Name: Karakterisering van een nieuwe menselijke organotypische retinale cultuurtechniek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Ontdek een nieuwe menselijke organotypische retinale cultuurtechniek met behoud van alle retinale lagen en ondersteunende weefsels. Deze methode minimaliseert structurele schade en maakt klinisch relevant ziekteonderzoek en testen van nieuwe therapeutische middelen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de gulle gevers van oogweefsels en het team van de Nieuw-Zeelandse National Eye Bank bedanken voor hun steun. Dit werk werd financieel ondersteund door projectsubsidies van de Maurice and Phyllis Paykel Trust en de Auckland Medical Research Foundation (1117015). Het directeurschap van IDR wordt ondersteund door de Buchanan Charitable Foundation. De beurs van CK wordt verstrekt door de New Zealand Association of Optometrists Education and Research Fund (CC36812) en de beurs van HHL wordt verstrekt door de Buchanan Charitable Foundation.

Menselijke donoroogcups werden verkregen van de Nieuw-Zeelandse National Eye Bank na cornea-excisie voor transplantatie en zoals goedgekeurd door de Northern B Health and Disability Ethics Committee (NTX/06/19/CPD/AM07).
OPMERKING: De kweek moet worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast van klasse II om steriele weefselkweekomstandigheden te garanderen. De weefsels moeten binnen 24 uur postmortem worden gekweekt om significant verlies van retinale integriteit te voorkomen.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62046/62046fig02.jpg"> Figuur 2: Afbeeldingen van de procedure voor het verzamelen van de sandwich retinale explantaten. Gebruik voor de voorbereiding van de explant een ontleedschaar met één scherpe punt en één stomp uiteinde, waarbij het stompe uiteinde naar de binnenkant van de wereldbol is gericht om weefselschade tijdens de incisie te verminderen. Gebruik ook een tang met stompe uiteinden om krassen op de intraoculaire weefsels tijdens het hanteren te voorkomen. Met behulp van een chirurgische schaar, met het stompe uiteinde naar binnen gericht, knipt u langs de limbus om de iris en lens te verwijderen(A-C). De ONH kan worden gelokaliseerd als u recht in de geopende oogschelp(D)kijkt. Gebruik een tang met stompe uiteinden en houd de sclera vast om de wereldbol(E)te stabiliseren. Verdeel de bol verticaal in twee helften door twee diepe incisies naar de ONH te maken, maar snijd niet door de ONH. Herhaal dit langs de horizontale meridiaan (G). Breng stompe tang aan op de sclera en open de wereldbol voorzichtig naar een klavervorm(H-K). Gebruik een tang om het glasvocht zorgvuldig te manipuleren om het gevouwen netvlies glad te maken, omdat het glasvocht aan het netvlies trekt, maar raak het netvlies niet direct aan (I). Verwijder het glasvocht als het netvliesloslating of vouwen veroorzaakt (niet weergegeven in figuur 2 omdat het transparante glasvocht niet goed is vastgelegd op foto's). Zoek gebieden waar het netvlies plat is en extraheer retinale explantaten met behulp van een chirurgische trephine(L). Breng een tang aan op de sclera en breng de retinale explantaten voorzichtig over in het vooraf bereide kweekmedium (M, N). De hele sandwich explant moet naar de bodem van de put zinken vanwege het gewicht, daarom wordt elke explant ondergedompeld in het medium (O). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62046/62046fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
1. Extractie van de sandwich retinale explantaten uit de oogschelp
<ol><li>Verwijder de iris en lens.<ol>
<li>Plaats de oogschelp in een petrischaal, met de iris en lens naar boven gericht en de oogzenuwkop (ONH) in contact met de petrischaal(figuur 2A).</li>
		<li>Houd de oogschelp stabiel bij de limbus met behulp van een tang(figuur 2B).</li>
		<li>Maak de iris en lens los door kleine sneden te maken langs de buitenrand van de limbus (figuur 2A).</li>
		<li>Verwijder de iris en lens voorzichtig. Vermijd verstoring van het netvlies tijdens manipulatie(figuur 2C). OPMERKING: De lens zal niet in de oogschelp vallen omdat deze via zonulevezels aan het ciliaire lichaam is bevestigd.</li>
	</ol></li>
	<li>Druk de oogschelp plat.<ol>
<li>Met de oogschelp nog steeds rechtop zittend, identificeert u de ONH. Dit is gemakkelijker met een helderwitte lichtbron(Figuur 2D).</li>
		<li>Insnijden bij de vier kwadranten naar de ONH (Figuur 2E). De petrischaal kan worden gedraaid voor eenvoudiger gebruik. Knip de ONH NIET door.</li>
		<li>Verdeel en vlak de oogschelp voorzichtig uit (figuur 2E).</li>
		<li>Breng de tang aan op de sclera in plaats van op het netvlies om te voorkomen dat de integriteit van het netvlies wordt verstoord. OPMERKING: Perifere netvliesloslating en plooiing is onvermijdelijk, omdat het gewicht van het overvolle glasvocht aan het netvlies zal trekken. Verwijder in deze gebieden het glasvocht om verdere netvliesplooiing te voorkomen. Vergeet niet om resterend glasvocht te laten om het netvlies bovenop het RPE-vaatvlies en sclera te stabiliseren.</li>
	</ol></li>
	<li>Verzamel sandwich retinale explantaten.<ol>
<li>Plaats een chirurgische trephine op het netvlies in een gebied zonder retinale plooien (figuur 2F).</li>
		<li>Druk hard om de sclera binnen te dringen, wat een krakend geluid zou moeten genereren.</li>
		<li>Draai de trephine met 180° om ervoor te zorgen dat de sclera volledig is doordrongen, zodat de retinale explant nu wordt gescheiden van het resterende weefsel.</li>
		<li>Breng de tang aan op de sclera en breng de sandwich retinale explant over naar het kweekmedium (Figuur 2G-I).</li>
		<li>Verkrijg 2-3 sandwich retinale explantaten uit het perifere netvlies van elk kwadrant. OPMERKING: De sandwich retinale explant kan soms vastzitten in de opening van de trephine. Gebruik een tang om voorzichtig een klein deel van de basis van de sclera uit te pluizen. Dit gebeurt vaker wanneer het mes stomp is en verlies van het netvlies kan veroorzaken(figuur 3A-C).</li>
		<li>Gebruik een nieuwe trephine na het uitsnijden van 1-2 retinale explants omdat het mes gemakkelijk bot wordt(Figuur 3C<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62046/62046fig03.jpg"> Figuur 3: Problemen oplossen. Tijdens het extractieproces kan de retinale explant worden gevangen bij de opening van de chirurgische trephine(A). Plaag het weefsel voorzichtig uit de basis van de sclera zonder het netvlies aan te raken(B). Dit kan vaker gebeuren als de chirurgische trephine wordt gebruikt voor het extraheren van meer dan twee retinale explantaten, omdat het mes gemakkelijk stomp(C)kan worden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62046/62046fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
</li>
	</ol></li>
	<li>Kweek de retinale explantaten.<ol>
<li>Bereid het kweekmedium met Dulbecco's Modified Eagle Medium voedingsmengsel F-12 (DMEM-F12) en een 1x antibiotica- en antimycoticamengsel (AA, 100x bouillon).</li>
		<li>Plaats voorafgaand aan de explantextractie 500 μL medium in de putten van een 24-well plaat en equilibrate in de incubator. Dit is belangrijk omdat het toevoegen van het medium daarna het netvlies kan losmaken.</li>
		<li>Kweek de sandwich retinale explantaten bij 37 °C gedurende maximaal 72 uur in een bevochtigde 5% CO2-incubator in medium bereid in stap 1.4.2.</li>
		<li>Om DR-achtige veranderingen te induceren, kweek retinale explantaten in medium dat DMEM-F12 bevat met een combinatie van 32,5 mM HG met Cyt, TNF-α (10 ng / ml) en IL-1β (10 ng / ml).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Paraffine-inbedding van de sandwich retinale explantaten
<ol><li>Fixeer de sandwich retinale explants.<ol>
<li>Dompel de sandwich retinale explantaten onder in 10% formaline gedurende ten minste 24 uur.</li>
		<li>Verwijder de formaline-oplossing en breng de retinale explantaties van de sandwich voorzichtig over in tissuepads en cassettes.</li>
		<li>Week de sandwich retinale explants minstens 24 uur in 70% ethanol.</li>
		<li>Paraffine-embed retinale explantaten in blokken.</li>
		<li>Snijd paraffine-ingebedde retinale weefsels in 5 μm dikke secties met behulp van een microtoom en monteer op glazen dia's. Bewaren bij kamertemperatuur totdat het wordt afbeeld.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deparaffinize secties.<ol>
<li>Dompel de secties gedurende 5 minuten onder in 70% xyleen.</li>
		<li>Dompel de secties gedurende 5 minuten onder in 100% xyleen.</li>
		<li>Rehydrateer de secties in 70% ethanol gedurende 5 min.</li>
		<li>Rehydrateer de secties in 100% ethanol gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Was de secties gedurende 10 minuten onder stromend leidingwater.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Karakterisering met behulp van H & E, IHC en een magnetische Luminex-test
<ol><li>H & E-kleuringsprotocol<ol>
<li>Deparaffiniseer de secties met stap 2.2.</li>
		<li>Hydrateer de secties in leidingwater gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Kleur de secties in Gill's 2 hematoxyline-oplossing gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Was de secties grondig onder stromend leidingwater om overtollige vlekken te verwijderen.</li>
		<li>Onderscheid door de secties twee keer in 1% zure alcohol te dippen.</li>
		<li>Was de delen snel onder stromend leidingwater.</li>
		<li>Kleur de secties blauw door zes keer in 1% lithiumcarbonaat (10 mg / ml) te dopen.</li>
		<li>Was de secties grondig onder stromend leidingwater gedurende 5 minuten om overtollige blauwe vlekken te verwijderen.</li>
		<li>Dompel de secties 10 keer in 1% eosine.</li>
		<li>Was de secties snel onder leidingwater om overtollige vlekken te verwijderen.</li>
		<li>Hydrateer de secties door ze 10 keer te dopen in 100% ethanol. Doe dit twee keer.</li>
		<li>Doop de secties 10 keer in 70% xyleen.</li>
		<li>Doop de secties 10 keer in 100% xyleen.</li>
		<li>Monteer met een coverslip met behulp van dibutylftalaat polystyreen xyleen (DPX) montagemedium.</li>
		<li>Maak foto's met een lichtmicroscoop.</li>
	</ol>
</li>
	<li>IHC etiketteringsprotocol"<ol>
<li>Deparaffiniseer de secties met stap 2.2.</li>
		<li>Plaats de glaasjes in een oplossing met een natriumcitraatbuffer van 10 mM met 0,05% Tween 20 bij pH 6,0 en laat gedurende 2 minuten een antigeen ophalen in een snelkookpan die geautomatiseerd is bij 121 °C.</li>
		<li>Was secties in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 minuten. Doe dit 3 keer.</li>
		<li>Blokkeer de secties met PBS met 0,1% Triton X-100 en 10% normaal geitenserum gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Incubeer secties 's nachts bij 4 °C met primaire antilichamen geconjugeerd aan secundaire antilichamen (Tabel van materialen).</li>
		<li>Was secties in PBS gedurende 5 min. Doe dit 3 keer.</li>
		<li>Kleurkernen met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) gedurende 2 min.</li>
		<li>Was en monteer secties met behulp van een anti-fade reagens.</li>
		<li>Seal coverslips af met nagellak.</li>
		<li>Maak foto's met een confocale laserscanmicroscoop.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Magnetische Luminex test<ol>
<li>Breng 75 μL media van elke put over naar een 96-well-u-bottom plaat op 24 en 72 h.</li>
		<li>Analyseer het celsupernatant voor IL-18, IL-6, IL-8 en vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) na 24 en 72 uur met behulp van Luminex cytokine assay. Volg de instructies van de fabrikant om de test16uit te voeren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facts+and+Figures+Concerning+the+Human+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Webvision-The+Organization+of+the+Retina+and+Visual+System%22%5BJournal%5D)">Facts and Figures Concerning the Human Retina.</a> Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , Internet (2005).</li>
<li>Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+serous+chorioretinopathy%3A+an+update+on+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment.</a> Eye. 24 (12), 1743-1756 (2010).</li>
<li>Buschini, E., Piras, A., Nuzzi, R., Vercelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+related+macular+degeneration+and+drusen%3A+neuroinflammation+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Age related macular degeneration and drusen: neuroinflammation in the retina.</a> Progress in Neurobiology. 95 (1), 14-25 (2011).</li>
<li>Chen, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+regarding+developmental+mechanisms+in+diabetic+retinopathy+in+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine%22%5BJournal%5D)">Current concepts regarding developmental mechanisms in diabetic retinopathy in Taiwan.</a> Biomedicine. 6 (2), (2016).</li>
<li>Kaaja, R., Loukovaara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+retinopathy+in+type+1+diabetic+women+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Diabetes+Reviews%22%5BJournal%5D)">Progression of retinopathy in type 1 diabetic women during pregnancy.</a> Current Diabetes Reviews. 3 (2), 85-93 (2007).</li>
<li>Azizzadeh Pormehr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organotypic+retinal+flat-mount+culture+%28HORFC%29+as+a+model+for+retinitis+pigmentosa11%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Human organotypic retinal flat-mount culture (HORFC) as a model for retinitis pigmentosa11.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (8), 6775-6783 (2018).</li>
<li>Fernandez-Bueno, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+modifications+in+organotypic+culture+of+human+neuroretina%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Time course modifications in organotypic culture of human neuroretina.</a> Experimental Eye Research. 104, 26-38 (2012).</li>
<li>Niyadurupola, N., Sidaway, P., Osborne, A., Broadway, D. C., Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+human+organotypic+retinal+cultures+%28HORCs%29+to+study+retinal+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The development of human organotypic retinal cultures (HORCs) to study retinal neurodegeneration.</a> British Journal of Ophthalmology. 95 (5), 720-726 (2011).</li>
<li>Osborne, A., Hopes, M., Wright, P., Broadway, D. C., Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organotypic+retinal+cultures+%28HORCs%29+as+a+chronic+experimental+model+for+investigation+of+retinal+ganglion+cell+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Human organotypic retinal cultures (HORCs) as a chronic experimental model for investigation of retinal ganglion cell degeneration.</a> Experimental Eye Research. 143, 28-38 (2016).</li>
<li>Caffe, A., Visser, H., Jansen, H., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histotypic+differentiation+of+neonatal+mouse+retina+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture.</a> Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).</li>
<li>Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+organotypic+culture+model+of+adult+mammalian+neurosensory+retina+in+co-culture+with+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 47-58 (2008).</li>
<li>Liu, L., Cheng, S. -H., Jiang, L. -Z., Hansmann, G., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pigmented+epithelium+sustains+cell+growth+and+tissue+differentiation+of+chicken+retinal+explants+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The pigmented epithelium sustains cell growth and tissue differentiation of chicken retinal explants in vitro.</a> Experimental Eye Research. 46 (5), 801-812 (1988).</li>
<li>Kuo, C., Green, C. R., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+hemichannel+block+protects+against+retinal+pigment+epithelial+cell+barrier+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetologica%22%5BJournal%5D)">Connexin43 hemichannel block protects against retinal pigment epithelial cell barrier breakdown.</a> Acta Diabetologica. 57 (1), 13-22 (2020).</li>
<li>Mugisho, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome+pathway+is+amplified+and+perpetuated+in+an+autocrine+manner+through+connexin43+hemichannel+mediated+ATP+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-General+Subjects%22%5BJournal%5D)">The inflammasome pathway is amplified and perpetuated in an autocrine manner through connexin43 hemichannel mediated ATP release.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1862 (3), 385-393 (2018).</li>
<li>Mugisho, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+pro-inflammatory+cytokines+in+non-obese+diabetic+mice%3A+Modelling+signs+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Intravitreal pro-inflammatory cytokines in non-obese diabetic mice: Modelling signs of diabetic retinopathy.</a> PLoS ONE. 13 (8), 0202156(2018).</li>
<li>R&D Systems, I. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex">https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex</a> (2020).</li>
<li>Nakazawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+glial+reactions+and+photoreceptor+degeneration+after+retinal+detachment+in+mice+deficient+in+glial+fibrillary+acidic+protein+and+vimentin%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology%2C+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Attenuated glial reactions and photoreceptor degeneration after retinal detachment in mice deficient in glial fibrillary acidic protein and vimentin.</a> Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (6), 2760-2768 (2007).</li>
<li>Okada, M., Matsumura, M., Ogino, N., Honda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+cells+in+detached+human+retina+express+glial+fibrillary+acidic+protein+and+vimentin%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Müller cells in detached human retina express glial fibrillary acidic protein and vimentin.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 228 (5), 467-474 (1990).</li>
<li>Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+explant+culture%3A+A+platform+to+investigate+human+neuro-retina%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina.</a> Clinical & Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).</li>
<li>Koleva-Georgieva, D. N., Sivkova, N. P., Terzieva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+inflammatory+cytokines+IL-1beta%2C+IL-6%2C+TNF-alpha+and+VEGF+have+influence+on+the+development+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Medica+%28Plovdiv%29%22%5BJournal%5D)">Serum inflammatory cytokines IL-1beta, IL-6, TNF-alpha and VEGF have influence on the development of diabetic retinopathy.</a> Folia Medica (Plovdiv). 53 (2), 44-50 (2011).</li>
<li>Lee, J. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+profile+of+peripheral+blood+in+type+2+diabetes+mellitus+patients+with+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+%26+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">Cytokine profile of peripheral blood in type 2 diabetes mellitus patients with diabetic retinopathy.</a> Annals of Clinical & Laboratory Science. 38 (4), 361-367 (2008).</li>
<li>Chorostowska-Wynimko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+angiomodulatory+activity+of+sera+from+type+2+diabetic+patients+with+background+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%3A+An+Official+Journal+of+the+Polish+Physiological+Society%22%5BJournal%5D)">In vitro angiomodulatory activity of sera from type 2 diabetic patients with background retinopathy.</a> Journal of Physiology and Pharmacology: An Official Journal of the Polish Physiological Society. 56, 65-70 (2005).</li>
<li>Khalifa, R. A., Khalef, N., Moemen, L. A., Labib, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+interleukin+12+%28IL-12%29%2C+interferon-inducible+protein+10+%28IP-10%29+and+Interleukin+18+%28IL-18%29+in+the+angiogenic+activity+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Research+Journal+of+Medicine+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The role interleukin 12 (IL-12), interferon-inducible protein 10 (IP-10) and Interleukin 18 (IL-18) in the angiogenic activity of diabetic retinopathy.</a> Research Journal of Medicine and Medical Sciences. 4, 510-514 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Wang, S., Xia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+intravitreal+inflammatory+cytokines+and+angiogenic+factors+in+proliferative+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Role of intravitreal inflammatory cytokines and angiogenic factors in proliferative diabetic retinopathy.</a> Current Eye Research. 37 (5), 416-420 (2012).</li>
<li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+intravitreous+interleukin-18+correlated+to+vascular+endothelial+growth+factor+in+patients+with+active+proliferative+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Increased intravitreous interleukin-18 correlated to vascular endothelial growth factor in patients with active proliferative diabetic retinopathy.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 252 (8), 1229-1234 (2014).</li>
<li>Louie, H. H., Shome, A., Kuo, C. Y. J., Rupenthal, I. D., Green, C. R., Mugisho, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+hemichannel+block+inhibits+NLRP3+inflammasome+activation+in+a+human+retinal+explant+model+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy.</a> Experimental Eye Research. , (2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

HORC is momenteel het meest klinisch vertaalbare model in preklinisch retinaal onderzoek. In vergelijking met in vitro celkweekmodellen kan HORC de anatomie van het menselijk netvlies in situ beter weergeven, door de dynamische retinale celtypen en hun verbindingen met neuronen, vasculaturen en de extracellulaire omgeving te behouden19. In vergelijking met diermodellen is HORC voordeliger bij het bestuderen van de pathofysiologie van en het ontwerpen van farmaceutische behandelingen voor menselijk...

Het netvlies is een zeer gespecialiseerde oculaire structuur die verantwoordelijk is voor het transformeren van inkomende lichtenergie naar elektrische signalen, die vervolgens door de hersenen worden verwerkt voor visuele waarneming. Het menselijk netvlies bevat een dynamisch bereik van celtypen, sterk georganiseerd in een unieke lamellaire structuur bestaande uit twee synaptische en drie kernlagen1 (Figuur 1). Retinale homeostase wordt ondersteund door de ingewikkelde verbindingen tussen neuroretinale cellen, bloedvaten, zenuwen, bindweefsels en de RPE1. Vanwege de geavanceerde retinale anatomie en fysiologie blijven de mechanismen van veel netvliesaandoeningen nog steeds slecht begrepen2,3,4,5. Om netvliesaandoeningen beter te bestuderen, zijn HORC-modellen ontwikkeld6,7,8,9. In vergelijking met dierstudies en in vitro culturen zijn HORC-modellen voordelig omdat ze de dynamische cellulaire omgeving en complexe neurovasculaire interacties in situ behouden, wat een goed model biedt voor klinische translatie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62046/62046fig01.jpg"> Figuur 1: Posterieure oculaire structuren van het menselijk oog. De retinale lagen van voor naar achteren zijn: zenuwvezellaag (NFL), ganglioncellaag (GCL), binnenste plexiforme laag (IPL), binnenste nucleaire laag (INL), buitenste plexiforme laag (OPL), buitenste nucleaire laag (ONL), fotoreceptor binnenste segment (IS) en fotoreceptor buitenste laag (OS). Cellen in het netvlies omvatten ganglioncellen (blauw), amacrinecellen (geel), bipolaire cellen (rood), horizontale cellen (paars), staaffotoreceptoren (roze) en kegelfotoreceptoren (groen). Het glasvocht bevindt zich anterieur aan het netvlies. De RPE, bruch's membraan, vaatvlies en sclera bevinden zich achter het netvlies. Merk op dat de getoonde afbeelding slechts een schematische weergave is van het netvlies en dat de verhouding tussen cellen en retinale connectiviteit binnen elke laag mogelijk niet indicatief is voor de in vivo setting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62046/62046fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Eerder gekarakteriseerde HORC-protocollen6,7,8,9 hebben betrekking op het scheiden van het netvlies van het onderliggende RPE-vaatvlies en sclera met behulp van een chirurgische trephine. Zonder de ondersteuning van deze onderliggende structuren wordt het doorschijnende netvlies echter dun, moeilijk te hanteren en kunnen hulpmiddelen zoals een tang de integriteit ervan gemakkelijk verstoren. Bovendien is aangetoond dat het isoleren van het netvlies in cultuur zonder de RPE ganglioncelapoptose en fotoreceptordegeneratie10,11,12veroorzaakt. Een alternatief HORC-protocol dat het verlies van retinale integriteit minimaliseert en de in vivo omgeving beter nabootst, zou dus nuttig zijn. Dit is vooral belangrijk bij het bestuderen van retinale ziektemechanismen, omdat lichamelijk letsel tijdens explantbehandeling artefacten kan introduceren. Daarom was het doel van deze studie om een nieuw HORC-model te ontwikkelen dat het RPE-vaatvlies en sclera omvat om de retinale integriteit te beschermen tijdens explantbehandeling en kweek.
Om dit doel te bereiken, werden retinale explantaten "ingeklemd" tussen het resterende glasvocht en het onderliggende RPE-vaatvlies en sclera geëxtraheerd. In de sandwich explanteert het glasvocht het netvlies om netvliesloslating en vouwen te voorkomen, terwijl de taaie, vezelige sclera fungeert als zowel een steiger voor structurele ondersteuning als een contactpunt voor een tang. Bovendien hebben diermodellen aangetoond dat het behouden van de RPE in cultuur retinale degeneratie en gliale proliferatie kan voorkomen, een reactie van Müller-cellen op gevaarsignalen zoals hypoxie en ontsteking10,11,12.
Om het model te karakteriseren, werden sandwich retinale explantaten gekleurd met Hematoxyline en Eosine (H & E) om anatomische structuren te beoordelen en immunohistochemie (IHC) werd uitgevoerd, waarbij explantaten werden gelabeld met terminale deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL, een apoptotische celmarker), glial fibrillair zuur eiwit (GFAP, een retinale ontsteking en Müller-celactiveringsmarker) en vimentine, een marker van Müller-celintegriteit. Om te bepalen of dit model kan worden geïnduceerd om moleculaire ziekteverschijnselen te ontwikkelen, werden de explantaten blootgesteld aan hoge glucose (HG) met pro-inflammatoire cytokines (Cyt), interleukine-1β (IL-1β) en tumornecrosefactor-α (TNF-α), een kweekomgeving waarvan is aangetoond dat deze diabetische retinopathie (DR) nabootst in zowel cel- als dierziektemodellen13,14,15. Luminex-assays werden gebruikt in het DR-model om cytokines te meten die vrijkomen in het kweekmedium.

<table><tbody><tr><td>Disposable Biopsy Punches (5 mm)</td><td>Integra York PA Inc., USA</td><td>21909-142</td><td>Aangeduid als chirurgische trefines in dit artikel</td></tr><tr><td>Human Recombinant IL-1&beta;</td><td>Peprotech, USA</td><td>200-01B</td><td>Werkconcentratie: 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Human Recombinant&nbsp; TNF-a</td><td>Peprotech, USA</td><td>300-01A</td><td>Werkconcentratie: 10 ng/mL</td></tr><tr><td>DAPI (1 &micro;g/mL)</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>#D9542</td><td>Kernkleuring. Werkdilutie 1:1000</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement</td><td>Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA</td><td>10565018</td><td>Dulbecco&rsquo;s Gemodificeerd Eagle Medium nutriëntenmengsel F-12 bevattend een 1&times; antibiotica- en antmycoticamengsel (AA, 100&times; stock)</td></tr><tr><td>Fine Schaartjes - Scherp-Blunt</td><td>Fine Science Tools (F.S.T)</td><td>14028-10</td><td>Tips: Scherp-Blunt, Snijrand: 27mm, Lengte: 10cm, Legering/Materiaal: Roestvrij Staal, Gekarteld: Nee, Tipvorm: Recht</td></tr><tr><td>Graefe Pincetten</td><td>Fine Science Tools (F.S.T)</td><td>11050-10</td><td>Lengte:10cm, Tipvorm: Recht, Tips: Gekarteld, Tipbreedte: 0.8mm, Tipafmetingen: 0.8 x 0.7mm, Legering/Materialen: Roestvrij Staal</td></tr><tr><td>Mouse monoklonaal GFAP-Cy3</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>#C9205</td><td>Primaire antistof geconjugeerd aan Cy3. Werkdilutie 1:1000.</td></tr><tr><td>Mouse monoklonaal Vimentin-Cy3</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>#C9080</td><td>Primaire antistof geconjugeerd aan Cy3. Werkdilutie 1:50.</td></tr><tr><td>Rabbit polyklonaal TUNEL (In Situ Celdood Detectiekit, Fluorescein)</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>#11684795910</td><td>Primaire antistof geconjugeerd aan Fluorescein-dUTP. Werkdilutie 1:10 met enzym-bufferoplossing.</td></tr></tbody></table>

karakterisering van een nieuwe menselijke organotypische retinale cultuurtechniek

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Eerdere menselijke organotypische retinale cultuur (HORC) modellen hebben gebruik gemaakt van losse netvliezen; zonder de structurele ondersteuning die wordt verleend door retinale pigmentepitheel-vaatvlies (RPE-vaatvlies) en sclera, kan de integriteit van het fragiele netvlies gemakkelijk worden aangetast. Het doel van deze studie was om een nieuw HORC-model te ontwikkelen dat het netvlies, RPE-vaatvlies en sclera bevat om de retinale integriteit te behouden bij het kweken van retinale explantaten.
Na het snijden omcirkelend langs de limbus om iris en lens te verwijderen, werden vier diepe incisies gemaakt om de oogschelp plat te maken. In tegenstelling tot eerdere HORC-protocollen werd een trephine gebruikt om niet alleen het netvlies door te snijden, maar ook het RPE-vaatvlies en sclera. De resulterende drielaagse explantaten werden gedurende 72 uur gekweekt. Hematoxyline en Eosine-kleuring (H&E) werd gebruikt om anatomische structuren te beoordelen en retinale explantaten werden verder gekenmerkt door immunohistochemie (IHC) voor apoptose, Müller-celintegriteit en retinale ontsteking. Om de mogelijkheid van ziekte-inductie te bevestigen, werden explantaten blootgesteld aan hoge glucose (HG) en pro-inflammatoire cytokines (Cyt), om diabetische retinopathie (DR) na te bootsen. De Luminex magnetische kraaltest werd gebruikt om DR-gerelateerde cytokines te meten die vrijkomen in het kweekmedium.
H&E-kleuring onthulde verschillende retinale lamellen en compacte kernen in retinale explantaten met het onderliggende RPE-vaatvlies en sclera, terwijl netvliezen zonder de onderliggende structuren een verminderde dikte en ernstig kernverlies vertoonden. IHC-resultaten wezen op afwezigheid van apoptose en retinale ontsteking, evenals behoud van Müller-celintegriteit. De Luminex-assays toonden een significant verhoogde secretie van DR-geassocieerde pro-inflammatoire cytokines in retinale explantaten blootgesteld aan HG + Cyt ten opzichte van baseline niveaus na 24 uur.
We hebben met succes een nieuw HORC-protocol ontwikkeld en gekarakteriseerd waarin de retinale integriteit werd bewaard zonder apoptose of retinale ontsteking. Bovendien suggereert de geïnduceerde secretie van DR-geassocieerde pro-inflammatoire biomarkers bij blootstelling van retinale explantaten aan HG + Cyt dat dit model kan worden gebruikt voor klinisch vertaalbare retinale ziektestudies.

Retinale integriteit werd bewaard in dit HORC-model. Retinale integriteit bleef behouden in de gekweekte sandwich retinale explantaten, maar ging verloren in het netvlies gekweekt zonder aangrenzende structuren. H&E werd uitgevoerd om de structurele integriteit van gesegmenteerde sandwich retinale explantaten na 72 h in cultuur te onderzoeken. De sandwich retinale explantaten vertoonden een behouden integriteit en een duidelijke lamellenstructuur van GCL tot ONL met comp...

Deze studie heeft tot doel een nieuw humaan organotypisch retinale cultuurmodel (HORC) te ontwikkelen dat voorkomt dat de retinale integriteit tijdens explantbehandeling in gevaar komt. Dit wordt bereikt door het netvlies te kweken met het bovenliggende glasvocht en het onderliggende retinale pigmentepitheel-vaatvlies (RPE-vaatvlies) en sclera.

Karakterisering van een nieuwe menselijke organotypische retinale cultuurtechniek

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Deze techniek behoudt alle retinale lagen en celtypen in situ, waardoor het klinisch relevanter is in vergelijking met dier- en in vitro modellen. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het de verstoring van de retinale integriteit minimaliseert tijdens weefselbehandeling, wat essentieel is bij het vergelijken van gezond en ziek netvlies. Retinale ziekten kunnen worden nagebootst door het weefsel onder specifieke omstandigheden te kweken.Dit maakt het mogelijk om nieuwe medicamenteuze therapieën te testen. De ontledings- en monsterverzamelingsprocedures zijn complex. Daarom is visuele demonstratie van cruciaal belang om de lezers te helpen het geschreven protocol te begrijpen en de procedure met succes uit te voeren.De procedure wordt gedemonstreerd door Charisse Kuo, een tweedejaars promovendus uit mijn laboratorium. Bereid het kweekmedium met Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 en een eenmalig mengsel van antibiotica en antimycotica. Plaats eerst 500 microliter medium in een plaat met 24 putten en breng deze in evenwicht in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Het gereed hebben van de media voorafgaand aan explantextractie voorkomt ontwrichting van het netvlies bij latere toevoeging. Voor het extraheren van retinale explantaten, begin met het plaatsen van de oogschelp op een petrischaal met de iris en lens naar boven gericht en de ONH die contact maakt met de petrischaal. Houd de oogschelp stabiel bij de limbus met behulp van een tang en maak de iris en lens los door kleine sneden te maken langs de buitenrand van de limbus.Verwijder de iris en lens voorzichtig en zorg ervoor dat u het netvlies niet verstoort. Identificeer de ONH met behulp van een helderwitte lichtbron en insnijs in de vier kwadranten naar de ONH die de petrischaal draait voor eenvoudiger gebruik. Verdeel en druk de oogschelp voorzichtig plat.Breng de tang aan op de sclera in plaats van op het netvlies om te voorkomen dat de integriteit van het netvlies wordt verstoord. Verwijder de plaat met de bereide media uit de couveuse. Plaats een chirurgische trephine op het netvlies in een gebied zonder netvliesplooien en druk hard om de sclera binnen te dringen, wat een krakend geluid zou moeten genereren als je door de petrischaal breekt.Draai de trephine om ervoor te zorgen dat de sclera volledig is doordrongen, zodat de retinale explant nu gescheiden is van de rest van het monster. Breng de tang aan op de sclera en breng de sandwich retinale explant over naar het kweekmedium. Kweek de verzamelde sandwich retinale explanteert bij 37 graden Celsius gedurende maximaal 72 uur in een bevochtigde incubator van 5% koolstofdioxide.Hematoxyline- en eosinekleuring toonden aan dat de sandwich retinale explantaten de integriteit en een duidelijke lamellenstructuur van de GCL tot de ONL met compacte kernen in de binnenste en buitenste nucleaire lagen behielden. Verstoorde retinale integriteit werd gevonden aan de randen van hetzelfde monster waar het netvlies zich had losgemaakt van het onderliggende RPE-vaatvlies en sclera met verminderde retinale dikte en verlies van kernen in de INL en ONL. Er werden geen TUNEL-positieve celkernen, die cellulaire apoptose markeren, gevonden in retinale explantaten gekweekt in basale omstandigheden, wat aanhoudende cellulaire vitaliteit aantoont, zelfs na 72 uur.GFAP-etikettering was beperkt tot de GCL en de IPL zonder gliale fibrose, een teken van pathologie dat zou worden geïdentificeerd als uitgebreide expressie van GFAP in de ONL. Vimentine kwam sterk tot expressie van de ganglioncellaag tot de buitenste nucleaire laag, met behoud van Mueller-celintegriteit zoals te zien in normale retinale weefsels. Luminex magnetische assay toonde aan dat de IL-18, VEGF, IL-6 en IL-8 niveaus significant boven baseline stegen in de sandwich retinale explantculturen in hoge glucose en pro-inflammatoire cytokines na 24 uur.Na 72 uur bleven de IL-18- en VEGF-niveaus significant verhoogd, maar er werd geen significant verschil gevonden in IL-6- en IL-8-niveaus. Laat bij het uitvoeren van deze procedure voldoende restant glasvocht achter, dat het netvlies zal verzwaren zodat het niet loskomt van het RP-vaatvlies en in de kweekmedia zweeft. Het gekweekte netvlies kan verder worden gekarakteriseerd met behulp van immunohistochemie en histologie, terwijl de inflammatoire cytokines die vrijkomen in het gekweekte medium kunnen worden gemeten met behulp van een Luminex magnetische test.Dit model is klinisch beter vertaalbaar in vergelijking met dier- en in vitro modellen, waardoor het meer geschikt is voor het testen van de werkzaamheid van nieuwe therapeutische geneesmiddelen voor netvliesaandoeningen.

characterization-novel-human-organotypic-retinal-culture

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Dit artikel toont de dissectie en incubatie van konijnen netvlies en deeltjes-gemedieerde gen-overdracht van plasmiden die coderen voor GFP of een verscheidenheid van subcellulaire markers in de retinale ganglioncellen.

Organotypische Cultuur van Adult Rabbit Retina

Deze video artikel demonstreert de oprichting van organotypische netvlies wholemount culturen en een Cytospin procedure voor de analyse van exogeen geïnduceerde effecten. Organotypische netvlies wholemount culturen na te bootsen van...

In vivo-achtige organotypische Murine netvlies Wholemount Cultuur

Hier beschrijven we een kosteneffectieve techniek voor organotypische cultuur van volwassen varkens netvlies gedurende zeven dagen. In het kort werd een steriel filtreerpapier wordt gebruikt om de neurale netvlies lift af van de RPE en plaats fotoreceptor kant naar boven op een insert opgevoed door een op maat gemaakte stand.

Organotypische Cultuur van Full-dikte van volwassen varkens Retina

Het protocol beschrijft organotypische explants van het neuro-netvliesvan muizen , gekweekt samen met het retinale pigmentepitheel (RPE), in R16 gedefinieerd medium, vrij van serum en antibiotica. Deze methode is relatief eenvoudig uit te voeren, goedkoper en tijdrovend in vergelijking met in vivo experimenten en kan worden aangepast aan tal van experimentele toepassingen.

Langdurige, serumvrije teelt van organotypische muis retina explants met intact retinale pigmentepitheel

Hier presenteren we een stapsgewijs protocol om volwassen menselijke retinale organoïden te genereren en deze te gebruiken in een fotoreceptortoxiciteitstest om farmaceutische kandidaten te identificeren voor de leeftijdsgebonden retinale degeneratieve ziekte maculaire teleangiëctasieën type 2 (MacTel).

Toxiciteitsscreenings in humane retinale organoïden voor farmaceutische ontdekking

Met behulp van een zelforganiserende methode ontwikkelen we met de toevoeging van COCO een protocol dat de generatie van fotoreceptoren aanzienlijk zou kunnen verhogen.

Gerichte inductie van retinale organoïden uit menselijke pluripotente stamcellen

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd retinale organoïde inductiesysteem, dat geschikt is voor verschillende menselijke pluripotente stamcellijnen om retinale weefsels met een hoge reproduceerbaarheid en efficiëntie te genereren.

Retinale organoïde inductiesysteem voor afleiding van 3D retinale weefsels van menselijke pluripotente stamcellen

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het differentiëren van hiPSC's in oogveldclusters en het genereren van neuro-retinale organoïden met behulp van vereenvoudigde kweekomstandigheden waarbij zowel adherente als suspensiecultuursystemen betrokken zijn. Andere oculaire celtypen, zoals de RPE en het hoornvliesepitheel, kunnen ook worden geïsoleerd uit volwassen oogvelden in retinale culturen.

Generatie van retinale organoïden uit gezonde en retinale ziekte-specifieke door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Dit protocol biedt een geoptimaliseerde en uitgebreide voorbereidingsprocedure voor retinale organoïdemonsters voor transmissie-elektronenmicroscopie. Het is geschikt voor toepassingen waarbij synapsen in volwassen retinale organoïden worden geanalyseerd.

Voorbereiding van retinale organoïdemonsters voor transmissie-elektronenmicroscopie

Dit protocol combineert optische klaring en immunolabeling voor confocale beeldvorming van het hele netvlies van de hele montuur. Het behoudt de 3D-structuur, waardoor gedetailleerde visualisatie van belangrijke neuronale paden mogelijk is, waardoor de studie van retinale rijping, ruimtelijke organisatie en de mogelijke toepassingen ervan in ziektemodellering en gepersonaliseerde geneeskunde worden verbeterd.

Visualisatie van retinale organoïden voor de hele berg met cellulaire resolutie

Ontdek een nieuwe menselijke organotypische retinale cultuurtechniek met behoud van alle retinale lagen en ondersteunende weefsels. Deze methode minimaliseert structurele schade en maakt klinisch relevant ziekteonderzoek en testen van nieuwe therapeutische middelen mogelijk.

Karakterisering van een nieuwe menselijke organotypische retinale cultuurtechniek

Meer video's verkennen