Serial Block-Face Scanning Electron Microscopie (SBF-SEM) van biologische weefselmonsters

Seriële blok-gezicht scanning elektronenmicroscopie biedt een ongekend beeld van driedimensionale weefsel ultra structuren, en kan een groot aantal vragen beantwoorden die voorheen onmogelijk of buitengewoon moeilijk na te streven. Deze techniek maakt de snelle en reproduceerbare productie van driedimensionale datasets mogelijk met minimale weefsellading en artefacten. En wat belangrijk is, het maakt het mogelijk om dagelijks duizenden afbeeldingen automatisch vast te leggen.

Standaard transmissie elektronenmicroscopie biedt een uitstekende cellulaire ultrastructuur. Deze beelden missen echter een driedimensionale context en kunnen moeilijk te interpreteren zijn. Seriële blok-gezicht scanning elektronenmicroscopie biedt die driedimensionale context, waardoor de interpretatie van complexe processen mogelijk is.

Hoewel dit protocol betrouwbaar en reproduceerbaar is, vereisen bepaalde stappen precisie en zijn ze van cruciaal belang voor het succes van deze methodologie. Deze video zal deze kritieke stappen in detail demonstreren. Na het fixeren van monsters in 0,1 molaire natriumcacodylaatbuffer, die 2,5% glutaraldehyde en twee millimollar calciumchloride bevat, moeten de monsters in blokken van niet meer dan twee millimeter in blokjes worden gesneden en worden gewassen met 0,1 molaire natriumcacodylaatbuffer die twee millimollar calciumchloride bevat.

Het weefsel wordt vervolgens opeenvolgend gekleurd met osmium ferrocyanide, thiocarbohydrazide en osmiumtetroxide. Na osmiumtetroxide incubatie, behandel het weefsel met 1%waterig uranylacetaat bij vier graden Celsius 's nachts. Los de volgende ochtend 0,066 gram loodnitraat op in 10 milliliter 0,03 molaire asparaginezuuroplossing en gebruik één normaal kaliumhydroxide om de pH van de lood aspartaatoplossing van de Walton aan te passen aan 5,5.

Na het opwarmen van de oplossing in de oven, was het weefsel vijf keer gedurende drie minuten per wasbeurt in kamertemperatuur, dubbel gedestilleerd water, voordat u het weefsel overbrengt in een 60 graden Celsius verwarmde Walton's lood aspartaatoplossing gedurende 30 minuten op 60 graden Celsius. Was aan het einde van de incubatie het weefsel en droog het uit in een oplopende, ijskoude acetonreeks, gevolgd door een incubatietijd van 10 minuten in aceton op kamertemperatuur. Plaats vervolgens het weefsel in een verhouding van 1:3 van hard-gemengde hars in aceton gedurende vier uur infiltratie op een roterend platform, gevolgd door een infiltratie van acht uur of 's nachts in een 1:1 verhouding hars tot acetonoplossing op een roterend platform, vervolgens een nachtelijke infiltratie in een 3:1 verhouding van hars tot aceton op het roterende platform.

Infiltreer de volgende ochtend het weefsel in verse 100% hars gedurende één vier tot acht uur, één nacht en één infiltratie van vier uur bij kamertemperatuur op een roterend platform. Gebruik de volgende ochtend een houten stok om een kleine hoeveelheid hars te mengen met koolstofzwart poeder totdat de hars verzadigd is met het poeder, maar nog steeds vloeibaar is en niet korrelig wordt. De woning moet op dikke inkt lijken en langzaam kunnen druppelen zonder zichtbare klonten Plaats het weefselmonster in een siliconenrubberen mal en leg een afbeelding vast voor latere verwijzing naar de oriëntatie van het monster in het harsblok.

Wanneer het monster op zijn plaats is, bedekt u het weefsel in de koolstofzwarte verzadigde hars aan de punt van de siliconenvorm, met het etiket dat de experimentele en weefseldetails in de mal aan de andere kant van de hars aangeeft. Plaats vervolgens de mal ongeveer een uur in een oven van 65 graden Celsius op een helling. Wanneer de koolstofzwarte hars voldoende is uitgehard, verwijdert u de mal uit de oven en begint u met een lege put, vult u de rest van de mal met heldere hars, waarbij u ervoor zorgt dat het etiket zichtbaar blijft.

Wanneer het monster is bedekt met heldere hars, plaatst u de siliconenvorm gedurende 48 uur terug in de oven van 65 graden Celsius, niet op een helling, en verwijdert u vervolgens de mal. Om het blok voor te bereiden op beeldvorming, plaatst u het met hars ingebedde monster op een microtome-boorkop met het taps toelopende uiteinde ongeveer vijf tot zes millimeter uit de boorkop. Vergrendel het monster op zijn plaats met de ingestelde schroef en plaats het monster onder een warmtelamp.

Plaats de boorkop na enkele minuten in een stereomicroscoophouder en gebruik een nieuw, dubbelzijdig scheermesje om dunne secties parallel aan het blokvlak te maken totdat het weefsel zichtbaar is, wat minder reflecterend en korrelig zal zijn in vergelijking met de delen van de hars die verstoken zijn van weefsel. Bevestig een aluminium monsterpen in de trimpenhouder en maak verschillende diepe, kriskras krassen in het gezicht van de pin om een groter oppervlak te bieden voor de lijm die wordt gebruikt om het monster op zijn plaats te houden. Plaats het monster onder een warmtelamp en duw het scheermes één tot twee millimeter recht naar beneden in het harsblok voordat u een tweede, loodrechte snede van gelijke diepte in het blok maakt, om de overtollige hars van het weefselmonster weg te snijden, zodat het blok ongeveer drie millimeter in diameter is met twee tot drie millimeter hoog.

Verwarm na deze eerste trimming het blok opnieuw onder de warmtelamp en gebruik een nieuw, dubbelzijdig scheermesje om de bovenkant van het harsblok ongeveer een millimeter onder het bijgesneden gedeelte af te snijden in een enkele, gladde snede. Plaats de trimpenhouder, die de gesneden aluminium pen bevat, in de stereomicroscoophouder en breng een dunne laag cyanoacrylaatlijm aan op het penvlak, zodat deze de pin volledig bedekt zonder een zichtbare meniscus te vormen. Gebruik de tang om het bijgesneden stukje weefselblok enkele seconden op het midden van de voorkant van de monsterpen te drukken en laat de lijm enkele minuten intrekken.

Wanneer de lijm grondig is gedroogd, zoekt u het weefsel op het verhoogde deel van het harsblok en gebruikt u een tweesnijdend scheermes om het verhoogde deel van de hars met het weefselmonster te trimmen tot een gebied dat niet groter is dan een vierkante millimeter. Verwijder langzaam en voorzichtig zoveel mogelijk overtollige hars, laat het blok iets langer in één dimensie achter en gebruik een laatste metalen vijl om de overtollige hars in het gebied buiten het verhoogde gedeelte met het weefselmonster naar beneden naar de rand van de pen te kantelen. Verwijder harsdeeltjes en stof uit het voorbereide monster voordat u een dunne laag zilververf en goud sputtert op het gehele oppervlak van het monsterblok.

Knip na het coaten overtollige zilververf van de blokvlakoppervlakken en plaats het gemonteerde en bijgesneden blok in het bolvormige uiteinde van een op maat gemaakte transferpipetbuis met het juiste label bevestigd. Met behulp van SBF-SEM-beeldvorming is een netwerk van elastinevrije microfibrilbundels geïdentificeerd in het volwassen muis hoornvlies. Dit netwerk is georganiseerd in verschillende lagen, met de vezels nauw verbonden met keratocyten, zelfs liggend in ondiepe invaginaties op het keratocytoppervlak.

Toepassing van dit protocol heeft geleid tot de ontdekking van een voorheen onbekende populatie van centrale hoornvlieszenuwen die fuseren met basale epitheelcellen aan de stromal-epitheliale grens. SBF-SEM-beeldvorming van het centrale hoornvlies onthult de aanwezigheid van limbale vasculatuur, zenuwbundels en bijbehorende cellen die handmatig kunnen worden gesegmenteerd voor 3D-reconstructie. Enkele valkuilen van deze beeldvormingsprocedure zijn het gebruik van een te lange pixel-verblijftijd, waardoor volgende beelden golvend en vervormd kunnen zijn, kleine ontladingen van elektronen uit het blokvlak, wat leidt tot snelle contrastveranderingen in lijnen, krassen van messen op het blokvlak als gevolg van een beschadigd mes of ophoping van vuil aan de rand van het mes , artefacten van een uitgebreide elektronenbundel richten zich op het blokvlak terwijl het monster zich nog in de beeldkamer bevindt, onjuiste weefselfixatie, wat leidt tot de scheiding van cellulaire structuren en bindweefsel, en beeld overslaan als gevolg van een grote hoeveelheid opladen in het weefsel of harsblok.

Bij het snijden van het weefselblok is het belangrijk om een goed begrip te hebben van waar het weefsel in het blok ligt, om niet per ongeluk belangrijke monstergebieden weg te knippen. Als beelden met een hogere resolutie van specifieke cellulaire structuren of interacties gewenst zijn, kan de beeldvorming worden gestopt, het blok uit de microscoop worden verwijderd en secties op een ultramicrotome worden gesneden waar ze kunnen worden bekeken in een transmissie-elektronenmicroscoop Seriële blok-gezicht scanning elektronenmicroscopie maakt een geheel uniek beeld van biologische weefsels mogelijk. Met behulp van dit protocol zijn we in staat geweest om snel hoogwaardige datasets te verkrijgen en het bereik van weefsels dat we kunnen verkennen uit te breiden.