Assemblage en werking van een Acoustofluidic-apparaat voor verbeterde levering van moleculaire verbindingen aan cellen

Dit protocol beschrijft de assemblage en werking van een acoustofluidisch systeem dat efficiënt biomoleculen kan leveren voor een verscheidenheid aan onderzoek en celgebaseerde therapeutische toepassingen. Het belangrijkste voordeel van dit systeem is dat het een snelle levering van biomoleculen aan cellen mogelijk maakt met behoud van hun levensvatbaarheid. Het is een platformtechnologie waarmee cellen kunnen worden getransformeerd voor een verscheidenheid aan cellulaire therapeutische toepassingen, zoals kankerbehandeling.

Begin met het combineren van 54 gram PDMS-basis en zes gram uithardingsmiddel in een kopje. Meng krachtig en grondig met een spatel gedurende ten minste één minuut en plaats de beker met de PDMS-oplossing vervolgens ongeveer 30 minuten in een desiccator of totdat de resterende luchtbellen zijn verwijderd. Plaats een fotoresist gecoate wafer met de patronen naar boven in een petrischaal van 150 millimeter en giet de PDMS-oplossing over de mal.

Plaats indien nodig de Petrischaal in een desiccator en breng vacuüm aan totdat de resterende luchtbellen verdwijnen. Breng de Petrischaal over in een laboratoriumoven en bak gedurende twee uur op 60 graden Celsius om het PDMS uit te harden. Verwijder na het uitharden voorzichtig het PDMS uit de Petrischaal door met een scheermesje de randen van de wafel door te snijden.

Knip elk afzonderlijk apparaat uit met een mes of scheermesje en pons vervolgens gaten door de inlaat- en uitlaatpoorten met een biopsiestoot van 2,5 millimeter. Na behandeling van het PDMS-apparaat met zuurstofplasma, plaatst u elk apparaat onmiddellijk op een schone sodakalkglasmicroscoopschuif met kanalen naar het glasoppervlak gericht. Laat de apparaten 's nachts op kamertemperatuur verlijmen.

Breng voorzichtig siliconen aan op het oppervlak van de piëzo-transducer met een diameter van één tot twee millimeter, lijn de transducer vervolgens voorzichtig uit met een concentrische spiraal en druk deze voorzichtig op de onderkant van de glazen microscoopschuif. Sluit een microcontroller aan op een computer met behulp van een USB A-naar-B-kabel. Een groene led-indicator moet branden.

Gebruik de bijbehorende software op de computer om een programma te uploaden dat een acht megahertz-signaal genereert. Soldeer een 1 inch 22 gauge draad aan het uiteinde van elke draad op de PZT transducer. Gebruik het vervolgens om de negatieve aansluitdraad van de PZT-transducer aan te sluiten op een GND-pin.

Sluit de positieve aansluitdraad van de PZT-transducer via de gesoldeerde draad aan op de uitgangspen. Snijd drie tot zes inch secties van tygon PVC zachte plastic buizen en duw de slang in de inlaat- en uitlaatpoorten. Het kan nodig zijn om de slang te draaien terwijl u druk uitoefent totdat deze in de opening past.

Optioneel kan lijm worden aangebracht op de kruising om het PDMS en de slang aan elkaar te lijmen. Monteer eventueel het acoustofluidische apparaat en de microcontroller in een 3D-geprinte behuizing. Monteer het microfluïdische reservoir volgens de instructies van de fabrikant.

Snijd een drie tot zes inch sectie van 1/16 inch binnendiameter tygon PVC zachte plastic buizen en duw het over de 1/32 inch binnendiameter buizen van de microfluïdische reservoir uitgang. Wikkel eventueel de verbinding met paraffinefolie om lekkage te voorkomen. Vul een spuit van 60 milliliter met omgevingslucht aan de zijkant van het microfluïdische reservoir.

Stel de spuitpomp in op een snelheid van 200 milliliter per uur om de oplossingen van het contrastmiddel met een volumetrisch debiet van 50 milliliter per uur door het acoustofluidische apparaat te duwen en de monsters van de uitgang van het apparaat in een centrifugebuis van 50 milliliter te verzamelen. Bereid een fofolipideoplossing in een scintillatieflacon van 20 milliliter door 25 milligram DSPC, 11,6 milligram DSEPC, 0,26 milligram DSPG en 0,88 milligram polyoxyethyleen40stearaat toe te voegen. Voeg chloroform toe totdat alle fosfolipiden zijn opgelost.

Verdamper chloroform gedurende 48 uur in een desiccator om een droge lipidefilm te vormen. Rehydrateer het schuim met 10 milliliter steriel PBS en soniceer vervolgens de lipideoplossing gedurende drie minuten bij 40% amplitude om een kationische micellaire oplossing te vormen. Na sonicatie kan de fofolipideoplossing maximaal een maand bij twee tot zes graden Celsius worden bewaard.

Om ultrasone contrastmiddelen voor te bereiden, voegt u 200 microliter kationische micellaire oplossing in 600 microliter steriele PBS toe aan een glazen septumflacon van twee milliliter. Sluit de flacon af door de dop te krimpen. Gebruik een 1,5 inch 20 gauge naald om de ruimte van de flaconkop gedurende 30 seconden te vullen met decafluorbutaangas.

Voeg de flacon samen tot perfluorbutaangasgevulde ultrasone contrastmiddelen. Voeg 25 microliter ultrageluidcontrastmiddeloplossing per milliliter celoplossing toe. Pomp vervolgens onmiddellijk het gecombineerde contrastmiddel en celmengsel door het acoustofluidische apparaat.

Dit protocol produceert een acoustofluidisch systeem dat kan worden gebruikt om de intracellulaire moleculaire levering in meerdere cellijnen te verbeteren. Intracellulaire toediening van een fluorescerende verbinding, fluoresceïne, aan primaire menselijke T-cellen werd verbeterd met acoustofluidische behandeling in vergelijking met een onbehandelde controlegroep. De fluorescentie-intensiteit van T-cellen nam na de behandeling vervijfvoudigd, wat wijst op een verbeterde afgifte van fluoresceïne.

De levensvatbaarheid van cellen nam licht af na een acoustofluidische behandeling, maar bleef boven 80% Acoustofluidische behandeling verbeterde intracellulaire toediening van een conserveermiddelverbinding trehalose aan menselijke A549 longcarcinoomcellen in vergelijking met de stroom alleen en naar cellen in de onbehandelde controlegroep. Het toevoegen van de kationische microbubbels aan de celoplossing is van cruciaal belang. Intracellulaire toediening van biomoleculen zal beperkt zijn zonder kationische microbubbels in oplossing.

Dit platform maakt intracellulaire levering van verschillende biomoleculen mogelijk, die de cellulaire functie voor onderzoek of therapeutische doeleinden kunnen veranderen. Na het voltooien van deze procedure kan extra cellulaire karakterisering worden uitgevoerd om de impact van het leveren van verschillende biomoleculen te evalueren.