Een stapsgewijze handleiding voor muggenelektroantennografie

Voor elektroantennografie is het gebruik van muggen in een specifieke en consistente fysiologische status van cruciaal belang om betrouwbare resultaten te verkrijgen. Het stapsgewijze protocol zorgt voor blijvende elektroantennografische opnames bij muggen. De methode kan worden gebruikt bij verschillende muggensoorten en bij zowel mannetjes als vrouwtjes.

De elektroantennografische techniek kan ook worden getransponeerd naar andere insectenmodellen, waaronder kevers, vliegen, kussende insecten en mieren. Verwijder om te beginnen de 1,5 milliliter amberkleurige injectieflacons met de geurmengsels en een oplosmiddelcontrole uit de vriezer van 20 graden Celsius waarin ze zijn opgeslagen om degradatie te voorkomen. Pipetteer vervolgens 10 microliter van de geuroplossing op een stuk filterpapier dat in een gelabelde glazen spuit is geplaatst.

Isoleer de muggen op de dag van het experiment. Werk onder de microscoop en breek voorzichtig de punt van twee borosilicaatcapillairen met filamenten met behulp van een tang. Voordat u de elektroantennografie of het EAG-experiment uitvoert, moet u ervoor zorgen dat de elektrodehouders van binnen vrij zijn, zonder borosilicaatvuil.

Voer vervolgens chloridisatie uit door de zilveren draden van de elektrodehouders gedurende vijf minuten in zuiver bleekmiddel te weken, totdat de draden donker, matgrijs worden. Spoel vervolgens de draden af. Maak de rubberen stop los en gebruik een naald van 20 gauge om de binnenkant van het capillair te vullen met een zoutoplossing.

Spoel de haarvaten af en steek de draden in de twee haarvaten. Houd de punt van de draad minder dan een millimeter van de punt van het capillair. Haal het capillair door de rubberen ring in de elektrodehouder zonder deze te breken en draai de rubberen stop voorzichtig vast, nadat je hebt gecontroleerd of er geen luchtbellen aanwezig zijn.

Gebruik het capillair met de bredere opening op de referentie-elektrodehouder en de kleinere opening op de opname-elektrodehouder. Laat de twee gemonteerde elektrodehouders op een nat reinigingsdoekje zitten om te voorkomen dat de punt uitdroogt totdat u klaar bent om de kop te monteren. Zorg ervoor dat de luchttafel omhoog is.

Er is geen blokkade in de luchtvaartmaatschappij en de lucht staat aan. Controleer of de tank met medische lucht vol is om te voorkomen dat deze in het midden van het experiment wordt vervangen en bevestig bubbels in de luchtbevochtiger. Schakel de computers, de softwaretoepassingen en de voeding van de klep in.

Nadat u de internetverbinding hebt gecontroleerd, geeft u een besturingspuls om te controleren of de klep die de pulsen levert, functioneel is. Leg een aluminium plaat op ijs met een stuk nat reinigingsdoekje eroverheen en leg een klein kloddertje elektrodegel in een hoekje. Plaats een muggenbeker op ijs om de mug te laten afkoelen.

Knip de punt van elke antenne van de mug met een microschaar. Gebruik een tang om de mug naast de elektrodegel te slepen en dompel de punt van elke antenne voorzichtig in de gel. Trek met een tang de muggenantennes eruit, terwijl je ze naast elkaar houdt.

Hak de kop van de mug met een microschaar. Dompel de punt van de referentie-elektrode voorzichtig in de gel en plaats deze in contact met de nek, zodat het hoofd eraan blijft plakken. Plaats de referentiekopelektrode op een micromanipulator.

Sluit beide elektrodehouders aan op de versterker. Gebruik de micromanipulator om de opname-elektrode zo dicht mogelijk bij de antennepunten te plaatsen. Plaats vervolgens de antennetips in de opname-elektrode.

Plaats de vliegtuigslang dicht bij het muggenkoppreparaat, op één centimeter. Schakel de versterker en de ruisregelaar in en zorg ervoor dat het basissignaal niet luidruchtig is. Zodra het geluidsniveau bevredigend is, steekt u de eerste geurspuit in het gat van de luchtvaartmaatschappij om de test uit te voeren en sluit u de kooi van Faraday.

Klik vervolgens op opnemen in de EAG-software om de puls af te leveren. Meet EAG-responsen als amplitude in millivolts en ga dan verder met de volgende geur of concentratie. Het experiment toont met succes aan dat muggensoorten variabele olfactorische reacties op verschillende chemicaliën kunnen vertonen.

Er was een gebrek aan reactie op de minerale olie, die werd gebruikt als een negatieve controle. Fouten in de resultaten als gevolg van elektrische ruis kunnen worden verminderd door de elementen naar de kooi van Faraday te aarden, met behulp van krokodillenklemmen. De responsdrempel op dezelfde geurstof kan variëren in grootte voor verschillende soorten muggen.

Toxorhynchites rutilus septentrionalis-muggen produceren bijvoorbeeld zeer grote EAG's, vergeleken met Aedes aegypti, Anopheles stephensi en Culex quinquefasciatus. Een grote afbuiging als reactie op de positieve controle, benzaldehyde, werd opgemerkt. Terwijl er een gebrek aan reactie was op de negatieve controle, minerale olie.

Deze gemiddelde antennereacties worden weergegeven in een staafdiagram. Bovendien werd de drempel voor het detecteren van een specifieke chemische stof voor elke muggensoort bepaald door de antenne, de toenemende concentraties van de chemische stof te presenteren en een dosisresponscurve uit te zetten. Het is belangrijk om de opname zo snel mogelijk te starten nadat de kop is gehakt en gemonteerd, om een grote responsiviteit van de voorbereiding te garanderen.

EAG maakt het mogelijk om te bepalen of de muggenantennes reageren op een bepaalde chemische stof bij een bepaalde concentratie. Het maakt het echter niet mogelijk om de balans van deze chemische stof te bepalen. Bijvoorbeeld of het een lokstof of bekering is.