Registratie van elektrische stromen over het plasmamembraan van zaadcellen van zoogdieren

Het registreren van de elektrische activiteit van de zaadcel met behulp van de patch-clamp-techniek is van cruciaal belang geweest bij de identificatie van verschillende zaadionkanalen en het begrijpen van de elektrofysiologie van zaadcellen op moleculair niveau. Deze methode blinkt uit in het meten van elektrofysiologische en farmacologische vingerafdrukken van ionenkanalen en is het meest betrouwbare hulpmiddel voor identificatie van ionenkanalen. Gezien het fysiologische belang van ionkanalen en elektrogene transporteurs voor mannelijke vruchtbaarheid, is deze techniek een krachtig hulpmiddel om bepaalde spermaafwijkingen die tot onvruchtbaarheid leiden te begrijpen.

Voor micropipetfabricage begin je met borosilicaatglazen capillairen met een buitendiameter van 1,5 millimeter, een binnendiameter van 0,86 millimeter en een interne filament. Zorg ervoor dat de binnendiameter van de pipettip ongeveer twee micrometer is vóór het polijsten en wordt teruggebracht tot 0,5 micrometer na correct polijsten. Bouw een agarbrug om de omgeving rond de referentie-elektrode stabiel te houden.

Maak een L-vormige glazen capillair door deze onder een klein bunsenbrandervuur te buigen en te laten afkoelen. Maak een oplossing van 1% agarose in één molaire kaliumchloride en verhit deze in een magnetron totdat de agarose smelt en de oplossing transparant wordt. Vul voorzichtig de L-vormige glazen capillair met de agarose om luchtbellen te voorkomen en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.

Of dompel de L-vormige glascapillair onder in de gesmolten agarose. Draai de container meerdere keren rond en verwarm hem opnieuw in de magnetron tot de agarose kookt, wat luchtbellen uit de agarbrug zal verstoten. Open het onderste buikgebied van de muis met een schaar en verwijder beide epididymiden.

Plaats ze in een 35-millimeter celkweekschaal gevuld met een oplossing met veel zoutoplossing of HS die is voorverwarmd tot kamertemperatuur. Breng de epididymiden over in een nieuwe celkweekschaal met HS-oplossing en verwijder grondig al het resterende vet. Splits de epididymiden in caput, corpus en cauda met een scalpelblad nummer 15.

Breng het corpus van elke epididymis over in een nieuwe celkweekschotel met HS-oplossing. Maak meerdere incisies in het geïsoleerde deel van de epididymis met een puntige schaal nummer 11. Breng de delen van de epididymiden met meerdere incisies over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met 1,5 milliliter HS-oplossing.

Schud kort zaadcellen uit de bijbal in de oplossing met behulp van Superfine Dumont Type 5A pincet. Gooi daarna de epididymiden weg en laat de tube 10 minuten op kamertemperatuur staan. Wacht tot de vaste stof naar de bodem van de buis is gezakt.

Vervolgens doe je het supernatant over in een andere microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Vind de geschikte zaadcel met een cytoplasmatische druppel met 600x vergroting. Zorg ervoor dat de cytoplasmatische druppel ovaal is en een licht verlengde, spilachtige vorm heeft.

Kies een spermatozoon dat beweeglijk is met het hoofd bevestigd aan de deksel, zodat de zaadcel gedeeltelijk gefixeerd is, maar de cytoplasmatische druppel en de rest van de flagellan blijven bewegen met flagellaslagen. Zorg ervoor dat de kop van het sperma losjes aan de dekplaat vastzit. Na visuele selectie van een zaadcel met de juiste morfologie, vul je de micropipet met de pipetoplossing en bevestig je deze in de pipethouder.

Om de pipettip schoon te houden van vuil, oefen je positieve druk uit op de pipet met behulp van de U-buisvormige constructie. Laat de pipet zakken en dompel de punt onder in de badoplossing. Om de cel duidelijk te visualiseren, plaats je de punt van de pipet boven de cytoplasmatische druppel zodat de opening van de punt diagonaal naar de druppel toe ligt.

Laat de punt van de pipet snel naar de druppel zakken zodat ze in hetzelfde brandpuntsvlak liggen. Zodra de punt van de pipet de druppel raakt, oefen je negatieve druk uit op de pipet om een deel van de druppel naar de punt te bewegen en een giga-ohm afdichting te vormen. Haal dan het spermatozoon van het dekmantel.

Compenseer de transiëntie van de strooiende capaciteit met behulp van de compensatiemodus van de versterker voordat je overgaat naar de whole cell-modus. Voer een inbouw uit en overgang naar de whole cell-modus door één milliseconde, geleidelijk toenemende spanningspulsen toe te passen in combinatie met een zeer lichte zuiging. Na het aanbrengen van elke inloopspanningspuls start je het membraantestinstrument om te controleren of er een grotere capaciteitstransiëntie optreedt.

Pas de grotere capaciteitstransiëntie aan om de capaciteit van de hele cel en de toegangsweerstand te bepalen. Na een succesvolle inbraak wordt doorgegaan met de geplande patchclamp-experimenten met volledige cellen, zoals het toepassen van verschillende badoplossingen met verschillende verbindingen of het meten van kanaalactiviteiten met behulp van spanningsstap- of spanningsrampprotocollen. CatSper-opnames werden uitgevoerd door een hoogresistente afdichting te vestigen tussen de patchpipet en het zoogdierspermatozoon bij de cytoplasmatische druppel.

De dichtheden van caesium hele cellen CatSper-stromen werden geregistreerd van caudale wildtype neuron spermacellen en CatSper-deficiënte caudale neuron spermacellen. Spermacellen van verschillende soorten zijn divers in hun morfologie en interne regulerende paden. Primaten- en menselijke spermatozoa vertoonden vergelijkbare eigenschappen en regulatie van het CatSper-kanaal.

Interessant genoeg lijkt de activatie van progesteron door CatSper uniek te zijn voor primatenzaadcellen. Zwijn-, stier- en knaagdierenzaadcellen vertoonden geen progesterongestimuleerde verandering van hun CatSper-stromen. Bij stier- en everzwijnspermatozoa lag zelfs de basale CatSper-kanaalactiviteit onder detecteerbare grenzen, wat suggereert dat calciuminstroom en daaruit voortvloeiende hyperactivatie worden veroorzaakt door andere kanalen of transporters, of dat een andere natuurlijke stimulator nodig is voor de activatie van hun CatSper-kanalen.

De kleine, gladde, uniforme en niet overmatig gezwollen cytoplasmatische druppeltjes zijn het meest geschikt voor patch-clamp. Je moet die kleine, eenzijdige, opgeblazen en volledig transparante cytoplasmatische druppeltjes vermijden, omdat die leiden tot een zwakke of geen afdichting. Deze techniek maakt het mogelijk om specifieke luchtkanalen in hun natuurlijke expressiesysteem gedetailleerd te bestuderen, en het succes hangt af van hoogwaardige variabele zaadcellen, zuivere regio's, basis intellectuele fysiologievaardigheden, geduld en vooral doorzettingsvermogen.