Schatting van het kristallijne cellulosegehalte van plantaardige biomassa met behulp van de Updegraff-methode

Hier demonstreren we de Updegraff-methode, 's werelds meest gebruikte methode voor de schatting van het kristallijne cellulosegehalte. Cellulose bestaat in principe uit glucosemonomeren verbonden door bèta-1, 4 glycosidische bindingen. We hebben dit protocol in vijf fasen verdeeld.

In de eerste fase bereiden we het biomassamateriaal van de installatie voor. In de tweede fase halen we de ruwe celwand eruit. In de derde fase gebruiken we een Updegraff-behandeling waarbij Updegraff bestaat uit azijnzuur en salpeterzuur dat helpt bij het verwijderen van hemicellulose en lignine uit onze monsters.

In de vierde fase onderwerpen we het aan zure hydrolyse met behulp van zwavelzuur dat de glucosemonomeren produceert. Ten slotte gebruiken we in de vijfde fase een antroposofie om het kristallijne cellulosegehalte te schatten. Verzamel het plantmateriaal uit de kas, was ze grondig met water, droog ze twee dagen aan de lucht, scheid het weefsel en breng het weefsel over naar de individueel gelabelde containers en incubeer gedurende 10 dagen in de incubator bij 49 graden Celsius.

Snijd vervolgens in stukken met een schaar of mes. Vries het weefsel in en laad het in mortel en stamper voor fijn malen tot uniform poeder of gebruik als alternatief Freezer/Mill. Hier demonstreren we met freezer/mill, dus laden we onze weefselmonsters in deze maalflacons en plaatsen ze in de Freezer /Mill en draaien de 10 CP-snelheid gedurende drie cycli.

Het weefselpoeder wordt verzameld in de Falcon-buis zoals hier getoond. Weeg 20 mg van het weefselpoeder en breng over in een voorgewogen buis van twee ml. Voeg een ml eiwitslubilisatiebuffer toe om eiwitten te verwijderen. draaikolk.

Centrifugeer bij 15.000 rpm gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant weg. Herhaal deze stap nog twee keer.

Voeg een ml steriel water toe aan de vastgehouden pellet. draaikolk. Centrifugeer bij 15.000 rpm gedurende vijf minuten. Herhaal deze stap nog twee keer.

Voeg een ML 70% ethanol toe aan de vastgehouden pellet. draaikolk. Breng over naar een voorverwarmd blok van 70 graden Celsius met gelijktijdig schudden gedurende een uur. Na een incubatietijd van een uur centrifugeer je gedurende vijf minuten bij 15.000 rpm.

Herhaal deze stap nog een keer. Voeg aan de opgeslagen pellet een ml 100% methylone toe. draaikolk. Centrifugeer bij 15.000 rpm gedurende vijf minuten.

Voeg één ml chloroform methanol toe. draaikolk. Centrifugeer bij 15.000 rpm gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant weg en voeg een ml aceton toe. draaikolk.

Incubeer vijf minuten op kamertemperatuur. Centrifugeer bij 15.000 rpm gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant opnieuw weg en droog ze 's nachts aan de lucht bij 37 graden Celsius of ga verder met vacuümdrogen.

Plaats uw monsters in de vacuümdroger en droog ze twee tot drie uur aan de lucht of totdat de pellet volledig droog is. Weeg vijf mg van het celwandextract verkregen uit de vorige stap. Breng over in een schroefdopbuis van twee ml.

Neem op dit moment ook positieve controle op. Gebruik daarvoor twee mg Whatman-filterpapier. Breng over op een schroefdopbuis van twee ml.

Voeg 1,5 ml Updegraff-reagens toe aan elk gewogen celwandextract. Vortex en incubeer bij 100 graden Celsius in een voorverwarmd blok gedurende 30 minuten. Na 30 minuten incubatie, overbrengen naar een rek.

Laat het 10 minuten afkoelen op de bank. Centrifugeer bij 15.000 rpm gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren.

Voeg één ml steriel water toe. draaikolk. Centrifugeer bij 15.000 rpm gedurende 10 minuten. Gooi 500 microliter van het supernatant weg.

Voeg een ml aceton toe. draaikolk. Centrifugeer bij 15.000 rpm gedurende vijf minuten. Gooi een ml van het supernatant weg.

Voeg een ml aceton toe. draaikolk. Centrifugeer bij 15.000 rpm gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant volledig weg.

Voeg een ml aceton toe. draaikolk. Centrifugeer bij 15.000 rpm gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant weg.

's Nachts drogen bij 37 graden Celsius. Na een incubatie van één nacht, breng je over naar een rek. Voeg een ml zwavelzuur van 67% toe. draaikolk.

Incubeer een uur lang bij 25 graden Celsius met gelijktijdig schudden. Zorg er na een incubatietijd van een uur voor dat de pellet volledig is opgelost. Overzetten naar een rek.

Dit is de laatste stap van de cellulose-extractie. Nu zijn de monsters klaar voor monsterverdunning. Gebruik voor monsterverdunning 10 microliter van elk monster uit de vorige stap en voeg 490 microliter steriel water toe.

Herhaal dit voor alle experimentele monsters. Bereid voor het glucosestandaardcurvepreparaat een verse voorraad van één mg per ml glucose en bereid nul microgram tot 200 microgram concentraties voor door één mg per ml glucose in stappen van 20 microliter toe te voegen en het uiteindelijke volume samen te stellen tot één ml met steriel water. Neem 500 microliter van elke voorbereide standaard in een schroefdopbuis en voeg een ml 0,2% antroposine toe.

En nu zijn de monsters klaar voor antroposofie. Voeg een ml vers bereid antroposofie toe. Meng onmiddellijk door vortexen en breng over op ijs.

Herhaal dit voor alle standaarden en monsters op dezelfde manier. Breng vervolgens gedurende 10 minuten over naar een voorverwarmd blok van 100 graden Celsius. Na 10 minuten incubatie, breng over op ijs en incubeer gedurende vijf minuten op ijs.

Neem na incubatie 200 microliter van elk monster in drie replicaties. Herhaal dit voor zowel standaarden als monsters op dezelfde manier. En een geladen 96-put plaat werd geladen in een Multimode Detector.

Met het Smart Max Pro-programma stellen we de filterinstelling in op 620 nanometer. Plaattype naar 96-well type. Selecteer het hele leesgebied.

Klik op OK. lezen. Lees plaat. U verkrijgt de absorptiewaarden van zowel standaarden als monsters, die worden verzameld in het Excel-blad voor verdere analyse en schatting van het cellulosegehalte.

De glucosestandaardcurve wordt bereid met behulp van de glucoseconcentraties in microgram per ml op de x-as en de genormaliseerde absorptiewaarden van de respectieve concentratie op 620 nanometer op de y-as. We krijgen de regressielijn met m- en c-waarden in de uitgeplotste spreidingsgrafiek die we gebruiken om het kristallijne cellulosegehalte van het monster te schatten. In de eerste stap hebben we de OD-waarden gemiddeld op 620 nanometer.

En toen normaliseerden we de gegevens door de lege waarde af te trekken. We berekenen de glucoseconcentratie met behulp van de formule x is gelijk aan OD minus c/m waarbij we c- en m-waarden van de vorige stap van de regressielijn in de standaardcurve aansluiten. Aangezien het totale volume dat werd gebruikt voor antroposofie 500 microliter is, delen we het door verdunningsfactor twee.

Aangezien het gebruikte monstervolume slechts 10 microliter was, delen we verder door 10 om microgram per microliterconcentratie glucose te krijgen, wat gelijk is aan mg per ml concentratie. En toen gebruikten we de vochtfactor 1.11, de vochttoename in het proces. En ten slotte berekenen we het kristallijne cellulosegehalte van het percentage door het te delen met het celwandgewicht, dat dicht bij vijf mg ligt, en vermenigvuldigen we ons met 100 om het percentage te krijgen.

Vervolgens hebben we het kristallijne cellulosegehalte van drie biologische duplo's gemiddeld om de waarde voor individuele monsters te krijgen, wat zal worden vergeleken met een ander experimenteel lijngemiddelde van drie biologische replica's. En t-test kan worden gebruikt om hun niveau van betekenis te testen. Hier in tabel A tonen we de tabelwaarden van de concentratie en de respectieve OD op 620 nanometer, die verder werd gebruikt om een spreidingsgrafiek en een regressielijn te plotten met de m- en c-waarden die in de C werden gebruikt voor het verkrijgen van de cellulosegehalteverschillen tussen de twee experimentele lijnen.

Concluderend kunnen worden weergegeven dat beide monsters celluloseverschillen vertonen. Bedankt voor het kijken.