uitgevoerd bij een temperatuur die hoger is dan de smelttemperatuur van het lipidenmengsel.</li>
</ol>2. Zuivering van luv's
<ol><li>Bereid een kolomzuivering voor om niet-ingekapselde ANTS en DPX-overtollige te verwijderen.</li>
	<li>Introduceer cross-linked dextran gel (G-50) geresuspendeerd in waterig medium met 0,01% NaN3 (65 g/mol) in een vloeistofchromatografiekolom (Luer Lock, Non-jacketed, 1,0 cm x 20 cm, bedvolume 16 ml) tot 1 cm onder de bovenkant van het kleurloze deel van de kolom.</li>
	<li>Open de kraan en laat de vloeistof stromen om de verknoopte dextran-gel te laten bezinken.</li>
	<li>Was de kolom door te eluteren met 20 ml HEPES-buffer 2 en gooi de uitvoerstroom van de kolom weg.</li>
	<li>Sluit de kraan zodra het dode volume oplosmiddel boven de kolom is geminimaliseerd (<100 μL), maar voldoende om droging van de verknoopte dextran-gel te voorkomen.</li>
	<li>Plaats de vers geëxtrudeerde LUVs (geel) op de kolom en laat ze in de verknoopte dextran-gel komen.</li>
	<li>Voeg continu HEPES-buffer 2 toe aan de kolom om de LUV-zuivering uit te voeren.</li>
	<li>Eluteer ongeveer 2 ml HEPES-buffer 2 (vergeet niet om regelmatig de bovenkant van de kolom te vullen om te voorkomen dat de verknoopte dextran-gel wordt gedroogd): de vrije gele ANTS- en DPX-oplossing migreert langzamer dan de liposomen.</li>
	<li>Begin met het verzamelen van gezuiverde GV's in buizen (1,5 ml).</li>
	<li>Observeer de druppels eluent uit de kolom en wanneer ze opaalachtig worden, bevatten ze liposomen. Vervang de buis om de LUV-bevattende fractie terug te winnen.</li>
	<li>Elute totdat de druppels niet langer opaalachtig zijn (~ 1 ml). Eluteer daarna nog eens 0,5 ml in een aparte fractie en stop dan met eluteren. OPMERKING: Normen zijn nu beschikbaar in een breed scala aan molecuulgewichten, als kits of individuele molecuulgewichten om het elutievolume van de LUVs te kalibreren.</li>
	<li>Wikkel de buizen met de LUVs in aluminiumfolie om bleken van de fluorescentiekleurstof te voorkomen.</li>
	<li>Was de kolom met 20 ml HEPES buffer 2.</li>
	<li>De GAV's kunnen vervolgens een week bewaard worden bij 4 °C. OPMERKING: Aangezien de stabiliteit van LUV afhankelijk kan zijn van de LUV-concentratie en -samenstelling, evenals van de ionische sterkte, moet de grootte van de GAV's worden geregeld met behulp van een DLS-instrument (Dynamic Light Scattering) (zie rubriek 4). Karakterisering van LUV-grootte en homogeniteit) vóór elke test.</li>
</ol>3. Kwantificering van de concentratie van LUV's
<ol><li>Schat de LUV-concentratie door een fosfolipidekwantificeringskit, die de evaluatie van cholineconcentratie mogelijk maakt19. Deze test kan worden toegepast wanneer fosfolipiden met choline bevattende polaire kop substantieel is (>50% van de GAV's).</li>
	<li>Bereid het kleurreagens door 18 mg chromogeen substraat op te lossen in 3 ml meegeleverde buffer.</li>
	<li>Laad een polystyreen cuvette, 10 x 10 x 45 mm, met 3 ml kleurreagens.</li>
	<li>Gebruik het zuivere kleurreagens als lege toestand (Leeg). Voeg 20 μL LUV-monster (test) of 20 μl standaardoplossing met bekende cholineconcentratie (standaard) toe.</li>
	<li>Meng goed en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C alle omstandigheden (Blank, Test en Standard).</li>
	<li>Meet de absorptie (optische dichtheid, OD) van het testmonster en de standaardoplossing met de blanco-oplossing als controle bij 600 nm met een spectrofotometer.</li>
	<li>Controleer de OD-waarden die het mogelijk maken om de lipidenconcentratie van de GEV's, C [LUV], in choline-equivalent te schatten in vergelijking met de standaard van de bekende concentratie.</li>
	<li>Voer de berekening uit met behulp van de volgende vergelijking: C[LUV] (mol / l) = (OD Sample / OD Standard) x C[Standard] (mol / l) OPMERKING: De fosfolipide kwantificeringskit leverde een cholinechloride (139,6 mg / l) standaardoplossing bij 54 mg / dL overeenkomend met molaire concentratie van C [Standaard] = 3,87 mmol / L. OD-monster en OD-standaard zijn de absorpties gemeten bij 600 nm voor respectievelijk de LUV- en Choline-oplossingen.</li>
</ol>4. Karakterisering van LUV-grootte en homogeniteit
<ol><li>Voer een meting uit met behulp van een DLS-instrument om de LUV-grootte (in nm) en polydispersiteitsindex (PdI) te bepalen.</li>
	<li>Programmeer de toegeëigende "standaardbewerkingsprocedure" (SOP) door de viscositeit van het oplosmiddel/de buffer en het gebruikte cuvet aan te geven.</li>
	<li>Plaats 500 μL van de LUV-oplossing in een polystyreen semi-micro cuvette.</li>
	<li>Plaats het polystyreen semi-micro cuvet in een DLS-instrument.</li>
	<li>Meet bij kamertemperatuur de grootteverdeling in termen van gemiddelde grootte (Z-gemiddelde) van de deeltjesverdeling en homogeniteit (polydispersiteitsindex, PdI).</li>
	<li>Alle resultaten worden verkregen uit twee onafhankelijke metingen die elk in drie repetitieve cycli worden uitgevoerd. OPMERKING: Standaardwaarden voor GAV's zijn een gemiddelde grootte van 137 ± 7 nm met een PdI van 0,149 ± 0,041.</li>
</ol>5. Peptide-oplossingen bereiden
<ol><li>Bereid een voorraadoplossing van het peptide, die moet worden geanalyseerd voor de lektest.</li>
	<li>Los peptidepoeder (>95% zuiverheid) op in zuiver water (bijv. 1 mg peptide in zuiver water van 500 μL). OPMERKING: Het wordt aanbevolen om peptiden in zuiver water te verdunnen en om oplosbaarheid van dimethylsulfoxide (DMSO) te vermijden, wat artefacten zou kunnen veroorzaken (bijv. membraanpermeabilisatie20).</li>
	<li>Vortex de peptide oplossing voor 5 s.</li>
	<li>Soniceer de peptide-oplossing gedurende 5 minuten in een watersontsoonapparaatbad en centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 12.225 x g. Verzamel het supernatant voor concentratiebepaling.</li>
	<li>Meet de absorptie bij 280 nm van drie onafhankelijke peptideverdunningen en bereken vervolgens de peptideconcentratie met behulp van de molaire extinctiecoëfficiënt ε (afhankelijk van tryptofaan en tyrosinegehalte in de peptidesequentie) en beer-lambert regel. OPMERKING: Als het peptide tryptofaan en tyrosine bevat, wordt de molaire extinctiecoëfficiënt ε berekend op basis van tryptofaan ε = 5.690 M-1cm-1 en Tyrosine ε = 1.280 M-1cm-1. Als de peptidesequentie geen tryptofaan of tyrosine bevat, kan een andere colorimetrische test worden uitgevoerd om de concentratie te meten (bijv. BCA of Bradford).</li>
	<li>Verdun de peptide-oplossing in zuiver water tot een eindoplossing van 100 μM en bewaar bij 4 °C. OPMERKING: In zuiver water treedt geen peptideafbraak op tijdens de opslag bij 4 °C. De peptideconcentratie moet echter om de 2 weken worden gemeten om ervoor te zorgen dat er geen waterverdamping optreedt.</li>
</ol>6. Fluorescentielekkagetest
<ol><li>Fluorescentielekkagetest wordt gemeten op een spectrofluorometer bij kamertemperatuur. Excitatie en emissiegolflengte zijn vastgesteld op Ex = 360 nm ± 3 nm en Em = respectievelijk 530 nm ± 5 nm.</li>
	<li>Verdun GVV's in 1 ml HEPES-buffer 2 tot een eindconcentratie van 100 μM in een kwartsfluorescentiesyvet. Voeg een magneetroerder toe om de oplossing tijdens het experiment te homogeniseren.</li>
	<li>Meet de LUVs alleen tijdens de eerste 100 s, tussen t = 0 s en t = 99 s om toegang te krijgen tot de achtergrondfluorescentie. OPMERKING: LUVs alleen kunnen ook worden gemeten tijdens het hele experiment (15 min) om toegang te krijgen tot achtergrondfluorescentie en potentiële lekken.</li>
	<li>Meet daarna lekkage als een toename van de fluorescentie-intensiteit bij toevoeging van aliquots van peptide-oplossing voor de volgende 900 s (15 min). Dit protocol wordt uitgevoerd voor elke geteste concentratie peptide van 0,1 μM tot 2,5 μM.</li>
	<li>Ten slotte werd 100% fluorescentie bereikt door de LUVs op te laden door toevoeging van 1 μL Triton X-100 (0,1%, v/v), wat resulteerde in de volledig onuitblusbare sonde tussen t = 1.000 s en t = 1.100 s.</li>
</ol>7. Kwantificering van de lekkage
<ol><li>Onderdruk waarden verkregen na t = 1.090 s om hetzelfde aantal punten te behouden voor elke geteste toestand.</li>
	<li>Bereken de minimale fluorescentie, Fmin, door het gemiddelde van 50 punten tussen t = 0 s en t = 49 s (alleen GAV's) te maken.</li>
	<li>Bereken de maximale fluorescentie, Fmax, door het gemiddelde van 50 punten tussen t = 1.041 s en t = 1.090 s te maken (GAV's met Triton X-100).</li>
	<li>Bereken het lekkagepercentage (%Lek) op elk tijdstip (t = x), volgens de volgende vergelijking: %Lek(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100</li>
	<li>Bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie voor waarden verkregen met verschillende LUV-preparaten (n ≥ 2) voor dezelfde voorwaarde.</li>
	<li>Plot het lekpercentage, %Lek(t=x), in functie van tijd(en).</li>
</ol>

<ol><li>Langel, U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLangel%2C+U+%22Handbook+of+Cell-Penetrating+Peptides%22">Handbook of Cell-Penetrating Peptides</a>. , CRC Press. (2006).</li>
<li>Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides%3A+tools+for+intracellular+delivery+of+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+CMLS%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics.</a> Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005).</li>
<li>Richard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides.+A+reevaluation+of+the+mechanism+of+cellular+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2003).</li>
<li>Jones, A., Sayers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides%3A+tales+of+tails+wagging+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Cell entry of cell penetrating peptides: tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. , (2012).</li>
<li>Tünnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li>
<li>Jiao, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+and+endocytosis+for+cell-penetrating+peptide+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Translocation and endocytosis for cell-penetrating peptide internalization.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (49), 33957-33965 (2009).</li>
<li>Deshayes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+internalization+mechanism+of+WRAP%3AsiRNA+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta.+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Deciphering the internalization mechanism of WRAP:siRNA nanoparticles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1862 (6), 183252(2020).</li>
<li>Konate, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+vectorisation+property%3A+A+comparative+study+for+a+secondary+amphipathic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Optimisation of vectorisation property: A comparative study for a secondary amphipathic peptide.</a> International Journal of Pharmaceutics. 509 (1-2), 71-84 (2016).</li>
<li>Lehto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+trafficking+determines+the+exon+skipping+activity+of+Pip6a-PMO+in+mdx+skeletal+and+cardiac+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular trafficking determines the exon skipping activity of Pip6a-PMO in mdx skeletal and cardiac muscle cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (5), 3207-3217 (2014).</li>
<li>Hoyer, J., Neundorf, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+vectors+for+the+nonviral+delivery+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Peptide vectors for the nonviral delivery of nucleic acids.</a> Accounts of Chemical Research. 45 (7), 1048-1056 (2012).</li>
<li>Milletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides%3A+classes%2C+origin%2C+and+current+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape.</a> Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).</li>
<li>Mueller, J., Kretzschmar, I., Volkmer, R., Boisguerin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cellular+uptake+using+22+CPPs+in+4+different+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparison of cellular uptake using 22 CPPs in 4 different cell lines.</a> Bioconjugate Chemistry. 19 (12), 2363-2374 (2008).</li>
<li>Ramaker, K., Henkel, M., Krause, T., Röckendorf, N., Frey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+penetrating+peptides%3A+a+comparative+transport+analysis+for+474+sequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Cell penetrating peptides: a comparative transport analysis for 474 sequence motifs.</a> Drug Delivery. 25 (1), 928-937 (2018).</li>
<li>Maget-Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monolayer+technique%3A+a+potent+tool+for+studying+the+interfacial+properties+of+antimicrobial+and+membrane-lytic+peptides+and+their+interactions+with+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane-lytic peptides and their interactions with lipid membranes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1462 (1-2), 109-140 (1999).</li>
<li>Alves, A. C., Ribeiro, D., Nunes, C., Reis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+in+cancer%3A+The+relevance+of+drug-membrane+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Biophysics in cancer: The relevance of drug-membrane interaction studies.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1858 (9), 2231-2244 (2016).</li>
<li>Konate, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-based+nanoparticles+to+rapidly+and+efficiently+%22Wrap+%27n+Roll%22+siRNA+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide-based nanoparticles to rapidly and efficiently "Wrap 'n Roll" siRNA into cells.</a> Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 592-603 (2019).</li>
<li>Seisel, Q., Pelletier, F., Deshayes, S., Boisguerin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+evaluate+the+cellular+uptake+of+CPPs+with+fluorescence+techniques%3A+Dissecting+methodological+pitfalls+associated+to+tryptophan-rich+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta.+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">How to evaluate the cellular uptake of CPPs with fluorescence techniques: Dissecting methodological pitfalls associated to tryptophan-rich peptides.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (9), 1533-1545 (2019).</li>
<li>Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+helix+of+the+Antennapedia+homeodomain+translocates+through+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).</li>
<li>Takayama, M., Itoh, S., Nagasaki, T., Tanimizu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+enzymatic+method+for+determination+of+serum+choline-containing+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%3B+International+Journal+of+Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new enzymatic method for determination of serum choline-containing phospholipids.</a> Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry. 79 (1), 93-98 (1977).</li>
<li>Notman, R., Noro, M., O'Malley, B., Anwar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+Dimethylsulfoxide+%28DMSO%29+action+on+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for Dimethylsulfoxide (DMSO) action on lipid membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (43), 13982-13983 (2006).</li>
<li>Konate, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+cellular+uptake+mechanism+of+a+secondary+amphipathic+cell-penetrating+peptide+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Insight into the cellular uptake mechanism of a secondary amphipathic cell-penetrating peptide for siRNA delivery.</a> Biochemistry. 49 (16), 3393-3402 (2010).</li>
<li>Vaissière, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retro-inverso+cell-penetrating+peptide+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 34(2017).</li>
<li>Eiríksdóttir, E., Konate, K., Langel, Ü, Divita, G., Deshayes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+structure+of+cell-penetrating+peptides+controls+membrane+interaction+and+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Secondary structure of cell-penetrating peptides controls membrane interaction and insertion.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798 (6), 1119-1128 (2010).</li>
<li>Ziegler, A., Li Blatter, X., Seelig, A., Seelig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transduction+domains+of+HIV-1+and+SIV+TAT+interact+with+charged+lipid+vesicles.+Binding+mechanism+and+thermodynamic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein transduction domains of HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and thermodynamic analysis.</a> Biochemistry. 42 (30), 9185-9194 (2003).</li>
<li>Thorén, P. E. G., Persson, D., Karlsson, M., Nordén, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Antennapedia+peptide+penetratin+translocates+across+lipid+bilayers+-+the+first+direct+observation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The Antennapedia peptide penetratin translocates across lipid bilayers - the first direct observation.</a> FEBS Letters. 482 (3), 265-268 (2000).</li>
<li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+HIV+TAT+peptide+and+analogues+induced+by+multiplexed+membrane+and+cytoskeletal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (41), 16883-16888 (2011).</li>
<li>Rouser, G., Fleischer, S., Yamamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+dimensional+thin+layer+chromatographic+separation+of+polar+lipids+and+determination+of+phospholipids+by+phosphorus+analysis+of+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots.</a> Lipids. 5 (5), 494-496 (1970).</li>
<li>Bartlett, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorus+assay+in+column+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorus assay in column chromatography.</a> Journal of Biological Chemistry. 234 (3), 466-468 (1959).</li>
<li>Stewart, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+determination+of+phospholipids+with+ammonium+ferrothiocyanate%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate.</a> Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).</li>
<li>Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+peptide+translocation+into+large+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571(2012).</li>
<li>Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+effects+of+membrane-interacting+peptides+on+membrane+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell-Penetrating+Peptides%22%5BJournal%5D)">Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity.</a> Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).</li>
<li>Bárány-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gräslund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+membrane+perturbation+caused+by+the+cell+penetrating+peptide+Tp10+depending+on+attached+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo.</a> FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).</li>
<li>van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+permeabilization+by+oligomeric+%CE%B1-Synuclein%3A+in+search+of+the+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Membrane permeabilization by oligomeric α-Synuclein: in search of the mechanism.</a> PloS One. 5 (12), 14292(2010).</li>
<li>Hassane, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+cellular+trafficking+of+splice+redirecting+oligonucleotides+complexed+with+chemically+modified+cell-penetrating+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%3A+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).</li>
<li>Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+BCL-2+family+function+with+large+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291(2012).</li>
<li>Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+membrane+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of membrane transport proteins.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.

De gepresenteerde fluorescentielekkagetest is een eenvoudige en snelle methode om membraan destabilisatie door cel-penetrerend peptide aan te pakken. Het is gemakkelijk te doen en maakt ook een indirecte vergelijking mogelijk tussen verschillende membraan-interagerende peptiden of andere membraan-interagerende moleculen. Met betrekking tot kritieke stappen van het protocol, aangezien deze test relatieve waarden oplevert tussen de uitgangswaarde (alleen LUVs) en maximale fluorescentieafgifte (Triton-toestand), evalueren w...

Na hun ontdekking in de jaren negentig werden cel-penetrerende peptiden (CPP's) ontwikkeld om een efficiënte cellulaire levering van ladingen door het plasmamembraan te bevorderen1,2. CPP's zijn meestal korte peptiden, over het algemeen 8 tot 30 aminozuren, met een grote verscheidenheid aan oorsprongen. Ze werden voor het eerst gedefinieerd als "direct-translocerende" dragers, wat betekent dat ze in staat waren om het plasmamembraan te passeren en een lading over te brengen in cellen onafhankelijk van een endocytotische route, noch energiebehoefte noch receptorbetrokkenheid. Verder onderzoek bracht echter aan het licht dat deze eerste waarnemingen voornamelijk afkomstig waren van fluorescentieoverschatting als gevolg van het experimentele artefact en /of fixatieprotocollen met methanol3. Tegenwoordig is het algemeen aanvaard dat CPP-opname plaatsvindt door zowel endocytose als energie-onafhankelijke translocatie4,5,6,7, afhankelijk van verschillende parameters zoals de aard van de lading, de gebruikte link tussen CPP en lading, de bestudeerde cellijn, enz.
CPP's kunnen worden gebruikt als transfectionerende middelen volgens twee strategieën, hetzij met een chemische link (covalente strategie) of elektrostatische / hydrofobe interacties (niet-covalente strategie) tussen de CPP en zijn lading8,9,10,11. Hoewel beide strategieën hun efficiëntie hebben aangetoond in de celoverdracht van verschillende ladingen, is het begrip van het mechanisme van internalisatie door CPP's nog steeds controversieel en is de balans tussen endocytoseroutes of directe penetratie nog steeds moeilijk te meten12,13. Hoewel er een reeks experimentele hulpmiddelen en strategieën beschikbaar zijn om de betrokkenheid van endocytische processen duidelijk aan te pakken, lijkt de directe translocatie echter moeilijker te karakteriseren omdat het meer discrete interacties met plasmamembraancomponenten impliceert. Biologische membranen zijn meestal samengesteld uit talrijke componenten, van fosfolipiden tot membraaneiwitten, die kunnen variëren afhankelijk van het cellulaire type en / of de omgeving (stressomstandigheden, celdeling, enz.). Deze diversiteit van samenstelling, en bijgevolg de afwezigheid van een universeel cellulair membraanmodel, maakt studies op geen enkele manier mogelijk. Om deze beperkingen te omzeilen werden echter stapsgewijze benaderingen ontwikkeld met kunstmatige membraan- of membraanextracten. Van kleine unilamellaire blaasjes tot monolaagbenaderingen, elk model was duidelijk relevant om specifieke vragen14,15te beantwoorden. Onder hen vormen grote unilamellaire blaasjes (LUV's) een geschikt membraanimmickmodel om peptide / membraaninteracties te bestuderen als een belangrijk punt in het internalisatieproces.
In deze context beschrijft het volgende protocol het onderzoek naar de effecten van peptiden en peptide/membraaninteracties op de integriteit van LUVs door de monitoring van zowel een anionische fluorescerende kleurstof als de bijbehorende poly-kationische quencher ingekapseld in liposomen. Deze tool wordt gebruikt om CPP/membraaninteracties te bestuderen om te begrijpen of ze in staat zijn om een directe membraantranslocatie uit te voeren. Hoewel deze LUV-fluorescentielekkagetest meestal wordt toegepast om verschillende membraan-interagerende peptiden te vergelijken, kan deze LUV-fluorescentielekkagetest ook worden gebruikt voor het onderzoeken van zowel CPPs-ladingconjugaten (covalente strategie) als CPP:cargo-complexen (niet-covalente strategie).
Het huidige protocol zal daarom voor het eerst worden geïllustreerd met de recent ontwikkelde tryptofaan (W) - en arginine (R) -rijke amphipathische peptiden (WRAP)16. WRAP is in staat om op peptiden gebaseerde nanodeeltjes te vormen om snel en efficiënt klein storend RNA (siRNA) in verschillende cellijnen af te leveren16. De fluorescentielekkage-eigenschappen van WRAP-peptide alleen of siRNA-geladen WRAP-gebaseerde nanodeeltjes werden gecontroleerd om hun mechanisme van cellulaire internalisatie te karakteriseren. We toonden aan dat hun mechanisme van internalisatie voornamelijk directe translocatiebetrof 7. In een tweede voorbeeld werd het WRAP-peptide covalent geconjugeerd aan het eiwit/ eiwitinterfererende peptide iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 en het vermogen om membranen te destabiliseren werd in een fluorescentielekkagetest vergeleken met iCAL36 gekoppeld aan Penetratine18 (Penetratin-iCAL36), een andere CPP.
Tot slot zullen de voor- en nadelen van de methode worden besproken, zowel vanuit technologisch oogpunt als met betrekking tot biologische relevantie.

<table><tbody><tr><td>25 mL glass round-bottom flask</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS)</td><td>Invitrogen</td><td>A350</td><td>Bescherm tegen licht&nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>DOPC (dioleoylphosphatidylcholine)</td><td>Avanti Polar</td><td>850375P</td><td>Bescherm tegen lucht</td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Avanti Polar</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimeter</td><td>PTI Serlabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 &micro;L glass syringe</td><td>Hamilton</td><td>705N</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>LabAssay Phospholipid&nbsp;</td><td>WAKO&nbsp;</td><td>296-63801</td><td></td></tr><tr><td>liquid chromatography column</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carlo Erba</td><td>414902</td><td></td></tr><tr><td>Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 &micro;m pore size, 25 mm diameter)</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm</td><td>Grener Bio-One</td><td>614101</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene semi-micro cuvette, DLS</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB55924</td><td></td></tr><tr><td>p-xylene-bispyridinium bromide (DPX)</td><td>Invitrogen</td><td>X1525</td><td>Bescherm tegen licht&nbsp;</td></tr><tr><td>quartz fluorescence cuvette</td><td>Hellma</td><td>109.004F-QS</td><td></td></tr><tr><td>rotavapor system&nbsp;</td><td>Heidolph</td><td>Z334898</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50 resin</td><td>Amersham</td><td>17-0042-01</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chlorid (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator bath USC300T</td><td>VWR</td><td>142-6001</td><td></td></tr><tr><td>Sphingomyelin</td><td>Avanti Polar</td><td>860062P</td><td>Bescherm tegen lucht</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Eromedex</td><td>2000-B</td><td></td></tr><tr><td>Zetaziser NanoZS&nbsp;</td><td>Malvern</td><td>ZEN3500</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescerende lekkagetest om membraan destabilisatie door cel-penetrerend peptide te onderzoeken

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Cel-penetrerende peptiden (CPP's) worden gedefinieerd als dragers die in staat zijn om het plasmamembraan te passeren en een lading in cellen over te brengen. Een van de belangrijkste gemeenschappelijke kenmerken die nodig zijn voor deze activiteit was het gevolg van de interacties van CPP's met het plasmamembraan (lipiden) en meer in het bijzonder met componenten van de extracellulaire matrix van het membraan zelf (heparansulfaat). Inderdaad, onafhankelijk van de directe translocatie of de endocytose-afhankelijke internalisatie, zijn lipide bilayers betrokken bij het internalisatieproces, zowel op het niveau van het plasmamembraan als op het niveau van intracellulair verkeer (endosomale blaasjes). In dit artikel presenteren we een gedetailleerd protocol dat de verschillende stappen beschrijft van een formulering, zuivering, karakterisering en toepassing in fluorescentielekkagetest om mogelijke CPP-membraan destabilisatie / interactie te detecteren en hun rol in het internalisatiemechanisme aan te pakken. LUVs met een lipidesamenstelling die het plasmamembraangehalte weerspiegelt, worden gegenereerd om zowel een fluorescerende kleurstof als een quencher in te kapselen. De toevoeging van peptiden in het extravesiculaire medium en de inductie van peptide-membraaninteracties op de LUVs kunnen dus op een dosisafhankelijke manier een significante toename van fluorescentie veroorzaken die een lekkage onthult. Voorbeelden worden hier gegeven met de recent ontwikkelde tryptofaan (W) - en arginine (R) -rijke amphipathische peptiden (WRAPs), die een snelle en efficiënte siRNA-afgifte in verschillende cellijnen vertoonden. Ten slotte worden de aard van deze interacties en de affiniteit voor lipiden besproken om de membraantranslocatie en / of de endosomale ontsnapping te begrijpen en te verbeteren.

Het principe van de fluorescentielekkagetest is weergegeven in figuur 1. In detail worden grote unilamellaire blaasjes (LUV's) die een fluorescerende kleurstof en een quencher (geen fluorescentiesignaal) inkapselen, behandeld met het biomolecuul van belang. Door de interactie van het peptide met lipidemembranen, wat membraandoorlaatbaarheid, reorganisatie of zelfs breuk zou kunnen impliceren, komen de fluorescentiekleurstof en de quencher vrij uit de LUVs. Da...

De fluorescentielekkagetest is een eenvoudige methode die het onderzoek van peptide / membraaninteracties mogelijk maakt om hun betrokkenheid bij verschillende biologische processen te begrijpen en vooral het vermogen van cel-penetrerende peptiden om fosfolipiden bilayers te verstoren tijdens een direct cellulair translocatieproces.

Fluorescerende lekkagetest om membraan destabilisatie door cel-penetrerend peptide te onderzoeken

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

Deze fluorescentielektest is een eenvoudige methode om membraandestabilisatie door biomoleculen aan te pakken. Met behulp van liposomen met ingekapselde fluorescerende kleurstoffen, kan het worden gebruikt om verschillende membraaninteragerende peptiden te vergelijken. Deze methode is vooral nuttig om membraandestabilisatie door cel-penetrerende peptiden te onderzoeken om het mechanisme van cellulaire internalisatie te begrijpen en hun betrokkenheid bij directe membraantranslocatie te beoordelen.In vergelijking met biologische membranen maken liposomen het mogelijk om de fosfolipidesamenstelling te controleren om verschillende lipidewaarden na te bootsen, zoals plasma, endosomale of mitochondriale membranen. Om LUV's voor te bereiden voor hun gebruik als celmembraan-nabootsingen voor een fluorescentielektest, gebruikt u een Hamilton glazen spuit om fosfatidylcholine, sfingomyeline en cholesterol in een 4:4:2 molaire verhouding te mengen. Gebruik een rotatie verdamper om het methanol chloroform onder vacuüm te verdampen gedurende 46 tot 50 minuten bij 60 graden Celsius totdat een droge lipidefilm is gevormd.Om de multilamellaire vesikels te reconstitueren, resuspendeer de gedroogde lipidefilm met één milliliter lipidehydratatieoplossing en vortex grondig totdat de gedroogde lipidefilm is opgelost. Na te hebben bevestigd dat alle lipide is opgenomen en dat er geen film op de zijden van de flacon achterblijft, bevriest en ontdooit u de vesikels vijf keer gedurende 30 seconden in vloeibare stikstof en twee minuten in een 30 graden waterbad per cyclus. Om de lipide extruder voor te bereiden, steekt u twee HEPES-buffer behandelde filterondersteuningen in elk PTFE-extruderstuk in de metalen extruder-huls en plaatst u een 0,1 micron poriën HEPES bevochtigde polycarbonaatmembraan op de bovenkant van een filterondersteuning.Schroef de twee metalen extruderhulzen aan elkaar en plaats de geassembleerde extruder in de houder. Om de extruder op lekken of andere problemen te controleren, introduceert u een lege spuit van één milliliter in het juiste gat aan een uiteinde van het PTFE-extruderstuk en een andere spuit van één milliliter geladen met één milliliter HEPES-buffer aan het andere uiteinde, levert u vervolgens het multilamellaire vesikelmonster op dezelfde manier aan de extruder af en duwt u het monster van de ene spuit naar de andere door de polycarbonaatmembraan minstens 21 keer om uniforme LUV's te verkrijgen. Om de LUV's te zuiveren, voegt u vers geëxtrudeerd LUV's toe aan een vloeistofchromatografiekolom en laat de vesikels het verknoopte dextran-gel binnengaan.Voeg continu HEPES-buffer twee toe aan de kolom en begin met het elueren van ongeveer twee milliliter HEPES-buffer twee. De vrije gele ANTS- en DPX-oplossing zal langzamer migreren dan de liposomen. Nadat er een milliliter is geëlueerd, begint u de gezuiverde LUV's in 1,5 milliliter buisjes te verzamelen.Wanneer de druppels eluent oplakken, verwisselt u de buis om de LUV-bevattende fractie te herstellen. Wanneer de druppels niet meer oplakken, elueert u nog eens 500 microliter in een aparte fractie voordat u de elutie stopt. Om de LUV-grootte en polydispersiteitsindex te bepalen, geeft u de viscositeit van het oplosmiddel in de polystyreen semi-microcuvet op die in het experiment en het dynamische lichtverstrooiingssysteem wordt gebruikt, en voegt u 500 microliter van de LUV-oplossing toe aan de cuvet, laadt u vervolgens de cuvet op het instrument en meet u de grootteverdeling in termen van de gemiddelde grootte van de deeltjesverdeling en de homogeniteit.Om de fluorescentielek te meten, verdunt u de LUV's in één milliliter HEPES-buffer twee in een kwartsfluorescentiecuvet tot een uiteindelijke concentratie van 100 micromolair en voegt u een magnetische roerder toe om de homogenisatie van de oplossing tijdens het experiment te vergemakkelijken. Meet de LUV's alleen gedurende de eerste 100 seconden om de achtergrondfluorescentie te beoordelen voordat u de lekkage meet als een toename van de fluorescentie-intensiteit bij het toevoegen van aliquoten van peptide-oplossing gedurende de volgende 900 seconden. Om 100% fluorescentielek als positieve controle te meten, voegt u één microliter Triton X-100 toe aan de LUV's om de vesikels te solubiliseren, wat resulteert in een volledige niet-quenching van de sonde gedurende de laatste 100 seconden van de analyse.Gebruik vervolgens de formule om het lekkagepercentage op elk tijdstip te berekenen. Bij afwezigheid van peptiden wordt geen fluorescentielek waargenomen van de LUV's. De toevoeging van WRAP aan de LUV's induceert een significante toename van de fluorescentie, wat een belangrijke LUV-lekkage en ANTS-afgifte aantoont.Na 15 minuten wordt een lekkage van ongeveer 67% verkregen in aanwezigheid van 2,5 micromolair WRAP vergeleken met de Triton-positieve controle. In tegenstelling, wanneer WRAP wordt geassembleerd bij dezelfde concentratie met kleine interfererende RNA om peptide-gebaseerde nanodeeltjes te vormen, is de lekkage 1,5 keer zwakker vergeleken met het vrije peptide. Wanneer het geconjugeerde Penetratin-iCAL-peptide wordt gebruikt, wordt geen significante toename van de fluorescentie gedetecteerd, terwijl de toevoeging van WRAP-iCAL-peptide een nettolekkage induceert, gekenmerkt door een zeer sterk fluorescerend signaal bij dezelfde 2,5 micromolaire concentratie.Deze resultaten wijzen erop dat de fluorescentielektest kan worden gebruikt om het vermogen van sommige cel-penetrerende peptiden om peptide-membraaninteracties uit te voeren die leiden tot een min of meer uitgesproken membraanpermeabiliteit, te onthullen. Deze methode bevordert een snelle identificatie van membraanpeptide-interacties die leiden tot membraandestabilisatie om het internalisatiemechanisme van cel-penetrerende peptiden of andere membraanactieve peptiden zoals fotogenische of antimicrobiële peptiden te ontcijferen. In het geval van peptide-lipide-interactie zonder lekkage-inductie, zijn andere benaderingen zoals tryptofaanfluorescentie-experimenten vereist.Deze fluorescentielektest wordt veel gebruikt binnen

fluorescent-leakage-assay-to-investigate-membrane-destabilization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dit protocol details een methode voor de kwantitatieve meting van peptide translocatie in grote unilamellaire lipide blaasjes. Deze methode biedt ook informatie over de snelheid van de membraan translocatie en kan worden gebruikt om peptiden die efficiënt en spontaan kruisen lipidendubbellagen te identificeren.

Het meten van Peptide Translocatie in grote unilamellaire Blaasjes

Dit rapport beschrijft het gebruik van live cell imaging en photobleach technieken om de oppervlakte-expressie, transportroutes en handel in kinetiek van exogeen uitgedrukt, pH-gevoelige GFP-gelabelde eiwitten in de plasmamembraan van neuronen te bepalen.

Laterale diffusie en Exocytose van membraaneiwitten in gekweekte zenuwcellen gemeten met behulp van Fluorescence Recovery en fluorescentie-verlies fotobleken

This video describes an in vitro fluorescence-based microplate assay to study the degradation kinetics of a fluorescently-labeled misfolded luciferase mutant protein expressed in the nuclei of transfected mammalian cells. The assay involves the treatment of cells expressing the fluorescent mutant protein with a translation inhibitor and a proteasome inhibitor to assess the proteasome-mediated degradation of the misfolded protein.

Fluorescence Microplate-Based Cycloheximide Chase Assay: A Technique to Monitor the Degradation Kinetics of Fluorescent Nuclear Misfolded Proteins

This video discusses the fluorescence leakage assay to study the interactions of cell-penetrating peptides with cell membranes using cell membrane mimics — large unilamellar vesicles, or LUVs, encapsulated with a fluorescent dye and a quencher.

Fluorescence Leakage Assay to Study Cell-Penetrating Peptide Interaction with Membrane

This video demonstrates an assay to study the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells. The cells are exposed to a bacterial pore-forming toxin, which forms pores in the cell membrane. In the presence of extracellular calcium ions, the pore causes calcium influx, inducing membrane-resealing events. The resealing efficiency is assessed using DNA-binding propidium iodide dye, which only enters cells without a resealed membrane.

An In Vitro Fluorescence-Based Assay to Measure Plasma Membrane Resealing Efficiency

Een gestroomlijnde benadering screening op de expressie van recombinant membraaneiwitten in Escherichia coli gebaseerd op fusie met groen fluorescent proteïne gepresenteerd.

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

Hier presenteren we een protocol om de oriëntatie en topologie van integrale membraaneiwitten in levende cellen te bepalen. Dit eenvoudige protocol is gebaseerd op de selectieve proteasegevoeligheid van chimaeren tussen het eiwit van belang en GFP.

Het bepalen van membraaneiwit Topologie behulp Fluorescentie protease Protection (FPP)

We beschrijven een op fluorescentie gebaseerde assay om fosfolipide-scrambling in grote unilamellaire liposomen gereconstitueerd met opsine te meten.

Een fluorescentie-gebaseerde test fosfolipide scramblase Activity

Cell membrane verwonding via twee-foton laser is een veelgebruikte methode voor de beoordeling van de membraan opnieuw verzegelen vermogen en kan worden toegepast op meerdere celtypes. Hier beschrijven we een protocol voor in vitro live-imaging membraan daarvan in dysferlinopathy patiënten cellen na twee-foton laser van het baarmoederslijmvlies.

Cell Membrane Repair Assay met behulp van een Laser van het twee-foton microscoop

Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer fluorescentie gebaseerde bepaling dat de maatregelen van het plasma-membraan opnieuw verzegelen efficiëntie door fluorimetrische en imaging analyses in levende cellen. Deze test kan worden gebruikt voor het screenen van drugs of doelgenen die regelen plasmamembraan opnieuw verzegelen in zoogdiercellen.

High-throughput meting van plasmamembraan opnieuw verzegelen efficiëntie bij zoogdiercellen

We presenteren een kosteneffectieve methode voor het beoordelen van liposomale membraanpermeabiliteit met een superieure gevoeligheid en resolutie ten opzichte van conventionele technieken. Met behulp van een nieuwe ingekapselde ligandsubstitutiereactie detecteert deze techniek fosfolipase A 2-geïnduceerde veranderingen in modelmembranen. Deze toegankelijke benadering kan eenvoudig worden geïntegreerd met standaardanalyses en verbetert de resolutie voor het bestuderen van membraanbiofysica en...

Een liposoommembraanpermeabiliteitstest voor het onderzoeken van de effecten van fosfatidylinositolfosfaatgroepen op de membraneutrope werking van gif PLA2

Leer de fluorescerende lekkagetest om membraan destabilisatie door cel-penetrerende peptiden te onderzoeken met behulp van liposomen. Deze methode biedt inzicht in mechanismen van cellulaire opname en translocatie.

Fluorescerende lekkagetest om membraan destabilisatie door cel-penetrerend peptide te onderzoeken

Meer video's verkennen