Live imaging met hoge doorvoer van microkolonnies om heterogeniteit in groei en genexpressie te meten

Ons protocol voor hoge doorvoer, gistcellen maakt het mogelijk om groei en genexpressie voor duizenden microkolonies tegelijkertijd te volgen. Verschillen tussen stammen, tussen omgevingen en zelfs tussen genetisch identieke cellen die in een gedeelde omgeving worden gekweekt, kunnen worden gekwantificeerd. Het protocol levert nauwkeurige schattingen op van de gemiddelde groeisnelheid en gemiddelde fluorescentie-intensiteit van genexpressieverslaggevers.

Bovendien, omdat zoveel individuele microkolonnies worden afgekeurd, worden nauwkeurige schattingen van volledige verdelingen van groei- en expressiewaarden verkregen. Dit protocol volgt twee hoofdstappen, de voorbereiding van de experimentele plaat en de voorbereiding van de cellen voor beeldvorming. De cellen moeten onmiddellijk na verdunning en vermenging worden geplateerd.

We raden u dus aan om eerst uw experimentele plaat in te stellen. U zult merken dat cellen in dit protocol herhaaldelijk worden gemengd, wat uiterst belangrijk is in de stappen tot aan het plateren. Op de dag van het experiment moeten alle media en andere oplossingen die voor de test worden gebruikt, worden gefilterd met een filter van twee micron, zelfs als ze al steriel zijn, om kristallen te verwijderen die in microscoopafbeeldingen kunnen verschijnen.

Dit omvat experimentele media en de Concanavalin A-oplossing. Bereid vervolgens de microscoopplaat voor. Om het glasoppervlak van de putten vrij te houden van vuil en krassen, moet u altijd een pluisje en statisch vrij doekje onder de plaat houden.

Gebruik steriele techniek op een gesteriliseerde bank. Filter 25 milliliter 1X Concanavalin A oplossing en pipet 200 microliter in elke put van de microscoopplaat. We raden aan om de pipet te stabiliseren om de juiste hoogte te garanderen.

Centrifugeer de microscoopplaat met een pluisje en een statisch vrij doekje eronder gedurende twee minuten bij 411 keer G om eventuele luchtbellen te verwijderen die kunnen voorkomen dat Concanavalin A de bodem van de putten gelijkmatig bedekt. Laat de plaat met de Concanavalin A-oplossing één tot twee uur rusten. Wees consistent in je experimenten.

Na de Concanavalin A incubatie, ontruim de Concanavalin A van de 96 put plaat ofwel met een zuiginrichting of door krachtig dumpen van de oplossing uit de plaat zoals hier getoond. Er zullen nog wat druppels overblijven. Was vervolgens de putten door 400 microliter steriel water aan elke put toe te voegen.

Voeg het water onmiddellijk na het verwijderen van de Concanavalin A-oplossing toe. Laat de plaat niet droog zitten. Het is belangrijk om de gecoate bodem van de plaat niet aan te raken met de pipetpunten om Concanavalin A niet van het glasoppervlak van de putten te verplaatsen of te verwijderen.

Verwijder het water op dezelfde manier als de Concanavalin A-oplossing en voeg onmiddellijk 185 microliter experimentele media toe aan uw microscoopplaat. Laat de plaat niet droog zitten. De plaat is nu klaar voor de toevoeging van 50 microliter verdunde cellen.

Haal je voorgekweekte gerandomiseerde 96-well plaat op. Uw experimentele vraag zal bepalen of de cellen verzadigd of in logfase zijn en het aantal gerandomiseerde replica's dat in de test moet worden gebruikt. Centrifugeer uw plaat gedurende twee minuten op 411 maal G om de kans op kruisbesmetting te minimaliseren bij het verwijderen van de foliebekleding.

Zorg ervoor dat u uw plaat nooit kantelt wanneer u ermee omgaat. Als gist en media in contact komen met de folie die de plaat bedekt, kan er verontreiniging zijn in putten. Bereid eerst de platen waar u uw seriële verdunningen in geleidt.

Voeg 90 microliter experimentele media toe aan elk van uw verdunningsplaten. Bereid vervolgens je cellen voor. Wees uiterst voorzichtig bij het verwijderen van de folie van uw 96-put plaat om te voorkomen dat druppels uit de ene put in de andere komen.

De gist wordt geconcentreerd op de bodem van de plaat als gevolg van centrifugeren. Om ervoor te zorgen dat cellen goed worden gemengd tijdens uw verdunning, voegt u altijd een klein volume cellen toe aan een groter volume media. Voeg vervolgens nog een grote hoeveelheid media toe aan het mengsel.

Zorg ervoor dat je bij elke stap krachtig pipetmixt. In deze video hebben we verdunningen uitgevoerd voor gistcellen bij verzadiging en synthetische complete media, die we 10.000 keer zullen verdunnen om een uiteindelijke concentratie van ongeveer 4.000 cellen per put in de microscoopplaat te bereiken. Om de cellen opnieuw op te hangen, pipet op en neer krachtig en beweeg de pipet tip rond de put in een cirkelvormige beweging.

Na het mengen mogen er geen sporen van bezinkte gist achterblijven in een put zoals hier te zien is in put A1. Alle andere putten die hier worden getoond, zijn niet opnieuw opgeschort voor vergelijking. Tel de cellen in je voorgekweekte plaat, bijvoorbeeld met de hemocytometer, en combineer met elke andere soort die je in gelijke verhoudingen aan dezelfde put toevoegt. Hier mengen we de cellen van onze voorgekweekte plaat met een fluorescerende referentiestam in een verhouding van één op één.

Zodra uw celconcentraties zijn gestandaardiseerd, voegt u tien microliters cellen toe aan de eerste seriële verdunningsplaat. Voeg vervolgens 100 microliter media toe aan een eindvolume van 200 microliters. Met de toevoeging van zowel cellen als media mengt pipet krachtig en beweegt de pipetpunt in een cirkelvormige beweging rond de putten.

Vanaf dit punt, totdat de cellen aan de microscoopplaat worden toegevoegd, gaat u snel door het protocol. Voeg vervolgens tien microliters gist van de eerste seriële verdunningsplaat toe aan de tweede seriële verdunningsplaat. Voeg daar vervolgens 100 microliters experimentele media aan toe.

Meng goed. Als uw gist niet de neiging heeft om te flocculeren, dan zijn ze klaar om direct na deze stap aan de microscoopplaat te worden toegevoegd. Ga onmiddellijk verder met plateren.

Als de giststammen die u gebruikt echter een matige neiging hebben om te flocculeren, is de volgende optionele sonicatiestap noodzakelijk. Als soniceren, eerste pipet meng de gistoplossing opnieuw, vóór de sonicatie. Plaats de verdunde gist op de sonicator en dompel de 96-putpennen onder in de oplossing van elke put, maar raak de bodem van de put niet aan.

Stel het sonicatieprogramma in, dat voldoende sterk is om gevloculeerde gistcellen uit elkaar te breken, maar geen cellen doodt of verhoogde stressreacties veroorzaakt. Sommige tests kunnen nodig zijn om het beste sonicatieprogramma voor een bepaald experiment te identificeren. Zodra het programma is voltooid, verwijdert u de cellen en gaat u onmiddellijk verder met de volgende stap.

Voeg 15 microliters gist van de tweede seriële verdunningsplaat toe aan de microscoopplaat. Pipetteer op en neer om te mengen, maar doe dit voorzichtig om te voorkomen dat de Concanavalin A aan de onderkant van de putten van de plaat wordt verstoord. Voeg vervolgens 200 microliters experimentele media toe aan een eindvolume van 400 microliter, aan de microscoopplaat.

Pipet mix voorzichtig. Bedek de plaat met een ademend membraan. Zorg ervoor dat de randen van de plaat goed zijn afgedicht.

Centrifugeer de microscoopplaat met een pluisje en statisch vrij weefsel eronder gedurende twee minuten bij 411 keer G, zodat de gistcellen zich aan de Concanavalin A aan de onderkant van de plaat kunnen hechten. De plaat is nu klaar om in beeld te worden gebeeld. Veeg bij de microscoop de boven- en onderkant van de plaat af met een pluisje en statisch vrij doekje en blaas perslucht op de bodem van de plaat om vuil te verwijderen.

Plaats de plaat op de microscoop. Zorg ervoor dat de A1-put zich in de linkerbovenhoek bevindt en dat de microscoop wordt verwarmd tot de juiste temperatuur voor celgroei. Zorg er ook voor dat de plaat netjes in de microscoop is weggestopt en dat de onderkant van de plaat plat is.

Als de plaat een plastic deksel heeft, verwijder deze dan voordat u met de microscopie begint. Dit is belangrijk om goede beelden vast te leggen voor downstream-analyse. We laden een automatisch gegenereerd bestand met de X- en Y-coördinaten en de brandpuntsposities om de hele microscoopplaat in beeld te plaatsen.

Als u een vooraf gegenereerd bestand gebruikt, controleert u een paar posities in de microscoopplaat om er zeker van te zijn dat cellen zich in het juiste brandpuntsvlak bevinden. Het is handig dat het brandpuntsvlak iets boven de cellen ligt, zodat ze worden omgeven door een donkere rand en ze helderder zijn dan de achtergrond. Stel het aantal tijdspunten en de tijdsafstand in die u voor het experiment wilt gebruiken.

Als u zowel groeisnelheids- als fluorescentie-intensiteitsgegevens verzamelt, stelt u ook een fluorescentiebeeldvormingsprogramma in. Pas de helderheid in elk te bebeelden kanaal aan, zodat er geen positie op de microscoopplaat overbelicht is. Test de belichting die u gebruikt wanneer u zich niet in de livemodus bevindt.

Voor fluorescerende beelden moet fluorescentie zichtbaar zijn voor het blote oog. Maar anders raden we aan om lage belichtingswaarden in te stellen. Op de juiste manier verdeelde kolonies gezaaid door individuele cellen groeien in een monolaag langs het oppervlak van de plaat.

Als gevolg hiervan kan geautomatiseerde beeldanalyse worden gebruikt om de groeisnelheid voor veel individuele microkolonen nauwkeurig te berekenen. Fluorescerende markers kunnen worden gebruikt om meerdere soorten te onderscheiden die in dezelfde put groeien. Als gevolg hiervan kunnen volledige verdelingen van groeipercentages voor individuele microkolonen die in een gedeelde omgeving groeien, worden berekend.

De grote steekproefgroottes die met dit experiment kunnen worden haalbaar, maken het ook mogelijk om de gemiddelde verschillen tussen verschillende stammen of groeiomstandigheden nauwkeurig te schatten. Hier worden groeipercentages getoond voor gepaarde sets kolonies die in enkele putten worden gekweekt uit een reeks mutatieaccumulatielijnen en de in-well GFP-referentiecontrolekolonies. Als cellen worden waargenomen die op de microscoopplaat klonteren, moeten de klonters worden afgebroken door sonicatie voorafgaand aan het plateren.

Cellen in klonten die niet worden afgebroken, groeien niet in een planaire microkolonie langs het plaatoppervlak, waardoor een correcte berekening van de groeisnelheid onmogelijk wordt. Niet alle media zijn compatibel met de microkoloniale groeisnelheidstest. Sommige vormen van media, waaronder media die gistextract bevatten of een lage pH hebben, voorkomen binding van cellen aan Concanavalin A.Dit resulteert in cellen die wegdrijven van groeiende microkolonnies in de loop van het experiment en een foutieve groeisnelheidsmetingen.

Het is belangrijk om te voorkomen dat cellen te dicht worden geplat. Wanneer cellen te dicht worden geplateerd, versmelten sneller groeiende microkolonies op eerdere tijdstippen, hier weergegeven als een verlies van kleurtracking. Dit effect kan de groeisnelheid schatten, omdat langzaam groeiende kolonies minder kans hebben om samen te smelten met hun buren voordat gegevens van voldoende tijdspunten worden verzameld.

Afhankelijk van de groeiomstandigheden kan een subset van cellen een vertragingsfase ondergaan voordat ze beginnen te groeien. Het is belangrijk om hier rekening mee te houden bij het gebruik van koloniegebieden om de groeisnelheid te berekenen in plaats van een groeicurve aan te passen aan alle beschikbare tijdspunten. Het beschreven protocol kan worden gebruikt om een breed scala aan vragen met betrekking tot gistgroei en evolutie te onderzoeken.

Het flexibele microplaatformaat betekent dat het kan worden aangepast aan andere gistsoorten, verschillende groeiomstandigheden, andere microben en mogelijk andere cellen in de cultuur.